評價血管內(nèi)沖擊波碎石術(shù)在小型豬冠狀動脈中應(yīng)用的安全性

王菁 馬墩亮 鐘志安 張斌

冠心病患者的冠狀動脈鈣化十分常見，其檢出率在冠狀動脈造影中占38%，應(yīng)用血管內(nèi)超聲（intravascular ultrasound，IVUS）檢出率可高達(dá)73%［1-2］。中重度冠狀動脈鈣化病變常導(dǎo)致支架貼壁不良、冠狀動脈穿孔等并發(fā)癥發(fā)生并增加遠(yuǎn)期不良心血管事件［3-6］。體外沖擊波碎石術(shù)成功治療泌尿系結(jié)石有三十余年的臨床經(jīng)驗。美國Shockwave Medical公司基于該技術(shù)原理研發(fā)了血管內(nèi)沖擊波碎石術(shù)（intravascular lithotripsy，IVL），利用沖擊波圓周式、非聚焦的作用特點，對血管淺表、深層鈣化或同心、偏心鈣化均可有效震裂、松解鈣化血管，達(dá)到球囊有效擴張，且不產(chǎn)生鈣化碎屑堵塞遠(yuǎn)端微循環(huán)，在已完成的臨床試驗中取得了良好效果［7-9］。田峰等［10］在國內(nèi)率先做了相應(yīng)的個案報道，顯示了IVL對冠狀動脈鈣化病變的顯著療效。目前該技術(shù)在國內(nèi)尚屬空白，深圳市賽禾醫(yī)療技術(shù)有限公司自主研發(fā)的冠狀動脈沖擊波碎石系統(tǒng)（圖1 A），在體外實驗結(jié)果已證實可碎裂石膏模型且不損傷正常人體組織（圖1 B～D）。本研究旨在評價該國產(chǎn)冠狀動脈沖擊波碎石系統(tǒng)在正常小型實驗豬冠狀動脈中應(yīng)用的安全性。

圖1 冠狀動脈沖擊波碎石系統(tǒng)及體外測試 A. 冠狀動脈沖擊波碎石系統(tǒng)（①主機，②手柄，③沖擊波冠狀動脈球囊導(dǎo)管）；B.沖擊波冠狀動脈球囊釋放脈沖產(chǎn)生微泡；C.沖擊波冠狀動脈球囊釋放脈沖碎裂石膏模型；D.沖擊波冠狀動脈球囊釋放脈沖時對人體軟組織無損傷

1 材料與方法

1. 1 實驗動物

正常巴馬小型豬（實驗豬）12頭，雌雄不限，每頭體質(zhì)量為35～55 kg，由東莞松山湖明珠實驗動物科技有限公司［實驗豬生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2017-0030］提供。動物實驗方案已得到廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會通過（倫理號：KY-D-2021-359-01），實驗豬均享受動物福利。

1. 2 實驗場地及合作單位

動物實驗場地在深圳市領(lǐng)先醫(yī)療服務(wù)有限公司的動物實驗中心介入導(dǎo)管室。合作單位為深圳市賽禾醫(yī)療技術(shù)有限公司。

1. 3 實驗用球囊

實驗用球囊包括兩種類型：LiqMagic C14沖擊波冠狀動脈球囊和雅培NC TREK RX 冠狀動脈球囊。冠狀動脈沖擊波碎石系統(tǒng)由深圳市賽禾醫(yī)療技術(shù)有限公司提供。

1. 4 動物分組

12頭實驗豬的36支冠狀動脈隨機平均分為兩組，實驗組和對照組分別有3支和7支冠狀動脈因直徑小于2.5 mm而放棄，最后入選實驗組（沖擊波冠狀動脈球囊組）和對照組（雅培非順應(yīng)性球囊組）的冠狀動脈分別為15支和11支。12頭實驗豬按1∶1∶1分為三組，每組4頭，分別于術(shù)后0 d、7 d和28 d復(fù)查冠狀動脈造影，并處以安樂死后解剖取材（表1）。

