基于GEO數(shù)據(jù)庫分析糖尿病心肌病的差異表達基因

陳嘉敏，李 瑩，，吳會會，劉 鵬，鄭 燕，，蘇國海

1山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院 濟南市中心醫(yī)院?？妻D(zhuǎn)化研究中心，濟南 250013

2山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬中心醫(yī)院?？妻D(zhuǎn)化研究中心，濟南 250013

糖尿病心肌病是指在沒有冠狀動脈疾病、高血壓和心臟瓣膜病的情況下發(fā)生心力衰竭的病理生理疾病[1]。歐洲及美國的多項回顧性研究顯示糖尿病增加了心力衰竭患者的住院率和死亡風(fēng)險[2]，在我國，糖尿病導(dǎo)致的心力衰竭發(fā)病率在1993至2007 年從12.3%增加到22.1%，糖尿病是除冠心病、高血壓外導(dǎo)致心力衰竭最主要的原因[3]。2017至2018年中國心力衰竭住院患者的橫斷面研究顯示心力衰竭住院患者合并糖尿病的比例高達29.2%[4]，在包括中國人在內(nèi)的多種族的研究顯示，糖尿病增加了心力衰竭患者的發(fā)病率和死亡率[5]，近30年來我國糖尿病的患病人數(shù)逐年上漲[6]，使糖尿病心肌病的防治工作面臨更加嚴峻的挑戰(zhàn)。研究表明單純將糖尿病患者的血糖恢復(fù)到基線水平并不能降低心力衰竭的發(fā)病率和死亡率[7]，但是新型降糖藥鈉葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2抑制劑如達格列凈可以使心力衰竭合并糖尿病患者的心力衰竭惡化風(fēng)險及因心血管事件死亡的風(fēng)險降低[8]，心血管藥物沙庫巴曲-纈沙坦也可使糖尿病合并心力衰竭的患者獲益[9]。多種機制參與了糖尿病心肌病的進展：(1)心肌細胞胰島素信號通路受損：正常情況下，磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B信號通路激活，刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(glucose transporter type 4，GLUT4)向質(zhì)膜募集，促進葡萄糖進入心臟細胞。胰島素信號通路受損時，GLUT4表達下降，心臟攝取葡萄糖的能力下降。(2)高血糖和糖毒性：高血糖可導(dǎo)致糖基化終末產(chǎn)物增加，糖基化終末產(chǎn)物是長壽命蛋白被糖化的產(chǎn)物，糖基化終末產(chǎn)物沉積使結(jié)締組織交聯(lián)、纖維化，導(dǎo)致心臟順應(yīng)性降低、舒張功能障礙。(3)脂肪酸利用增加和脂毒性：糖尿病患者葡萄糖利用下降，參與脂肪酸β氧化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)α表達增加促進脂肪酸的攝取和利用，脂質(zhì)和脂質(zhì)代謝產(chǎn)物的增加導(dǎo)致胰島素抵抗和心臟纖維化。(4)氧化應(yīng)激：脂肪酸的β氧化促進活性氧的產(chǎn)生和心臟的氧化應(yīng)激。(5)Ca2+處理受損：高血糖狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激使Ca2+處理異常，導(dǎo)致心肌細胞興奮性收縮偶聯(lián)障礙，心臟收縮能力下降[1，10- 12]。本研究旨在通過對現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的再分析，尋找導(dǎo)致糖尿病心肌病的關(guān)鍵基因，對糖尿病心肌病的發(fā)病機制有更深一步的研究。

