參與DMSP/DMS循環(huán)的極地細菌初步篩選及其多樣性研究?

高雪雨， 商 麗， 吳蕾蕾， 張曉華,2,3， 史曉翀,2,3??

(1. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院， 山東 青島 266003；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室， 山東 青島 266237；3. 中國海洋大學(xué)深海圈層與地球系統(tǒng)前沿科學(xué)中心， 山東 青島 266100)

極地通常指包括南極(>60°S)、北極(>60°N)在內(nèi)的高緯度、高海拔地區(qū)，南極以冰封大陸生境為主，長年為冰雪覆蓋，僅有少數(shù)地區(qū)存在人類活動[1]，北極以低溫海洋生境為主，水文條件復(fù)雜多樣，且受人類活動影響較大[2]。極地具有氣溫較低、營養(yǎng)物質(zhì)貧乏、夏季強輻射、極晝極夜交替等特殊的環(huán)境特征[3]，給生物進化帶來了選擇壓力，造就了極地微生物適應(yīng)極地生態(tài)環(huán)境的獨特性，這些微生物也演化出了特殊結(jié)構(gòu)和功能，能夠通過多種代謝途徑，參與極地關(guān)鍵生源要素循環(huán)的過程，如氮循環(huán)[4]和硫循環(huán)[5]等。在硫循環(huán)過程中，微生物參與的以二甲基巰基丙酸內(nèi)鹽(Dimethyl sulfoxide，DMSP)和二甲基硫(Dimethyl sulfide，DMS)為主要介質(zhì)的海-氣界面硫循環(huán)也得到了較多關(guān)注[6-7]，但相對于中低緯度海區(qū)，對參與DMSP/DMS循環(huán)的極地細菌的研究仍相對較少。

DMSP是一種重要的含硫化合物，以溶解狀態(tài)廣泛存在于海洋環(huán)境中，儲量豐富，有研究估計海洋DMSP的年產(chǎn)量約2.0×1015g[8]。在營養(yǎng)貧乏的海洋環(huán)境中，DMSP作為碳源和硫源為微生物所利用，弧菌還可以利用DMSP做滲透壓保護劑[9]。DMSP可經(jīng)多種途徑產(chǎn)生具有揮發(fā)性的DMS，DMS又可經(jīng)氧化還原反應(yīng)與DMSO相互轉(zhuǎn)化，這2種氣體都是硫元素從海洋釋放到大氣后的產(chǎn)物[10]。DMS和DMSO都可以促進云的形成，一方面可以減少太陽輻射，另一方面可以帶來更多降水，減緩地球的溫室效應(yīng)，因此被稱為“冷室氣體”[11]。以往認為DMSP主要由單細胞微藻、大型海藻、鹽生植物及珊瑚等真核生物合成[12-15]，但目前也發(fā)現(xiàn)α-變形菌綱細菌如玫瑰桿菌等也可以合成DMSP[16]，但相對真核生物，對DMSP合成細菌的研究還較少。DSMP在自然條件下降解速度緩慢，其主要的分解者是真核微生物和原核微生物中的異養(yǎng)細菌[17]。極地具有豐富的DMSP儲備，有研究估計南大洋和南極大陸的DMS產(chǎn)量占全球年產(chǎn)量的10%[18]，因此極地被認為是全球產(chǎn)硫的重要區(qū)域[19]。除了作為細胞的滲透壓保護劑，DMSP還是一種重要的冷凍保護劑，細菌可利用DMSP減少冷凍對細胞的損傷[20]，而極地特殊的環(huán)境條件可能對細菌的DMSP合成和降解途徑中的諸多環(huán)節(jié)產(chǎn)生影響，使之與其他海區(qū)的DMSP相關(guān)功能細菌存在差異，研究極地具有DMSP合成和降解能力的細菌對了解極地DMSP循環(huán)過程具有重要意義。

本文利用實驗室建立的極地微生物資源庫，針對其DMSP合成和降解能力進行篩選，并進一步比較分析參與DMSP/DMS循環(huán)的極地細菌的物種多樣性，為研究和評估極地微生物參與全球DMSP/DMS循環(huán)的作用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 菌株樣品

菌株來自本實驗室建立的極地微生物資源庫，分離自多次南北極考察獲得的海水和沉積物樣品[21-22]。依據(jù)現(xiàn)有菌株的分離來源和分類地位等，從中選擇了174株細菌(共61屬、100個種)進行DMSP合成和降解活性的初步篩選，其中61種、112株細菌分離自北極北歐海海水，43種、62株細菌分離自南極菲爾德斯半島海水和沉積物。

1.2 培養(yǎng)基

本研究采用3種不同的培養(yǎng)基，都以海洋異養(yǎng)細菌的常規(guī)培養(yǎng)基2216E為基礎(chǔ)[23]。添加丙酮酸鈉，配制2216E固體平板作為活化培養(yǎng)基。以液體2216E培養(yǎng)基為母液，添加100 mmol/L DMSP溶液(終濃度1 mmol/L)，配制DMSP降解細菌的初篩培養(yǎng)基；添加100 mmol/L甲硫氨酸溶液(終濃度5 mmol/L)，配制DMSP合成細菌的初篩培養(yǎng)基。

1.3 具有DMSP降解能力極地菌株的初步篩選

菌株連續(xù)活化2～3次后，使用DMSP降解菌初篩培養(yǎng)基進行初篩，陽性對照菌株為LabrenziaaggregateLZB033，該菌可通過降解DMSP產(chǎn)生DMS[16]，陰性對照為不具備DMSP降解活性的菌株P(guān)elagibacabermudensisLZD001[24]，每組樣品各設(shè)置3個平行。