表1 實驗分組、隨訪、處置方法及處置時間

1. 5 手術(shù)過程

術(shù)前3 d起，每頭實驗豬飼喂氯吡格雷（75 mg、每日1次）和阿司匹林（100 mg、每日1次）。手術(shù)當(dāng)天采用舒泰50（每瓶含替來他明125 mg和唑拉西泮125 mg）肌內(nèi)注射麻醉（5 mg/kg）。常規(guī)消毒鋪巾，穿刺右股動脈，置入6 F血管鞘，耳緣靜脈給予肝素鈉200 IU/kg。經(jīng)鞘管送入6 F JL、JR指引導(dǎo)管進行左冠狀動脈及右冠狀動脈造影，送入工作導(dǎo)絲至靶血管，于冠狀動脈內(nèi)注射200 μg硝酸甘油后沿導(dǎo)絲送入IVUS導(dǎo)管測量血管各項指標(biāo)，根據(jù)血管直徑選擇1∶1大小的兩組球囊。

實驗組球囊操作步驟：打開主機電源，將沖擊波冠狀動脈球囊導(dǎo)管與主機連接，主機顯示屏顯示導(dǎo)管規(guī)格和剩余放電次數(shù)，使用壓力泵抽取稀釋的對比劑（生理鹽水和對比劑比例為1∶1）對球囊進行充分排氣，隨后球囊保持負(fù)壓沿導(dǎo)絲輸送至冠狀動脈內(nèi)，以4 atm（1 atm=101.325 kPa）擴張球囊，先按下主機的治療鍵，再按住手柄的控制鍵，主機開始發(fā)放脈沖（1 Hz），10次脈沖為1個周期，每2個周期有10 s間隔，每輪脈沖周期結(jié)束后需對球囊充分排氣，重復(fù)上述操作直至完成80次脈沖發(fā)放。

對照組球囊沿工作導(dǎo)絲送至目標(biāo)位置，110%原始大小擴張，持續(xù)30 s；兩組球囊擴張時行冠狀動脈造影，確認(rèn)球囊遠(yuǎn)端無血流通過；撤出后再次使用IVUS記錄相應(yīng)數(shù)據(jù)，并再次進行冠狀動脈造影確認(rèn)無血管夾層、穿孔、血栓形成且前向血流心肌梗死溶栓治療試驗（thrombolysis in myocardial inf arction，TIMI）血流分級Ⅲ級。每頭實驗豬術(shù)后3 d 給予頭孢噻呋鈉預(yù)防感染（5 mg/kg），并繼續(xù)飼喂阿司匹林（100 mg、每日1次）和氯吡格雷（75 mg、每日1次）至隨訪終點。

1. 6 IVUS檢查

采用i L a b 血管內(nèi)超聲顯像系統(tǒng)（美國，波士頓科學(xué)公司），I V U S 導(dǎo)管為機械旋轉(zhuǎn)型的OptiCross導(dǎo)管，以30幀／秒的速度成像，采用自動回撤IVUS導(dǎo)管（0.5 mm/s）。球囊擴張前后均使用IVUS測量靶血管直徑、內(nèi)彈力膜面積和外彈力膜面積。所有IVUS影像資料均記錄保存由獨立分析人員進行分析。

1. 7 病理形態(tài)學(xué)檢查

標(biāo)本取樣后石蠟包埋，用Leica公司2135型切片機切片，切片厚度為4～5 μm。標(biāo)本分別用蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、彈力纖維（維多利亞藍(lán)）染色、Masson染色和AB-PAS染色四種方法進行觀察。采用Image Pro Plus 6.0軟件分別測量外彈力膜面積、內(nèi)彈力膜面積和管腔面積，血管內(nèi)膜面積與中膜面積的比值通過公式計算：內(nèi)膜面積/中膜面積=（外彈力膜面積-管腔面積）/（外彈力膜面積-內(nèi)彈力膜面積），以此評價術(shù)后血管內(nèi)膜增生情況。通過損傷積分來判斷血管損傷程度：0分，無損傷；1分，內(nèi)皮脫落、中膜及內(nèi)外彈力膜完整；2分，內(nèi)皮脫落及內(nèi)彈力膜斷裂，中膜及外彈力膜完整；3分，內(nèi)皮脫落、內(nèi)彈力膜及中膜斷裂，外彈力膜完整；4分，內(nèi)皮脫落、中膜及內(nèi)外彈力膜斷裂［11］。