材料和方法

GEO數(shù)據(jù)庫選取基因集進行差異基因分析從GEO數(shù)據(jù)庫中選取與糖尿病心肌病研究相關(guān)的基因芯片。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)種屬：Rattus norvegicus；(2)同時具備正常心臟組織和糖尿病心肌病心臟組織。經(jīng)過檢索GSE4745[13](https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE4745)和GSE5606[14](https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE5606)兩個基因集符合條件。GSE4745基因集的芯片來自GPL85(Affymetrix Rat Genome U34 Array)平臺，數(shù)據(jù)集中包括正常組雄性大鼠心室組織和注射鏈脲佐菌素后3、28、42 d后糖尿病組雄性大鼠心室組織共24 份，注射鏈脲佐菌素42 d后的糖尿病組大鼠心室組織以及其對照組樣本共8 份用于差異表達基因的分析。GSE5606基因集的芯片來自GPL1355(Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array)平臺，數(shù)據(jù)集中包括注射鏈脲佐菌素16周的雄性大鼠正常組和糖尿病組心室組織樣本共14 份，全部用于差異基因的分析。GEO數(shù)據(jù)庫的在線分析工具GEO2R用于差異基因的分析，以P≤0.05，|Log|差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)|≥1為標(biāo)準(zhǔn)進行篩選，在R[15](3.6.3版本)中利用ggplot2[16]包(3.3.2版本)繪制差異基因的火山圖，在線韋恩圖繪制工具(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制韋恩圖，尋找兩個數(shù)據(jù)集中共同表達的上調(diào)和下調(diào)差異基因。

富集分析將差異表達基因利用R中的AnnotationHub包[17]、org.Rn.eg.db包[18]進行基因ID的轉(zhuǎn)換，clusterProfile包[19]進行基因本體論(gene ontology，GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genome，KEGG)富集分析，ggplot2繪圖，矯正后P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)是一種計算方法，用于確定一組預(yù)先確定的基因集在兩種生物狀態(tài)之間是否顯示出差異有統(tǒng)計學(xué)意義，GSEA軟件[20- 21](版本4.1.0，https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/datasets.jsp)用于基因集富集分析，依據(jù)GSEA官網(wǎng)提供的文件格式[Data formats-GeneSetEnrichmentAnalysisWiki (broadinstitute.org)]構(gòu)建文件進行GSEA，基因表達數(shù)據(jù)被分為正常和糖尿心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)兩種生物狀態(tài)，PPAR信號通路基因集和脂肪酸代謝基因集[GSEA|MSigDB(gsea-msigdb.org)]作為參考基因集用于富集分析，名義P<0.05、錯誤發(fā)現(xiàn)率即q<0.25、標(biāo)準(zhǔn)化富集評分絕對值>1被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。

蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用STRING(https：//string-db.org)進行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，將差異表達基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，選擇Rattus norvegicus進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，將結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出。將互作網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點出現(xiàn)的次數(shù)進行統(tǒng)計并排序，將STRING導(dǎo)出的TSV文件以“Network”方式導(dǎo)入Cytoscape，將排序文件以“Table”方式導(dǎo)入，將節(jié)點大小及顏色以“Mapping Type”方式依據(jù)節(jié)點出現(xiàn)次數(shù)多少進行顏色填充和節(jié)點大小的調(diào)整。利用插件Cytohubba的最大集團中心算法計算出排名前10的關(guān)鍵基因，以得分排序并調(diào)整節(jié)點大小繪圖。

原代心肌細胞的提取取出生3 d內(nèi)的Wistar大鼠乳鼠，75%的酒精將乳鼠短暫浸泡消毒，眼科剪剪開乳鼠前胸，鑷子取出心臟置于含有1%青鏈霉素的Hank’s平衡鹽溶液(貨號：CC106，中科邁晨科技有限公司)中，剪碎心臟后在含有200 U/ml 膠原酶(貨號：LS004176，美國Worthington)的Hank’s平衡鹽溶液中進行消化，預(yù)消化5 min后棄去膠原酶，重新添加膠原酶后消化1 h，取上清加入等量的心肌細胞培養(yǎng)基終止消化并離心取沉淀，余下組織再次進行消化，重復(fù)以上步驟直至無組織團塊，將離心取得的沉淀用培養(yǎng)基吹起后置于培養(yǎng)瓶中差速貼壁80 min后除去成纖維細胞，心肌細胞種于0.3%明膠(貨號：9000708，默克公司)包被后的6孔板中。

