兩種方法檢測(cè)桶裝飲用水回收桶中銅綠假單胞菌的結(jié)果比較

◎ 朱偉珍

（廣東省汕頭市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所，廣東 汕頭 515041）

近年來(lái)，多地市場(chǎng)管理局對(duì)包裝飲用水的監(jiān)督抽檢中發(fā)現(xiàn)其不合格率比較突出。其中，桶裝飲用水中銅綠假單胞菌檢出率遠(yuǎn)高于其他包裝形式的飲用水。有調(diào)查指出，桶裝飲用水中銅綠假單胞菌超標(biāo)的部分原因是回收桶清洗不充分。因受到生產(chǎn)工藝及生產(chǎn)成本的限制，目前絕大部分生產(chǎn)企業(yè)均采用回收桶清洗消毒再利用?；厥胀霸谶\(yùn)輸、銷售以及使用過(guò)程中不可控因素較多，故此類污染難以避免[1-4]。包裝飲用水銅綠假單胞菌項(xiàng)目不合格的問(wèn)題困擾著生產(chǎn)企業(yè)，實(shí)驗(yàn)室也時(shí)有接到生產(chǎn)企業(yè)咨詢關(guān)于回收桶中污染銅綠假單胞菌的問(wèn)題。在廣東省汕頭市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所開(kāi)展“提質(zhì)強(qiáng)企”質(zhì)量技術(shù)幫扶的行動(dòng)中，筆者實(shí)地調(diào)研了當(dāng)?shù)匾患野b飲用水生產(chǎn)企業(yè)，從該企業(yè)的回收桶存放場(chǎng)所隨機(jī)抽取6只回收桶，并對(duì)其進(jìn)行銅綠假單胞菌項(xiàng)目檢測(cè)試驗(yàn)。

我國(guó)現(xiàn)行銅綠假單胞菌的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有《食品國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》（GB 8538—2016）[5]，該方法為濾膜法，此外還有《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）[6]和《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 15979—2002），這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的方法均為定性檢測(cè)法。由于3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)都是對(duì)應(yīng)特定的產(chǎn)品類型，回收桶不屬于這些產(chǎn)品的范圍，檢測(cè)該項(xiàng)目只可參考執(zhí)行。本試驗(yàn)采用了前兩個(gè)較新且方法不同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析比較，以確立一種較為適合該項(xiàng)目的檢測(cè)方法，幫助企業(yè)把好質(zhì)量關(guān)，同時(shí)為后期開(kāi)展該項(xiàng)目的檢測(cè)工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源和標(biāo)準(zhǔn)菌株

6只回收桶是從當(dāng)?shù)匾患疑a(chǎn)企業(yè)的回收桶存放場(chǎng)所隨機(jī)抽取；銅綠假單胞菌ATCC 27853（廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心 食品安全菌種保藏中心）。

1.2 試劑

CN瓊脂培養(yǎng)基、乙酰胺肉湯、金氏B培養(yǎng)基、綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基、氧化酶試劑、十六烷三甲基溴化銨瓊脂、乙酰胺培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂，均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司，驗(yàn)收合格且在有效期內(nèi)。

1.3 儀器與設(shè)備

YM75立式壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；MFS-3A-250-K不銹鋼多聯(lián)過(guò)濾系統(tǒng)（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；BHC-1300IIA/B2生物安全柜、SW-CJ-1Cu凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；BPX-272電恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；WGZ-2XJ細(xì)菌濁度計(jì)（上海昕瑞儀器儀表有限公司）

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣液制備

無(wú)菌操作往6只回收桶各加入260 mL無(wú)菌PBS，清洗回收桶內(nèi)壁包括桶蓋，將洗液收集于6個(gè)無(wú)菌錐形瓶備用。

1.4.2 菌懸液制備

吸取5 mL PBS加入銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株斜面（24 h新鮮培養(yǎng)）中，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。用吸管吸取洗液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌試管中，用漩渦振蕩器混合均勻后稀釋配制成菌懸液，用細(xì)菌濁度計(jì)測(cè)定濃度，用PBS稀釋制備成約103CFU·mL-1濃度備用。