1. 8 掃描電子顯微鏡檢查

標(biāo)本取樣后，使用2.5%戊二醛固定后梯度乙醇脫水，然后使用臨界點干燥儀干燥，在血管表面噴涂鉑金，放至掃描電子顯微鏡下觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞。

1. 9 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。連續(xù)型變量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，參數(shù)數(shù)據(jù)組間比較采用雙側(cè)t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 冠狀動脈造影結(jié)果

所有實驗豬術(shù)后均正常存活至隨訪終點。兩組靶血管術(shù)中造影未見血栓、夾層及穿孔發(fā)生，于各自隨訪終點復(fù)查冠狀動脈造影，結(jié)果顯示所有實驗豬冠狀動脈管腔通暢，未見夾層、穿孔、狹窄或閉塞發(fā)生，前向血流TIMI血流分級Ⅲ級（圖2）。

圖2 實驗組和對照組冠狀動脈手術(shù)過程及術(shù)后各時期隨訪冠狀動脈造影結(jié)果 A～E.實驗組（A. 術(shù)前冠狀動脈造影，B. 使用沖擊波冠狀動脈球囊造影，C. 球囊釋放脈沖后造影，D. 術(shù)后7 d 冠狀動脈造影，E. 術(shù)后28 d 冠狀動脈造影）；F～J.對照組（F. 術(shù)前冠狀動脈造影，G. 使用普通球囊造影，H. 球囊擴張后造影，I. 術(shù)后7 d 冠狀動脈造影，J. 術(shù)后28 d 冠狀動脈造影）

2. 2 實驗組心電圖及血壓變化情況

沖擊波冠狀動脈球囊釋放脈沖時可見在正常心電節(jié)律下規(guī)律性地出現(xiàn)插入性脈沖波，未見誘發(fā)心律失常，結(jié)束釋放脈沖后心電圖恢復(fù)正常節(jié)律，整個過程血壓無變化。

2. 3 IVUS檢查結(jié)果及定量分析

兩組靶血管在球囊擴張前后IVUS檢查均未見冠狀動脈夾層、穿孔、血腫及血栓發(fā)生（圖3）。由IVUS定量分析結(jié)果可見，球囊擴張前實驗組和對照組血管直徑［（2.82±0.45）mm比（2.81±0.30）mm，P=0.429］和球囊直徑［（2.80±0.25）mm比（2.73±0.26）mm，P=0.642］比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。球囊擴張后，實驗組和對照組內(nèi)彈力膜面積［（6.36±1.61）mm2比（6.04±1.60）mm2，P=0.843］、外 彈 力 膜 面 積［（6 . 9 0±1. 7 1）m m2比（6.54±1.67）mm2，P=0.769］、內(nèi)彈力膜面積/外彈力膜面積［（0.92±0.02）比（0.92±0.02），P=0.828］比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

表2 血管內(nèi)超聲檢查和定量分析

圖3 兩組靶血管術(shù)前和術(shù)后IVUS 結(jié)果 A～B.實驗組術(shù)前IVUS 及術(shù)后IVUS；C～D.對照組術(shù)前IVUS 及術(shù)后IVUS