心肌細胞培養(yǎng)原代心肌細胞貼壁18 h后換為含有100 μmol/L的5-溴脫氧尿嘧啶核苷(貨號：S7918，Selleck)的心肌細胞培養(yǎng)基中以抑制成纖維細胞的生長，心肌細胞培養(yǎng)基為8%的馬血清(貨號：16050122，Gibco)、5%的胎牛血清(貨號：10270106，Gibco)、1%的青鏈霉素和64%的低糖5.5 mmol/L DMEM的低糖培養(yǎng)基(貨號：CM1004，中科邁晨科技有限公司)構(gòu)成。原代心肌細胞在含有Brdu的低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后正常組更換為不含Brdu的低糖培養(yǎng)基，實驗組更換為不含Brdu的25 mmol/L高糖培養(yǎng)基(貨號：C11995500BT，Gibco)，72 h后提取RNA。

實時熒光定量PCR從6孔板收集貼壁心肌細胞，用Trizol(貨號：AG21102，艾科瑞生物工程有限公司)提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：AG11711，艾科瑞生物工程有限公司)反轉(zhuǎn)錄后利用SYBERGeeen qPCR試劑盒(貨號：AG11718，艾科瑞生物工程有限公司)進行實時熒光定量PCR，每次實驗設(shè)置3 個復(fù)孔，實驗重復(fù)3 次。引物利用美國國家生物技術(shù)信息中心的Primer-BLAST工具設(shè)計，F(xiàn)ASTA序列從美國國家生物技術(shù)信息中心的基因數(shù)據(jù)庫獲取，產(chǎn)物長度限制在100～300 bp，溶解溫度設(shè)定為57～63 ℃，以β-actin作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

統(tǒng)計學(xué)處理PCR以2-△△Ct法計算目的基因表達水平，利用GraphPad(8.0.1)進行統(tǒng)計分析，采用獨立樣本t檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 關(guān)鍵基因的引物序列

結(jié) 果

GEO2R與韋恩圖分析結(jié)果在GEO數(shù)據(jù)庫中選擇數(shù)據(jù)集GSE4745和GSE5606作為研究對象，利用GEO2R進行分析后，以|LogFC|≥1，P≤0.05為閾值篩選差異基因并利用ggplot2繪制火山圖，其中LogFC≥1，P≤0.05為上調(diào)基因，LogFC≤-1，P≤0.05為下調(diào)基因。在GSE4745中以GSM107428、GSM107429、GSM107430、GSM107431作為對照組，GSM107432、GSM107433、GSM107434、GSM107435作為糖尿病心肌病組，經(jīng)GEO2R分析、ggplot2繪圖后顯示上調(diào)基因164個、下調(diào)基因164個(圖1A)。在GSE5606中以GSM130860、GSM130861、GSM130862、GSM130863、GSM130864、GSM130865、GSM130866作為對照組，以GSM130867、GSM130868、GSM130869、GSM130870、GSM130871、GSM130872、GSM130873作為糖尿病心肌病組，經(jīng)GEO2R分析、ggplot2繪圖顯示上調(diào)基因286個，下調(diào)基因135個(圖1B)。在線韋恩圖繪制工具分析后顯示共同表達的上調(diào)差異基因共35個(圖1C)，共同表達的下調(diào)差異基因共15個(圖1D)。GSE5606和GSE4745基因集中共同表達的差異基因的LogFC值和P值顯示，GSE5606和GSE4745基因集中共同表達的上調(diào)基因共35個，共同表達的下調(diào)基因共15個(表2)。

基因富集分析結(jié)果在R中利用clusterProfile包，將50個差異基因進行GO和KEGG富集，矯正后P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。這50個差異基因在GO富集中的分子功能、生物學(xué)過程有明顯富集，而在細胞組分無富集。在生物學(xué)過程中，這50個差異基因在脂肪酸代謝過程、小分子分解過程、嘌呤核苷酸代謝過程、脂質(zhì)修飾等生物過程中明顯富集(圖2A)。在分子功能中，差異基因主要在棕櫚酰輔酶A水解酶活性、?；o酶A水解酶活性、輔酶A水解酶活性、脂肪酸衍生物的結(jié)合、硫酯水解酶活性這些條目中明顯富集(圖2B)。在KEGG，富集主要集中在PPAR信號通路、脂肪酸的延伸、不飽和脂肪酸的生物合成(圖2C)。對脂肪酸代謝基因集和PPAR信號通路基因集進行GSEA富集顯示，糖尿病組在脂肪酸代謝和PPAR信號通路的基因集中明顯富集(圖3)。

