基于窄內(nèi)徑毛細(xì)管-LIF 檢測(cè)系統(tǒng)的miR-221-3p 超小體積無擴(kuò)增檢測(cè)

高瀟瀟，王亮霞，常亞冉，張文美，汪夏燕

北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部化學(xué)與生物系，北京 100124

0 引 言

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類序列非常短的（約19-24 nt）蛋白質(zhì)非編碼RNA 分子，主要通過誘導(dǎo)信使RNA（mRNA）降解和翻譯抑制來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA 的異常表達(dá)與許多生物過程和疾病有關(guān)[1，2]，尤其是癌癥[3，4]、心臟病[5]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[6，7]等[8，9]，且每種疾病的發(fā)生往往伴隨著多種miRNA 的異常表達(dá)。因此，miRNA 的檢測(cè)可以為了解多種生物過程及準(zhǔn)確診斷疾病提供有價(jià)值的信息。miRNA 具有尺寸小、豐度低、易降解、家族成員間序列相似等特點(diǎn)[10,11]，因此，直接定量檢測(cè)miRNA 是具有挑戰(zhàn)性的難題。多數(shù)miRNA 檢測(cè)方法是基于擴(kuò)增或修飾的，比如實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）[12]、微陣列[13]、二代測(cè)序[14]、等溫?cái)U(kuò)增[15]等技術(shù)。這些依賴于擴(kuò)增的方法會(huì)引起定量偏差、保真度低等問題。因此，發(fā)展無擴(kuò)增的miRNA檢測(cè)方法具有重要意義。

通常，基于無擴(kuò)增的miRNA 檢測(cè)方法其特異性和靈敏度均比基于擴(kuò)增的方法低，因此，對(duì)探針的識(shí)別能力和儀器的靈敏度要求更高。通過設(shè)計(jì)miRNA 的雜交探針，可以在復(fù)雜體系中特異性識(shí)別miRNA。常用的miRNA 雜交探針有兩種：?jiǎn)捂淒NA[16]和莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA[17]。分子信標(biāo)（molecular beacon，MB）是Tyagi 和Kramer 在1996 年設(shè)計(jì)的一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸熒光探針[18]，可以對(duì)核酸進(jìn)行識(shí)別，具有特異性強(qiáng)、背景信號(hào)弱、靈敏度高等特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。此外，具有高親和力和高特異性的鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）和肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）的探針也被用于miRNA 的無擴(kuò)增檢測(cè)。

隨著液相色譜設(shè)備逐漸微型化，內(nèi)徑較小的微/納米通道由于具有超小體積需求以及高的分離效率被用于液相色譜分析[19,20]，在DNA、蛋白質(zhì)、氨基酸等生物樣品的分析中表現(xiàn)出較高的分離效率以及靈敏度[21～23]。本研究將內(nèi)徑為1.06 μm 的窄內(nèi)徑毛細(xì)管與高靈敏的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)耦聯(lián)，構(gòu)建窄內(nèi)徑毛細(xì)管-激光誘導(dǎo)熒光（LIF）檢測(cè)系統(tǒng)，并用于分子信標(biāo)探針標(biāo)記的微小核糖核酸221-3p（miR-221-3p）的無擴(kuò)增檢測(cè)，以miR-221-3p 為檢測(cè)靶標(biāo)設(shè)計(jì)了鎖核酸（LNA）修飾的MB（LNA/MB-221）探針，優(yōu)化了LNA/MB-221 探針的緩沖體系以及與靶標(biāo)雜交的最適溫度，評(píng)價(jià)了方法的檢出限，并對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的miR-221-3p 進(jìn)行了檢測(cè)及相對(duì)表達(dá)量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

儀器：VeritiPro?96 孔梯度型熱循環(huán)儀（Thermo Fisher 公司）；Generadar 618 型核酸電泳儀（深圳市海普諾科技發(fā)展有限公司）；Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad 公司）；BioPhotometer Plus 型核酸蛋白測(cè)定儀（Eppendorf 公司）；LightCycler 96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Roche 公司）；GenPure UV/UF 型超純水系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific公司）。