2. 4 病理形態(tài)學(xué)檢查

實驗組和對照組分別于術(shù)后0 d、7 d和28 d取材，標(biāo)本行病理學(xué)檢查示：兩組均可見內(nèi)皮細(xì)胞脫落，部分標(biāo)本內(nèi)彈力膜和部分中膜肌纖維斷裂，損傷處可見黏液聚集和膠原纖維增生，未見炎癥細(xì)胞浸潤、血栓形成、壁間血腫和外彈力膜斷裂（圖4～7）。術(shù)后0 d實驗組病理損傷積分顯著高于對照組［（1.80±1.10）分比（1.00±0.00）分，P＜0.01］；實驗組和對照組損傷積分在術(shù)后7 d［（2.00±1.15）分比（2.25±0.96）分，P=0.271］和28 d［（1.60±0.89）分比（1.67±1.15）分，P=0.567］比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；所有實驗組（15支）和對照組（11支）的病理損傷積分進行對比［（1.83±0.99）分比（1.64±0.92）分，P=0.323］，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組管腔面積在術(shù)后28 d較對照組小［（0.28±0.15）mm2比（0.31±0.04）mm2，P=0.032］，而內(nèi)膜面積在術(shù)后7 d較對照組大［（0.07±0.06）mm2比（0.05±0.02）mm2，P=0.019］（表3）。

表3 病理形態(tài)學(xué)定量分析（±s）

表3 病理形態(tài)學(xué)定量分析（±s）

項目 術(shù)后0 d 術(shù)后7 d 術(shù)后28 d實驗組（5 支） 對照組（4 支） P 值 實驗組（5 支） 對照組（4 支） P 值 實驗組（5 支） 對照組（3 支） P 值外彈力膜面積（mm2） 0.69±0.15 0.52±0.39 ＞0.999 0.82±0.80 0.50±0.40 0.265 0.84±0.14 0.68±0.07 0.401內(nèi)彈力膜面積（mm2） 0.34±0.09 0.34±0.29 0.101 0.37±0.41 0.17±0.15 0.135 0.37±0.11 0.36±0.05 0.343管腔面積（mm2） 0.30±0.09 0.32±0.28 0.087 0.30±0.39 0.13±0.13 0.113 0.28±0.15 0.31±0.04 0.032內(nèi)膜面積（mm2） 0.04±0.01 0.03±0.01 0.813 0.07±0.06 0.05±0.02 0.019 0.11±0.11 0.05±0.01 0.139中膜面積（mm2） 0.40±0.10 0.27±0.13 0.812 0.45±0.39 0.33±0.25 0.510 0.46±0.09 0.32±0.03 0.151內(nèi)膜面積/中膜面積 0.10±0.03 0.11±0.03 0.910 0.19±0.12 0.18±0.10 0.789 0.22±0.18 0.14±0.03 0.151

圖4 兩組靶血管各時期的蘇木素-伊紅染色結(jié)果（低倍×100，高倍×400） A～B.術(shù)后0 d 實驗組內(nèi)膜完全脫落（圖B 黑三角所示），局部中膜增厚，外膜完整；C～D.術(shù)后0 d 對照組內(nèi)膜完全脫落（圖D黑三角所示）；E～F.術(shù)后7 d 實驗組管腔可見新生內(nèi)皮細(xì)胞（圖F 黑三角所示）；G～H.術(shù)后7 d 對照組管腔內(nèi)可見新生內(nèi)皮細(xì)胞，局部內(nèi)膜和部分中膜肌纖維斷裂（圖H 黑三角所示），外膜完整；I～J.術(shù)后28 d 實驗組管腔變小，內(nèi)膜和中膜明顯增厚（圖J 黑三角所示）；K～L.術(shù)后28 d對照組內(nèi)膜增生不明顯，局部中膜增厚（圖L黑三角所示）

2. 5 掃描電子顯微鏡檢查結(jié)果

兩組在術(shù)后0 d均出現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落，少許血小板聚集；術(shù)后7 d和28 d兩組血管內(nèi)皮細(xì)胞新生，內(nèi)膜完整，未見血小板聚集（圖8）。

