貴州產(chǎn)油麻血藤總黃酮含量測(cè)定方法的建立與研究

楊從武，羅九鳳

(1黔東南苗族侗族自治州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 凱里 556011；2貴州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院(原418醫(yī)院)，貴州 凱里 556000)

油麻血藤是我省少數(shù)民族藥材，為豆科植物常春油麻藤M(fèi)ucunasempervirensHemsl.的干燥藤莖，全年均可采收，除去枝葉切段或片，曬干。常春油麻藤也被命名為棉麻藤、牛馬藤、常綠油麻藤[1]。該藥材絕大部分生長(zhǎng)于我國(guó)34.5° N以南，并且在海拔300～3000 m地區(qū)分布較為廣泛，重點(diǎn)涵蓋了貴州、甘肅等地區(qū)[2]，在貴州重點(diǎn)分布于黔東南州、黔西南州和黔南州等地。油麻血藤?gòu)目陀^的角度而言可劃分為雞血藤，能夠發(fā)揮補(bǔ)血的效果，有效促進(jìn)血液循環(huán)，對(duì)多種病癥都具有適用性，其中比較主要的包括風(fēng)濕疼痛、血虛等，然而和雞血藤進(jìn)行對(duì)比，油麻血藤更加偏向于滋補(bǔ)強(qiáng)壯，而且具有更為理想的口感[3]。成分指標(biāo)為：脂肪酸占1%～10%[4]、總黃酮類占12.43%[5]、酚類、蛋白質(zhì)[6]、七個(gè)成分一致的揮發(fā)油(比較主要的包括3-辛醇、β-紫羅蘭酮等)[7]。目前載于《貴州省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003版中[8]，其只有性狀鑒定內(nèi)容，不能更好地控制其質(zhì)量，因此，還有待于提高和完善。

1 材料與儀器

1.1 藥材

三批樣品分別采自貴州凱里、興義、荔波。經(jīng)鑒定為豆科植物常春油麻藤M(fèi)ucunasempervirensHemsl.的干燥藤莖，相關(guān)的憑證標(biāo)本儲(chǔ)存在貴州中醫(yī)藥大學(xué)的生藥實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器

紫外光度計(jì)UV-2600、UV-2700；超聲波清洗器(219J0340，500 W，53 kHz)；電熱恒溫水浴鍋單列六 5L(DK-98-ⅡA型)；500 克搖擺式高速中藥粉粹機(jī)；XPE205型電子天平；鼓風(fēng)干燥箱。

1.3 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(中檢院，92.4%(UV)；10080-201811)；甲醇(川東化工試劑公司，AR)；95%乙醇(西隴科學(xué)公司，AR)；乙酸乙酯(川東化工試劑公司，AR)；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，均為AR。

2 方法與分析

2.1 干燥油麻血藤樣品的制備

取凱里、興義、荔波產(chǎn)油麻血藤試樣1000 g，切厚片，于干燥箱50 ℃下烘干，放冷至室溫，打粉過(guò)四號(hào)篩，密封存儲(chǔ)于廣口瓶中，備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.01175 g(蘆丁)，用85%甲醇適量，超聲充分溶解為0.21714 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

取2.2項(xiàng)下溶液3.00 mL，將其置于25 mL量瓶中，照2.4項(xiàng)下方法，從“加水至6 mL”起依法操作，照中國(guó)藥典2015年版四部0401[11]，在760～200 nm區(qū)間，記錄圖譜，確定最大吸收波長(zhǎng)為510 nm，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品溶液光譜圖Fig.1 Spectrogram of the reference solution

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

量取2.2項(xiàng)下溶液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL，各置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min[9]，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min[9]，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min[9]，即得。立即在 510 nm 處測(cè)定各個(gè)溶液的吸光度，其吸光度分別為：0.106，0.219，0.334，0.458，0.580，0.703，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。其回歸方程為Y=0.01379X-0.01920，r=0.99966，在測(cè)定濃度為8.686～52.114 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可以進(jìn)行定量分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of rutin