1.4.3 樣品檢測(cè)

（1）濾膜法。檢測(cè)步驟參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》（GB 8538—2016），取250 mL回收桶洗液，通過(guò)孔徑0.45 μm濾膜過(guò)濾，貼在已制備好的CN瓊脂平板上，將平板倒置于（36±1）℃培養(yǎng)40～48 h，并防止干燥。分3種情況進(jìn)行確證試驗(yàn)。①對(duì)于顯藍(lán)色或綠色（綠膿色素）的疑似菌落，需要做綠膿菌素確證試驗(yàn)，陽(yáng)性判為檢出。②對(duì)于產(chǎn)熒光不產(chǎn)綠膿色素的疑似菌落，進(jìn)行乙酰胺肉湯確證試驗(yàn)，陽(yáng)性判為檢出。③對(duì)于顯紅褐色不發(fā)熒光的疑似菌落進(jìn)行氧化酶測(cè)試、乙酰胺肉湯和金氏B培養(yǎng)基確證試驗(yàn)，試驗(yàn)均為陽(yáng)性結(jié)果判為檢出。根據(jù)以上3種情況計(jì)算每250 mL水樣中銅綠假單胞菌的數(shù)量。

（2）定性檢測(cè)法。檢測(cè)步驟參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版），取10 mL回收桶洗液加入 90 mL SCDLP液體培養(yǎng)基中，置于（36±1）℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后，劃線分離于十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板和乙酰胺培養(yǎng)基平板，如有可疑菌落，進(jìn)行染色鏡檢、氧化酶、綠膿菌素、硝酸鹽還原產(chǎn)氣、明膠液化和42 ℃生長(zhǎng)確證試驗(yàn)。經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶及綠膿菌素皆為陽(yáng)性者，即可報(bào)告檢出；如綠膿菌素為陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42 ℃ 生長(zhǎng)三者皆為陽(yáng)性，仍可報(bào)告檢出銅綠假單胞菌。

1.4.4 加標(biāo)檢測(cè)

取制備成約103CFU·mL-1濃度標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液，吸取0.1 mL加入260 mL無(wú)菌PBS中，根據(jù)梯度稀釋，制作加標(biāo)試驗(yàn)。按1.4.3進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.5 菌懸液實(shí)際濃度活菌計(jì)數(shù)

取制備成約103CFU·mL-1濃度標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液，吸取1 mL作適當(dāng)稀釋后，各接種兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和CN瓊脂平板，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，培養(yǎng)后，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，使用濾膜法檢測(cè)，1#、3#、6#回收桶洗液濾膜上各有4個(gè)、11個(gè)、9個(gè)顯藍(lán)綠色的典型菌落，經(jīng)綠膿菌素確證試驗(yàn)，結(jié)果均為陽(yáng)性判為檢出；2#、4#、5#和6#存在其他可疑的菌落，挑取菌落進(jìn)行確證試驗(yàn)，結(jié)果非銅綠假單胞菌。使用定性檢測(cè)法，1#、3#、6#回收桶洗液檢出銅綠假單胞菌，其他洗液未檢出。結(jié)果表明，濾膜法和定性檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)果一致。