3 討論

圖6 兩組靶血管各時期的Masson 染色結(jié)果（低倍×100，高倍×400） A～B.術(shù)后0 d 實驗組內(nèi)膜下局部黏液聚集（圖B 黑三角所示）；C～D.術(shù)后0 d 對照組內(nèi)膜下少量黏液（圖D 黑三角所示）；E～F.術(shù)后7 d 實驗組管壁全層未見明顯膠原纖維增生（圖F 黑三角所示）；G～H.術(shù)后7 d 對照組部分內(nèi)膜和中膜肌纖維斷裂，部分中膜膠原纖維增生（圖H 黑三角所示）；I～J.術(shù)后28 d 實驗組中膜肌纖維間膠原纖維增生明顯，中膜與外膜間可見藍(lán)色新月形膠原纖維增生（圖J黑三角所示）；K～L.術(shù)后28 d 對照組局部中膜肌纖維間可見膠原纖維少量增生（圖L 黑三角所示）

圖7 兩組靶血管各時期的Masson 染色結(jié)果（低倍×100，高倍×400） A～B.術(shù)后0 d 實驗組內(nèi)膜下局部黏液聚集（圖B 黑三角所示）；C～D.術(shù)后0 d 對照組內(nèi)膜下少量黏液（圖D 黑三角所示）；E～F.術(shù)后7 d 實驗組管壁全層未見明顯膠原纖維增生（圖F 黑三角所示）；G～H.術(shù)后7 d 對照組部分內(nèi)膜和中膜肌纖維斷裂，部分中膜膠原纖維增生（圖H 黑三角所示）；I～J.術(shù)后28 d 實驗組中膜肌纖維間膠原纖維增生明顯，中膜與外膜間可見藍(lán)色新月形膠原纖維增生（圖J 黑三角所示）；K～L.術(shù)后28 d 對照組局部中膜肌纖維間可見膠原纖維少量增生（圖L 黑三角所示）

本研究為評價IVL在活體動物中應(yīng)用的安全性及可行性，研究表明：（1）IVL不破壞正常血管壁外膜，對內(nèi)膜及中膜可造成一定損傷，術(shù)后可自行修復(fù)愈合；（2）沖擊波冠狀動脈球囊在發(fā)放脈沖時，心電圖可見插入性干擾波，但未見誘發(fā)心律失常及血壓變化。多項基于光學(xué)相干斷層成像（optical coherence tomography，OCT）的結(jié)果提示，國外IVL設(shè)備能有效裂解冠狀動脈鈣化病變，擴大狹窄管腔，在不損傷正常血管的情況下，顯著提高手術(shù)即刻效果［7-8］。本研究使用的IVL設(shè)備在體外實驗提示類似有效性，但在體內(nèi)應(yīng)用的安全性仍缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)。因此，本研究以正?；铙w豬的冠狀動脈為研究對象，探討IVL對正常組織的影響。考慮到使用OCT檢查過程中需要通過對比劑成像，有擴大夾層的風(fēng)險，影響實驗結(jié)果，故而選擇IVUS進行評估。手術(shù)即刻IVUS影像結(jié)果提示：兩組靶血管未見冠狀動脈夾層和穿孔表現(xiàn)，手術(shù)前后實驗組和對照組血管直徑和球囊直徑差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果提示同等血管管腔下，沖擊波冠狀動脈球囊并不增加血管并發(fā)癥的發(fā)生率，具備一定安全性。