FC：差異倍數(shù)

STRING在線數(shù)據(jù)庫蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果利用STRING在線數(shù)據(jù)庫(https：//www.string-db.org/)將GSE4745和GSE5606數(shù)據(jù)集共同表達的差異基因構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape繪制出蛋白質(zhì)的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(圖4A)。利用插件Cytohubba的最大集團中心算法計算出排名前10的關(guān)鍵基因并繪制關(guān)鍵基因的互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖4B)。等級評分見表3。

關(guān)鍵基因在原代大鼠心肌細胞中的驗證結(jié)果原代心肌細胞對照組在5.5 mmol/L的葡萄糖低糖環(huán)境、實驗組在25 mmol/L的葡萄糖高糖環(huán)境中培養(yǎng)72 h后，提取RNA進行實時熒光定量PCR。t檢驗結(jié)果顯示，Pdk4(t=23.520，P<0.001)、Hmgcs2(t=10.700，P=0.004)、Ucp3(t=5.184，P=0.035)、Acsl6(t=6.213，P=0.003)、Slc2a4(t=19.300，P=0.005)具有統(tǒng)計學(xué)意義且與表2的分析結(jié)果相符，其中Pdk4、Hmgcs2、Ucp3在高糖刺激后表達增加，Acsl6、Slc2a4在高糖刺激后表達降低(圖5)。而Decr1(t=17.180，P<0.001)、Acot1(t=7.186，P=0.002)、Acot2(t=34.990，P<0.001)、Slc27a1(t=5.508，P=0.005)、Cpt1a(t=30.870，P<0.001)雖具有統(tǒng)計學(xué)意義但與表2基因芯片分析結(jié)果并不相符(圖5)。

討 論

通過對GEO數(shù)據(jù)庫中的兩個糖尿病心肌病數(shù)據(jù)集進行分析后，共篩選出50個共同表達差異基因，對差異基因進行GO富集后顯示，這些差異基因在脂肪酸代謝和脂肪酸修飾等生物功能中明顯富集，KEGG富集分析提示差異基因在脂肪酸延伸和不飽和脂肪酸生物合成通路中明顯富集。底物代謝紊亂是糖尿病心肌病的發(fā)病機制之一，在生理情況下，心臟可使用脂肪酸和葡萄糖作為主要的代謝底物，胰島素抵抗會導(dǎo)致葡萄糖攝取減少而游離脂肪酸的攝取和氧化增加[22]，基因富集的分析結(jié)果提示這些差異基因可能參與了糖尿病心肌病的底物代謝紊亂。在差異基因的KEGG富集分析中，PPAR信號通路在富集第1位，PPAR在心臟糖脂代謝以及能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，PPAR有多種亞型，其中PPARα在心臟中高表達，影響脂肪酸的攝取和線粒體脂肪酸的氧化[23]。PPARα不僅參與脂肪酸和葡萄糖的代謝，還參與支鏈氨基酸、酮體在糖尿病心肌病中的代謝[24]。差異基因在PPAR信號通路中的明顯富集表明這些差異基因可能通過PPAR信號通路參與脂肪酸的代謝，進而參與心臟的底物代謝紊亂。GSEA富集分析提示糖尿病組在脂肪酸代謝和PPAR信號通路明顯富集。