表1 兩種方法銅綠假單胞菌檢測(cè)結(jié)果表

由于回收桶的材質(zhì)及結(jié)構(gòu)上的特殊，試樣處理方式不適合采用剪碎或擦拭，因此使用無(wú)菌PBS清洗后取洗液檢測(cè)較為合適。本次試驗(yàn)同時(shí)采用兩種方法，因每個(gè)回收桶樣品都具備唯一性，只能用260 mL無(wú)菌PBS清洗回收桶內(nèi)壁包括桶蓋，將其作為樣液進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)實(shí)際檢測(cè)只采用一種方法時(shí)，應(yīng)按采用的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)處理樣液。濾膜法取250 mL回收桶洗液進(jìn)行過(guò)濾后培養(yǎng)檢測(cè)，定性檢測(cè)法取10 mL洗液進(jìn)行前增菌，使銅綠假單胞菌在低濃度時(shí)也可檢出。此外，需注意使用清洗回收桶的無(wú)菌PBS不能過(guò)少，因回收桶較大，少量液體無(wú)法將桶內(nèi)壁清洗干凈，可能影響檢測(cè)結(jié)果。對(duì)于濾膜法的檢測(cè)結(jié)果，用250 mL和260 mL差別不大，如要準(zhǔn)確計(jì)算可將檢測(cè)結(jié)果乘以1.04。采用定性檢測(cè)法時(shí)，建議在劃線分離時(shí)先觀察SCDLP增菌液的現(xiàn)象，當(dāng)較為清澈時(shí)應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)至標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最長(zhǎng)時(shí)間24 h或26 h，使菌在增菌液中充分生長(zhǎng)再取其劃線分離，避免樣液菌量濃度太低且未充分繁殖出現(xiàn)假陰性。

2.2 加標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

由表2可知，加入最高濃度約103CFU·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液的濾膜上長(zhǎng)有78個(gè)典型藍(lán)綠色菌落，加入濃度4×10-1CFU·mL-1（以103CFU·mL-1為原液進(jìn)行稀釋）的標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液的濾膜上長(zhǎng)有1個(gè)典型藍(lán)綠色菌落。用定性檢測(cè)法在5×10-1、6×10-1梯度未檢出銅綠假單胞菌，其他稀釋梯度都檢出。結(jié)果表明，濾膜法可檢測(cè)低濃度至1 CFU/250 mL，定性檢測(cè)法同樣檢出，結(jié)果一致。結(jié)合表1的試驗(yàn)結(jié)果可知，加標(biāo)檢測(cè)結(jié)果濃度涵蓋了樣品檢測(cè)結(jié)果，推測(cè)不會(huì)出現(xiàn)漏檢情況。

表2 銅綠假單胞菌加標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表

2.3 菌懸液實(shí)際濃度活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

用營(yíng)養(yǎng)瓊脂傾注平皿的103CFU·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液實(shí)際濃度活菌計(jì)數(shù)800 CFU·mL-1，用CN瓊脂傾注平皿計(jì)數(shù)為820 CFU·mL-1，空白無(wú)菌生長(zhǎng)。計(jì)算濾膜法第1梯度吸取0.1 mL 103CFU·mL-1菌懸液過(guò)濾后結(jié)果為78 CFU·mL-1，相當(dāng)于理論數(shù)量乘以10倍即為 780 CFU·mL-1。結(jié)果表明，用兩種不同培養(yǎng)基傾注的結(jié)果與濾膜過(guò)濾的結(jié)果無(wú)明顯區(qū)別，這可能與兩種不同培養(yǎng)基均適合銅綠假單胞菌生長(zhǎng)有關(guān)，銅綠假單胞菌在基本相同的環(huán)境下形成菌落的能力比較接近，且加入的菌液為24 h新鮮培養(yǎng)，菌的生長(zhǎng)活力較強(qiáng)。試驗(yàn)的實(shí)際研究并不在此，僅作為試驗(yàn)的參考，實(shí)際目的在于觀察菌懸液實(shí)際濃度與回收率（達(dá)95%以上），驗(yàn)證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。空白無(wú)菌生長(zhǎng)代表試驗(yàn)并沒(méi)有受到污染，試驗(yàn)結(jié)果有效。