試劑與材料：三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化鎂（MgCl2·6H2O）、氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCl）、硼酸（H3BO3）等試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)；RPMI-1640 培養(yǎng)基、Ham’s F-12K 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青-鏈霉素以及L-谷氨酰胺等細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購于Gibco 公司；miRNA 標(biāo)準(zhǔn)品和焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水購于蘇州吉瑪基因股份有限公司；瓊脂糖購于Biowest 公司；DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker 和上樣緩沖液購于上海捷瑞生物工程有限公司；iTaq Universal qPCR mix 購自Bio-Rad 公司；miRNA 第一鏈cDNA合成試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；LNA/MB-221 探針由Takara 公司合成；QIAzol 裂解液和miRNeasy 試劑盒購于Qiagen 公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 試劑配制

Tris-EDTA（TE）緩沖液：稱取2.423 g Tris 和0.744 5 g EDTA 溶于200 mL 超純水中，用1 mol/L的HCl 調(diào)節(jié)pH 值至8.01，得到濃度為100 mmol/L的TE 溶液。

MgCl2溶液：稱取2.030 g MgCl2·6H2O 溶 于100 mL 超純水中，用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至8.0，得到濃度為100 mmol/L 的MgCl2溶液。

Tris-硼酸（TBE）電泳緩沖液：稱取54.0 g Tris、3.72 g EDTA和27.4g硼酸溶于1L超純水中，用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH值至8.3，配制成TBE 儲(chǔ)液（5×），再稀釋為TBE 緩沖液（0.5×）作為電泳工作液。

1.3 樣品處理及核酸雜交

本研究中所使用的miRNA 序列從miRBase 數(shù)據(jù)庫中獲取，探針序列根據(jù)miRNA 序列設(shè)計(jì)。miR-221-3p 的序列如下：AGC UAC AUU GUC UGC UGG GUU UC；LNA/MB-221 探針序列如下：FAM-AGC GTC GAA ACC CAG CAG ACA ATG TAG CTG ACG CT-Dabcyle（FAM 為6-羧基熒光素；Dabcyle 為4-(4′-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸）。樣品溶解之前先置于高速離心機(jī)內(nèi)，以12 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心1 min，將吸附于管壁或蓋子中的樣品離心至管底。根據(jù)樣品管壁上標(biāo)注的物質(zhì)的量加入適量的溶劑，將LNA/MB-221 探針用超純水溶解至20 μmol/L，miRNA 用DEPC 溶液溶解至20 μmol/L。為避免樣品反復(fù)凍融，分別將DNA 和miRNA 以10 μL 分裝后于冰箱中-80 ℃保存，使用時(shí)稀釋至2 μmol/L。將等濃度等體積的miR-221-3p 和LNA/MB-221 混合，在熱循環(huán)儀中以95 ℃5 min、不同退火溫度（室溫、55～75 ℃）孵育30 min、4 ℃5 min 的條件下進(jìn)行雜交。

1.4 窄內(nèi)徑毛細(xì)管-LIF 檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)建

窄內(nèi)徑毛細(xì)管-LIF 檢測(cè)系統(tǒng)是由窄內(nèi)徑毛細(xì)管、壓力艙和可視化聚焦的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器組成，如圖1(a)所示。所用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)由本課題組自行搭建，檢測(cè)系統(tǒng)由激發(fā)光路、熒光收集光路和成像校準(zhǔn)光路構(gòu)成[24]。本小組將原焦距750 mm 的平凸圓形柱面透鏡改為焦距300 mm 的柱透鏡，使光學(xué)系統(tǒng)擁有更好的聚光能力，同時(shí)減小可視化實(shí)時(shí)成像校準(zhǔn)激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)的體積。

采用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)窄內(nèi)徑毛細(xì)管的截面進(jìn)行表征。如圖1(b)所示，毛細(xì)管內(nèi)徑為1.06 μm。將窄內(nèi)徑毛細(xì)管安裝在檢測(cè)系統(tǒng)上，向毛細(xì)管內(nèi)注入TE 緩沖液，通過可視化實(shí)時(shí)成像聚焦，然后向毛細(xì)管內(nèi)注入樣品，在穩(wěn)定激光功率（1 mW）下檢測(cè)樣品的熒光信號(hào)。采用LabVIEW軟件對(duì)檢測(cè)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

圖1 （a）窄內(nèi)徑毛細(xì)管-LIF 檢測(cè)系統(tǒng)示意圖；（b）窄內(nèi)徑毛細(xì)管截面的SEM 圖Fig.1 (a)Schematic diagram of narrow inner diameter capillary -LIF detection system;(b)SEM image of the cross-section of narrow inner diameter capillary