在本研究中可觀察到實驗組和對照組冠狀動脈有不同程度的內(nèi)彈力膜撕裂和部分中膜肌纖維斷裂。實驗組冠狀動脈內(nèi)膜增生和中膜膠原纖維增生較對照組明顯，管腔面積有一定程度縮小，但外膜完整，且無1例出現(xiàn)冠狀動脈夾層和穿孔。病理損傷積分組間比較顯示術(shù)后0 d實驗組顯著高于對照組（P＜0.01）；但兩組損傷積分在術(shù)后7 d和28 d差異均無統(tǒng)計學(xué)意義?？紤]血管損傷后的病理改變不隨時間消失，為減少統(tǒng)計差異，將實驗組和對照組所有靶血管的病理損傷積分進行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.323）。實驗組冠狀動脈病理標(biāo)本可見內(nèi)、外彈力膜完整，與外膜鄰近的中膜可見部分肌纖維斷裂，斷裂處紅色新月形膠原纖維增生（圖5 J），這種現(xiàn)象可能與沖擊波的特殊作用原理有關(guān)。由于兩組靶血管標(biāo)本在球囊擴張后未置入支架，標(biāo)本的制備過程需要脫水，故導(dǎo)致血管標(biāo)本體積縮小，測得數(shù)據(jù)較IVUS有一定差異，但不影響組間病理數(shù)據(jù)比對。實驗組管腔面積在術(shù)后28 d較對照組小（P=0.032）；內(nèi)膜面積在術(shù)后7 d較對照組大（P=0.019）。既往的動物實驗和尸檢研究早已發(fā)現(xiàn)，經(jīng)皮冠狀動脈球囊擴張術(shù)后可導(dǎo)致血管內(nèi)膜脫落和中膜撕裂，在修復(fù)過程中，新生內(nèi)膜由于血管平滑肌細(xì)胞的增生可導(dǎo)致管腔狹窄［11-14］。因此，在球囊擴張病變后通常置入冠狀動脈藥物洗脫支架，保持血管通暢，抑制內(nèi)膜增生［15］。

圖5 兩組靶血管各時期的彈力纖維染色結(jié)果（低倍×100，高倍×400） A～B.術(shù)后0 d實驗組內(nèi)彈力膜部分?jǐn)嗔眩▓DB黑三角所示），外彈力膜完整；C～D.術(shù)后0 d 對照組內(nèi)彈力膜局部褶皺減少斷裂，局部中膜黏液聚集水腫（圖D 黑三角所示），外彈力膜完整；E～F.術(shù)后7 d 實驗組內(nèi)彈力膜局部褶皺減少（圖F 黑三角所示），外彈力膜完整；G～H.術(shù)后7 d 對照組內(nèi)彈力膜局部排列紊亂，相對完整（圖H 黑三角所示）；I～J.術(shù)后28 d 實驗組內(nèi)、外彈力膜完整，與外膜鄰近的中膜可見部分肌纖維斷裂，紅色新月形膠原纖維增生（圖J 黑三角所示）；K～L.術(shù)后28 d 對照組內(nèi)彈力膜局部斷裂，向中膜遷移（圖L 黑三角所示），中膜局部增厚，外彈力膜完整（由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科江慶萍醫(yī)生提供）

一些個案報道IVL在應(yīng)用中可誘發(fā)室性心律失常，這可能與機電耦合相關(guān)，在靜息心率低于65次/分時容易誘發(fā)［16-17］。由于沖擊波冠狀動脈球囊發(fā)放的脈沖具有去極化功能，在右冠狀動脈內(nèi)應(yīng)用時可能誘發(fā)心房顫動［18］。Disrupt CAD Ⅲ納入了431例受試患者，其中植入起搏器的患者共27例，所有受試患者均未出現(xiàn)沖擊波誘導(dǎo)的心律失常［8］。在本研究中可觀察到?jīng)_擊波冠狀動脈球囊在釋放脈沖時實驗豬未見誘發(fā)心律失常，且血壓無明顯變化。

本研究存在一定局限性：首先，樣本量較少；其次，缺乏冠狀動脈鈣化的動物模型進行有效性研究。本團隊后續(xù)計劃建立合適的動物冠狀動脈鈣化模型驗證其有效性，但動物冠狀動脈鈣化模型的建立有一定難度，目前尚未成功。本實驗結(jié)果達(dá)到預(yù)期，所有小型豬均正常存活，未發(fā)生手術(shù)相關(guān)并發(fā)癥，說明沖擊波冠狀動脈球囊在正常小型實驗豬冠狀動脈中應(yīng)用是安全可行的，為今后沖擊波冠狀動脈球囊開展臨床研究提供了安全依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突