表2 基因集中差異基因的表達情況

GO：基因本體論；KEGG：京都基因和基因組百科全書；BP：生物學(xué)過程；MF：分子功能；PPAR：過氧化物酶體增殖物激活受體

表3 MCC算法計算出的排名前10的關(guān)鍵基因的分值

實時熒光定量PCR的驗證結(jié)果顯示，在高糖刺激下，Pdk4、Ucp3、Hmgcs2基因表達增加，Slc2a4、Acsl6基因表達下降。Pdk4是細胞能量代謝的關(guān)鍵激酶[25]，Pdk4特異性過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出胰島素抵抗和心肌葡萄糖氧化降低[26]，Ucp3是線粒體解偶聯(lián)蛋白家族成員，Ucp3與脂肪酸的β氧化直接相關(guān)[27]。在一項利用胰島β細胞遺傳缺陷的糖尿病心肌病的模型研究中，高糖低胰島素狀態(tài)會導(dǎo)致Pdk4和Ucp3的表達增加[28]，這與本研究結(jié)果一致，Pdk4和Ucp3在糖尿病心肌病細胞模型中表達升高，但是目前的研究尚無針對Pdk4和Ucp3在糖尿病心肌病中的功能研究。Hmgcs2是酮生成過程中的限速酶[29]，與本研究一致，在大鼠糖尿病模型中，心臟Hmgcs2表達明顯增加而肝臟中Hmgcs2無變化[30]。Slc2a4又被稱作Glut4，Glut4是葡萄糖轉(zhuǎn)運體最主要的亞型，占葡萄糖轉(zhuǎn)運體的70%，在糖尿病心肌病中Glut4表達下降[31]。但是Glut4特異性過表達的糖尿病心肌病小鼠，非但不能挽救糖尿病心肌病的心臟代謝障礙，反而可能導(dǎo)致糖尿病心肌病的進一步發(fā)展[32]，Glut4在糖尿病心肌病中的作用有賴于進一步的研究。

Acsl6在糖尿病心肌病中尚無研究，在人類和大鼠骨骼肌中Acsl6調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成和線粒體的氧化能力[33]，Acsl6與小鼠大腦ω- 3脂肪酸DHA的富集相關(guān)[34]，也是小鼠神經(jīng)保護所必需的[35]。在Acsl的各種亞型中，Acsl3、Acsl4敲減的細胞系中，葡萄糖刺激胰島素釋放降低了50%，但是這項研究中Acsl6對胰島素的釋放并未產(chǎn)生影響[36]。在糖尿病心肌病的細胞模型中Acsl6基因表達降低，在本研究中是首次報道，Acsl6基因在糖尿病心肌病模型中的功能可作為糖尿病心肌病的一個研究方向。

ES：富集分數(shù)；CTR：對照組；DCM：糖尿病心肌病組；NES：標(biāo)準(zhǔn)化富集分數(shù)；FDR：錯誤發(fā)現(xiàn)率

與現(xiàn)有的基于基因集GSE4745和GSE5606進行差異基因分析的文章相比，Dai等[37]通過對基因集GSE5606進行加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析顯示，Angptl4、Acot1、Decr1、Hmgcs2、Pdk4在糖尿病心肌病的小鼠心臟中表達增加，這些基因同樣是本研究中的關(guān)鍵差異表達基因，但是與Dai等[37]的研究結(jié)果不同，Decr1和Acot1基因在本研究中表達下降，考慮為實驗選擇動物種屬不同。另一項關(guān)于GSE4745基因集的研究僅對GSE4745基因集的差異表達基因進行了分析，未在動物或細胞水平檢測差異基因的表達水平[38]。與之前的研究相比，本研究同時使用了兩個基因集的數(shù)據(jù)，關(guān)鍵差異表達基因與Dai等[37]的研究雖有重合但仍有新的發(fā)現(xiàn)，Acsl6基因不僅在現(xiàn)有的基因芯片的分析中報道較少，在糖尿病心肌病的研究中報道也較少，且與Acsl家族中的Acsl3和Acsl4胰島素的釋放相關(guān)，這為以后的研究提供了很好的理論依據(jù)。另外，在現(xiàn)有的與GSE4745和GSE5606基因集研究中僅對差異基因進行GO和KEGG富集不同，本研究同時進行了基因芯片整體基因代謝通路的研究，是對GO和KEGG僅對差異基因進行富集分析的補充。

MCC：最大集團中心

CTR：對照組；HG：高糖組

本研究雖篩選出了糖尿病心肌病中的關(guān)鍵基因并篩選出從未報道過的基因Acsl6，但是對篩選出基因的功能以及與相關(guān)通路的聯(lián)系并未進行進一步的研究，這是本研究的局限性。Pdk4、Ucp3、Hmgcs2、Slc2a4、Acsl6這些在本研究中篩選出的關(guān)鍵基因，可為以后糖尿病心肌病的研究提供方向。