1.5 LNA/MB-221 探針與miR-221-3p 雜交效率的檢測(cè)

用0.5 g 瓊脂糖與50 mL TBE 緩沖液制作濃度為1%的瓊脂糖凝膠，將待檢測(cè)的雜交樣品與上樣緩沖液（5×）混勻，依次取5 μL 于點(diǎn)樣孔中，在100 V 電壓下電泳45 min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，根據(jù)電泳條帶數(shù)量評(píng)價(jià)雜交效率。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)及miRNA 提取

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 細(xì)胞、人胚肺成纖維細(xì)胞系HFL-1 細(xì)胞均購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。A549 細(xì)胞和HFL-1 細(xì)胞分別使用RPMI-1640 和Ham’s F-12K 培養(yǎng)基培養(yǎng)。RPMI-1640 培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、200 μg/mL 的L-谷氨酰胺和100 U/mL 的青-鏈霉素；Ham’s F-12K 培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、1%的L-谷氨酰胺、1%的非必需氨基酸和1%的丙酮酸鈉溶液。將細(xì)胞以每孔3×105個(gè)的密度接種于6 孔板中，置于37 ℃，含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞覆蓋度達(dá)到90%時(shí)，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗，棄上清，添加1 mL QIAzol裂解液裂解細(xì)胞。將裂解物收集在1.5 mL 微量離心管中，使用miRNeasy 試劑盒提取miRNA。用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定miRNA 濃度，A549 細(xì)胞和HFL-1 細(xì)胞中提取到的總miRNA濃度分別為2 469.4 ng/μL 和812.7 ng/μL。

1.7 RT-qPCR 檢 測(cè)miRNA 表 達(dá)

miRNA 第一鏈cDNA 合成：反應(yīng)體系為20 μL，其中反轉(zhuǎn)錄緩沖液10 μL、酶2 μL、總miRNA 100 ng，加無RNA 酶的水定容至20 μL。反應(yīng)條件為：37 ℃60 min，85 ℃5 min，再冷卻至4 ℃保存。

miRNA 熒光定量PCR：miR-221-3p 的引物由生工生物工程股份有限公司合成，序列為5′-CAG CTA CAT TGT CTG CTG GGT TTC-3′。 將cDNA 合成產(chǎn)物稀釋50 倍后進(jìn)行PCR 檢測(cè)，反應(yīng)總體系為20 μL，其中iTaq Universal qPCR mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、稀釋后的cDNA 2 μL，最后加無RNA 酶的水定容至20 μL。使用Roche Light Cycler 96 擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃10 s，40個(gè)循環(huán)。以U6 作為內(nèi)參基因，用于標(biāo)準(zhǔn)化分析，采用比較Ct 法定量計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)。

2 結(jié)果與討論

2.1 條件優(yōu)化

MB 是一種具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的熒光標(biāo)記核酸探針，影響MB 探針的外部因素有溫度、pH 值和緩沖液的離子濃度[25]。高溫以及高pH 值均會(huì)破壞分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使其變成隨機(jī)的線狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)間的距離變大，猝滅基團(tuán)不能汲取熒光從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。緩沖液中的離子濃度影響MB 探針莖環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響探針的熒光強(qiáng)度。由于本研究中不涉及高pH 值環(huán)境，因此，僅對(duì)緩沖體系中的MgCl2濃度以及雜交溫度進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.1 緩沖體系MgCl2濃度

在保持室溫和pH 8.0 不變的TE 緩沖體系中，探討了MgCl2濃度對(duì)LNA/MB-221 探針熒光信號(hào)的 影 響。圖2(a)為L(zhǎng)NA/MB-221 探 針（0.01～1 μmol/L）在不同濃度（0～7 mmol/L）MgCl2溶液中的熒光強(qiáng)度變化?？梢杂^察到，不同濃度的LNA/MB-221 探針在不含MgCl2的溶液中熒光強(qiáng)度均是最高的，而加入MgCl2之后，探針的信號(hào)顯著降低，且隨著MgCl2溶液濃度的不斷升高，探針的信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱；當(dāng)MgCl2溶液濃度大于等于3 mmol/L時(shí)，探針的信號(hào)強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。圖2(b)為10 nmol/L LNA/MB-221 探針在不同濃度MgCl2溶液中的熒光強(qiáng)度?？梢杂^察到，當(dāng)MgCl2溶液濃度大于等于3 mmol/L 時(shí)，LNA/MB-221 探 針 無 明 顯 的 熒 光 信號(hào)，接近基線。因此，為保證探針本身的信號(hào)不干擾miRNA 的檢測(cè)，本文選用4 mmol/L 的MgCl2溶液作為緩沖體系。