3 結(jié)論與討論

銅綠假單胞菌是一種重要的水源和食源性條件致病菌，屬于革蘭氏陰性細(xì)長(zhǎng)桿菌，大小為（1.5～3.0）μm× （0.5～0.8）μm，廣泛分布于自然界，較其他細(xì)菌對(duì)消毒劑、干燥、紫外線的抵抗力強(qiáng)，在常溫的水中可以存活數(shù)月。該菌幾乎可以感染人體的任何組織和部位，可引起化膿性感染、菌血癥、急性腸道疾病和皮膚炎癥等。隨著我國(guó)對(duì)銅綠假單胞菌的致病性及危害認(rèn)識(shí)的不斷深入，國(guó)家制定了相關(guān)政策。其中，《食品國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水》（GB 19298—2014）[7]于2015年5月24日起正式實(shí)施。該標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定銅綠假單胞菌是必檢項(xiàng)目之一且不得檢出。由本次試驗(yàn)結(jié)果可知，確實(shí)存在桶裝飲用水回收桶銅綠假單胞菌污染的問(wèn)題。雖然本次試驗(yàn)污染銅綠假單胞菌的回收桶最少只有4 CFU，但一旦使用受污染的回收桶裝水銷售，水可提供有利于銅綠假單胞菌生長(zhǎng)繁殖的條件，且隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)，水的銅綠假單胞菌污染會(huì)越來(lái)越嚴(yán)重。包裝飲用水生產(chǎn)企業(yè)要生產(chǎn)合格的水，必須從水的源頭到成品的每個(gè)環(huán)節(jié)層層把關(guān)，包括對(duì)回收空桶及桶蓋進(jìn)行徹底清洗消毒。檢測(cè)回收桶中銅綠假單胞菌的方法必須以最嚴(yán)格的要求執(zhí)行。因此，有必要通過(guò)試驗(yàn)確立一種適合桶裝飲用水回收桶中銅綠假單胞菌的檢測(cè)方法。

本次試驗(yàn)參照我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《食品國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》（GB 8538—2016）和《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）對(duì)桶裝飲用水回收桶中銅綠假單胞菌項(xiàng)目進(jìn)行檢測(cè)。前者為濾膜法，又稱薄膜過(guò)濾法、膜過(guò)濾法、濃縮法，是以微孔濾膜截留液體樣品中的微生物，并直接在濾膜上進(jìn)行培養(yǎng)的微生物檢驗(yàn)方法[8]。該方法的特點(diǎn)是大幅增加了取樣量，能全面反映出樣品中微生物的數(shù)量。銅綠假單胞菌的菌體最小為7.5 μm，標(biāo)準(zhǔn)方法中使用孔徑0.45 μm的濾膜過(guò)濾樣液，完全可以將其截留，檢測(cè)結(jié)果可靠。后者為定性檢測(cè)法，定性檢測(cè)法也可稱為“增菌培養(yǎng)法”，該方法是通過(guò)將樣品處理液加入到適用于目標(biāo)菌生長(zhǎng)繁殖的液體培養(yǎng)基，借助人為創(chuàng)造的培養(yǎng)條件（如培養(yǎng)溫度）使其快速生長(zhǎng)繁殖的方法。該方法的特點(diǎn)是只要檢測(cè)對(duì)象含有較少的目標(biāo)菌，都能進(jìn)行增菌繁殖，檢出率極高。由本次試驗(yàn)可知，用濾膜法250 mL只檢出1 CFU濃度的樣液取10 mL進(jìn)行前增菌，相當(dāng)于取理論數(shù)量為0.04 CFU的菌通過(guò)增菌培養(yǎng)就可以檢出目標(biāo)菌，驗(yàn)證了該方法對(duì)目標(biāo)菌濃度要求極低的特點(diǎn)。但該方法在菌量濃度過(guò)低的情況下，須延長(zhǎng)增菌時(shí)間避免樣液菌量濃度過(guò)低且未得到充分繁殖出現(xiàn)假陰性，且該方法只能達(dá)到定性檢測(cè)，無(wú)法得到銅綠假單胞菌的準(zhǔn)確數(shù)量。

《食品國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》（GB 8538—2016）的濾膜法和《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）的定性檢測(cè)法都是嚴(yán)謹(jǐn)可行的方法，兩種方法各有特點(diǎn)，前者更貼合實(shí)際使用情況且更能夠體現(xiàn)污染程度。