2.5 樣品溶液的配制

精密稱取荔波產(chǎn)油麻血藤粉末約0.25 g，將其置具塞錐形瓶中，精密加入85%甲醇100 mL，稱重，超聲30 min，冷卻再稱重，用85%甲醇進(jìn)行補(bǔ)重，搖勻?yàn)V過(guò)，量取續(xù)濾液5.00 mL置25 mL 量瓶中，照2.4項(xiàng)下方法，自“加水至6 mL”起依法操作，并測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的重量。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取荔波產(chǎn)油麻血藤各約0.25 g，共6份，照2.5項(xiàng)下依法操作，計(jì)算總黃酮量，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，RSD=0.96%(n=6)<1.5%，該方法的重復(fù)性良好。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Repeatability test results

2.6.2 中間精密度試驗(yàn)

在與重復(fù)性不同的實(shí)驗(yàn)時(shí)間(不是同一天)，精密稱取荔波產(chǎn)油麻血藤3份，各約0.25 g，照2.5項(xiàng)下方法操作，計(jì)算總黃酮量，結(jié)果見(jiàn)表2，RSD=0.53%<3.0%，該方法的精密度良好。

表2 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Intermediate precision test results

2.6.3 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取與重復(fù)性同一批荔波產(chǎn)油麻血藤約0.15 g，6份，添加與蘆丁本底含量相當(dāng)?shù)膶?duì)照品，照2.5項(xiàng)下方法操作，計(jì)算總黃酮量，結(jié)果見(jiàn)表3，平均回收率達(dá)到99.97%，RSD<3%，符合檢測(cè)要求。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Spiked recovery rate test results

回收率%=( C-A )/B×100%

式中，A指代的是本底含量；B 指代的是加入對(duì)照品量；C 指代的是實(shí)測(cè)值。

2.6.4 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取荔波產(chǎn)油麻血藤約0.25 g，照2.5項(xiàng)下方法操作，先后在0 min、15 min、30 min時(shí)測(cè)定。得到的數(shù)據(jù)見(jiàn)表4，RSD<3%，這說(shuō)明該溶液在半小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性十分理想。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Stability test results

2.6.5 不同型號(hào)儀器試驗(yàn)

精密稱取荔波產(chǎn)油麻血藤3份，各約0.25 g，照2.5項(xiàng)下方法操作，選取2個(gè)紫外分光光度計(jì)，其型號(hào)必須有所區(qū)別，此后進(jìn)行測(cè)定操作，得到的結(jié)果見(jiàn)表5，RSD<3%，表明不同的紫外分光光度計(jì)檢測(cè)分析對(duì)總黃酮的測(cè)定無(wú)影響。

表5 不同儀器測(cè)定結(jié)果Tab.5 Measurement results by different instruments

3 不同產(chǎn)地油麻血藤中總黃酮含量比較

精密稱取凱里、興義、荔波產(chǎn)油麻血藤各2份，各約0.25 g，照2.5項(xiàng)下方法操作，計(jì)算總黃酮量，并對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，貴州凱里油麻血藤中總黃酮含量為8.736%，貴州荔波油麻血藤中總黃酮含量為7.881%，貴州興義油麻血藤中總黃酮含量為8.915%。

表6 含量測(cè)定結(jié)果Tab.6 Content determination results

4 結(jié)果

油麻血藤總黃酮以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)計(jì)，通過(guò)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色，使黃酮紫外吸收紅移，在510 nm 波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。這種方法可行性高，精確度非常理想，穩(wěn)定性良好，滿足樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)，通過(guò)此方法能很好地測(cè)得不同產(chǎn)地的油麻血藤中總黃酮的含量，其中貴州興義的油麻血藤總黃酮含量最高，為8.915%，貴州荔波的油麻血藤總黃酮含量最低，為7.881%。該方法可以用于貴州產(chǎn)油麻血藤質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)。