圖2 （a）0.01～1 μmol/L LNA/MB-221 探針在不同濃度MgCl2溶液中的熒光強(qiáng)度；（b）10 nmol/L LNA/MB-221探針在不同濃度MgCl2溶液中的熒光強(qiáng)度Fig.2 (a)The fluorescence intensity of 0.01～1 μmol/L LNA/MB-221 probe in various concentration of MgCl2 solution;(b)the fluorescence intensity of 10 nmol/L LNA/MB-221 probe in various concentration of MgCl2 solution

2.1.2 雜交溫度

雜交過程的退火溫度會(huì)影響核酸的穩(wěn)定性及雜交效率。在室溫～75 ℃考察了溫度對(duì)LNA/MB-221 探針和miR-221-3p 雜交樣品的影響。如圖3 所示，從室溫至75 ℃，LNA/MB-221 探針均能與miRNA 雜交，圖中未出現(xiàn)非特異性條帶。采用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)不同溫度下雜交樣品的熒光強(qiáng)度。不同雜交溫度下的樣品熒光強(qiáng)度間差異較小，其中以溫度為65 ℃時(shí)的樣品熒光信號(hào)略強(qiáng)。因此，本文選用的雜交溫度為65 ℃。

圖3 不同退火溫度下LNA/MB-221 與miR-221-3p雜交樣品的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of the hybrid of LNA/MB-221 and miR-221-3p at different annealing-temperature M：DNA marker；1：miR-221-3p；2：LNA/MB-221；3：room temperature；4：55 ℃；5：60 ℃；6：65 ℃；7：70 ℃；8：75 ℃

2.2 檢出限

由MgCl2濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，10 nmol/L LNA/MB-221 探針在3～7 mmol/L MgCl2緩沖體系中幾乎無熒光信號(hào)，因此可認(rèn)為，探針本身在所檢測(cè)條件下對(duì)背景信號(hào)無貢獻(xiàn)，只有與靶標(biāo)結(jié)合后才會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)。

將LNA/MB-221 探針與等摩爾量的miR-221-3p雜交，檢測(cè)不同濃度雜交樣品的熒光信號(hào)強(qiáng)度，以評(píng)價(jià)檢測(cè)方法的靈敏度。在100 psi（145 psi=1 MPa）氣壓下進(jìn)樣10 s，再以800 psi的氣壓驅(qū)動(dòng)，檢測(cè)LNA/MB-221 探針與miR-221-3p 雜交后樣品（1～10 nmol/L）的熒光強(qiáng)度，進(jìn)樣量約為850 fL，結(jié)果如圖4(a)所示。濃度為1、2.5、5、7.5、10 nmol/L 的雜交樣品峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.4%、5.2%、6.2%、4.2%和7.4%（n=3），表明該方法對(duì)LNA/MB-221 與miR-221-3p雜交樣品的檢測(cè)具有良好的重現(xiàn)性。1 nmol/L 雜交樣品色譜峰的信噪比約為3.26（大于3 倍信噪比），因此，基于分子信標(biāo)探針對(duì)miR-221-3p 的濃度檢出限為1 nmol/L，物質(zhì)的量檢出限為8.5×10-22mol，約為508 個(gè)分子。

圖4(b)為濃度1～10 nmol/L 雜交樣品的熒光強(qiáng)度與濃度的線性關(guān)系圖，相關(guān)系數(shù)為0.999 6，表明線性關(guān)系良好。

圖4 （a）雜交樣品的色譜峰（插圖為1 nmol/L 雜交樣品的色譜峰）；（b）雜交樣品的熒光強(qiáng)度與濃度的線性關(guān)系圖Fig.4 (a)Chromatogram of the hybrid (the inset presents the chromatogram of the hybrid of 1 nmol/L);(b)linearly fitted plot of fluorescence intensities and concentrations of the hybrid

2.3 特異性

為了研究LNA/MB-221 探針對(duì)檢測(cè)miR-221-3p 的特異性，對(duì)在大多數(shù)細(xì)胞中高表達(dá)的miR-21以及miR-205 的干擾能力進(jìn)行了考察。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，將1 μmol/L LNA/MB-221 探針分別與等 摩 爾 量 的miR-221-3p、miR-21 和miR-205 進(jìn) 行雜交，隨后以800 psi 壓力持續(xù)將樣品注入毛細(xì)管中，檢測(cè)其熒光信號(hào)，結(jié)果如圖5 所示。探針濃度為1 μmol/L，遠(yuǎn)大于10 nmol/L，因此，探針本身有微弱的背景信號(hào)；miR-21 和miR-205 與探針的雜交樣品呈現(xiàn)一定的熒光強(qiáng)度變化；而miR-221-3p 與探針雜交樣品熒光強(qiáng)度顯著。結(jié)果表明，該方法對(duì)miRNA-221-3p 的檢測(cè)具有較高的特異性。

圖5 LNA/MB-221 探針檢測(cè)miRNA 的特異性Fig.5 Specificity of LNA/MB-221 probe for miRNA detection

2.4 細(xì)胞中miR-221-3p 的檢測(cè)

將該方法用于HFL-1 細(xì)胞和A549 細(xì)胞總miRNA 樣品中miR-221-3p 的相對(duì)表達(dá)量分析，以評(píng)價(jià)該方法在實(shí)際樣品中檢測(cè)miRNA 的可行性。圖6(a)為HFL-1 細(xì)胞和A549 細(xì)胞中miR-221-3p的熒光信號(hào)峰，HFL-1 細(xì)胞的檢測(cè)信號(hào)較A549 細(xì)胞高，與文獻(xiàn)報(bào)道的miR-221-3p 在衰老的HFL-1細(xì)胞中顯著上調(diào)的結(jié)果[26]一致。采用RT-qPCR 法測(cè)定了miR-221-3p 的相對(duì)表達(dá)量，以驗(yàn)證本文結(jié)果。圖6(b)為RT-qPCR 法測(cè)定HFL-1 細(xì)胞和A549 細(xì)胞中miR-221-3p 的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，HFL-1 細(xì)胞中miR-221-3p 的表達(dá)量較A549 細(xì)胞中高，與本文無擴(kuò)增檢測(cè)得到的結(jié)論相似。這表明了本研究中所使用的無擴(kuò)增的熒光方法檢測(cè)結(jié)果具有一定的準(zhǔn)確性。

圖6 HFL-1 細(xì)胞和A549 細(xì)胞miR-221-3p 的檢測(cè)（a）激光誘導(dǎo)熒光法檢測(cè)HFL-1 和A549 細(xì)胞中miR-221-3p 的色譜圖；（b）RT-qPCR 法測(cè)定HFL-1 和A549 細(xì)胞中miR-221-3p 的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 The detection of miR-221-3p in HFL-1 and A549 cell(a)The chromatogram of miR-221-3p in HFL-1 and A549 cells were detected by LIF detection system;(b)the relative expression of miR-221-3p in HFL-1 and A549 cell lines was determined by RT-qPCR

3 結(jié) 語

本研究以內(nèi)徑為1.06 μm 的毛細(xì)管耦聯(lián)可視化實(shí)時(shí)成像的LIF 檢測(cè)器構(gòu)建了窄內(nèi)徑毛細(xì)管-LIF檢測(cè)系統(tǒng)，用于分子信標(biāo)探針標(biāo)記的miRNA 無擴(kuò)增檢測(cè)。以miR-221-3p 為靶標(biāo)設(shè)計(jì)鎖核酸修飾的分子信標(biāo)探針LNA/MB-221，對(duì)LNA/MB-221 探針緩沖體系中MgCl2溶液濃度和雜交溫度進(jìn)行了優(yōu)化。當(dāng)MgCl2溶液濃度大于3.0 mmol/L 時(shí)，探針的背景干擾較?。浑s交溫度為65 ℃時(shí)，探針與靶標(biāo)雜交樣品的熒光信號(hào)最高。LNA/MB-221 探針與miR-221-3p 的雜交樣品在低濃度范圍內(nèi)（1～10 nmol/L）具有良好的線性相關(guān)性，濃度檢出限為1 nmol/L，且樣品僅消耗850 fL，其物質(zhì)的量檢出限為8.5×10-22mol，約為508 個(gè)分子。此外，采用該方法對(duì)HFL-1 和A549 細(xì)胞中miR-221-3p 實(shí)現(xiàn)了無擴(kuò)增檢測(cè)，與RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果一致。無擴(kuò)增的檢測(cè)方法有望為基于miRNA 的復(fù)雜人類疾病監(jiān)測(cè)和檢測(cè)提供新的思路。