1.4 具有DMSP合成能力極地菌株的初步篩選

菌株連續(xù)活化2～3次后，使用DMSP合成菌初篩培養(yǎng)基進行初步篩選，陽性對照菌株同樣為LabrenziaaggregateLZB033，該菌也可利用甲硫氨酸(Met)為底物合成DMSP[16]，陰性對照為PelagibacabermudensisLZD001，每組樣品各設(shè)置3個平行。

1.5 物種多樣性分析

統(tǒng)計、分析數(shù)據(jù)采用SPSS version 25(https://www.ibm.com/cn-zh/analytics/spss-statistics-software)。使用Origin version 2018(https://www.originlab.com/)對不同分類水平的物種組成進行可視化，制作物種組成Venn圖采用網(wǎng)站Jvenn(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)的算法[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 潛在DMSP降解細菌初步篩選及其降解能力評價

具有DMSP降解潛能的細菌可以利用DMSP底物，使其裂解產(chǎn)生DMS或脫甲基產(chǎn)生MeSH，使用氣相色譜儀檢測DMSP降解生成的氣體，記錄實驗組檢測樣的峰值，以空白對照和陰性對照LZD001菌株的檢測值為基線，以陽性對照LZB033菌株的檢測值為參考標準。

如表1所示，在174株極地細菌中，初步篩選出103株(59.2%)具有DMSP降解活性的菌株，其中的93株(93.2%)細菌能夠通過脫甲基途徑降解DMSP，52株(50.5%)細菌能夠裂解DMSP釋放DMS，45株(43.7%)細菌兼有脫甲基和裂解2種途徑，表明在可培養(yǎng)細菌代謝DMSP的過程中，脫甲基途徑比裂解途徑更常見。另一方面，在全部174株極地細菌中，脫甲基產(chǎn)生MeSH活性較強及以上的極地細菌共73株(42.0%)，經(jīng)裂解途徑產(chǎn)DMS的降解活性較強及以上的極地細菌共16株(9.2%)，表明接近一半細菌具有較強的脫甲基降解活性，而具有裂解途徑的降解細菌較少，多數(shù)菌株裂解活性較弱。

表1 初步篩選潛在DMSP降解菌及其降解活性評價表

續(xù)表1

2.2 潛在DMSP合成細菌初步篩選及其合成能力評價

具有DMSP合成潛能的細菌可以利用Met底物合成DMSP，通過氣相色譜儀檢測DMSP堿解產(chǎn)生的DMS氣體，記錄實驗組檢測樣的峰值，以空白對照和陰性對照LZD001菌株的檢測值為基線，以陽性對照LZB033菌株的檢測值為參考標準。

如表2所示，在174株極地細菌中，初步篩選出28株(16.1%)能夠通過Met底物合成DMSP的極地菌株，其中只有9株細菌具有強或較強的DMSP合成活性，在總體中占比約5%，表明極地可培養(yǎng)細菌中具有DMSP合成活性的菌株較少。

表2 初步篩選潛在DMSP合成菌及其合成活性評價

2.3 參與DMSP/DMS循環(huán)的極地細菌物種多樣性

分離自極地環(huán)境的174株細菌分屬于4門(變形菌門94株、擬桿菌門31株、放線菌門29株、厚壁菌門20株)、7綱(γ-變形菌綱65株、α-變形菌綱27株、β-變形菌綱2株、放線菌綱29株、黃桿菌綱29株、芽孢桿菌綱20株、纖維粘網(wǎng)菌綱2株)、62屬、110種。

初步篩選獲得DMSP降解細菌共103株，分屬于4門(變形菌門61株、放線菌門20株、厚壁菌門15株、擬桿菌門7株)、6綱(γ-變形菌綱46株、α-變形菌綱14株、β-變形菌綱1株、放線菌綱20株、芽孢桿菌綱15株、黃桿菌綱7株)、42屬、76種(見圖1A)，其中厚壁菌門、放線菌門和變形菌門的潛在DMSP降解細菌占比在50%～75%之間，擬桿菌門占比略高于20%，顯著少于其他類群。初步篩選獲得DMSP合成細菌共28株分屬于4門(變形菌門21株、擬桿菌門3株、放線菌門2株、厚壁菌門2株)、6綱(γ-變形菌綱14株、α-變形菌綱5株、β-變形菌綱2株、黃桿菌綱3株、放線菌綱2株、芽孢桿菌綱2株)、19屬、25種(見圖1A)。在綱水平上，具有降解活性的菌株中大多屬于γ-變形菌綱、放線菌綱、芽孢桿菌綱、放線菌綱，具有DMSP合成活性的菌株主要屬于γ-變形菌綱、α-變形菌綱和黃桿菌綱。在屬水平上，DMSP降解菌中豐度高的前6個屬為：嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、萊茵海默氏菌屬(Rheinheimera)、副球菌屬(Paracoccus)、動性球菌屬(Planococcus)、噬脯氨酸菌屬(Prolinoborus)、鹽水桿菌屬(Salinibacterium)，DMSP合成菌中豐度高的前5個屬為：假單胞菌屬(Pseudomonas)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、海桿菌屬、黃桿菌屬(Flavobacterium)、莫拉氏菌屬(Moraxella)(見圖1B)。

(A：門水平Phylum level；B：屬水平Genus level。DMSP降解菌：具有經(jīng)脫甲基途徑或裂解途徑降解DMSP能力的極地菌株；DMSP合成菌：具有經(jīng)Met底物合成DMSP能力的極地菌株。DMSP degrading bacteria: polar strains with the ability to degrade DMSP through demethylation or lysis pathways; DMSP synthesizing bacteria: polar strains with the ability to synthesize DMSP via Met substrates.)

綜合比較參與DMSP/DMS循環(huán)的極地細菌，在降解途徑方面，通過脫甲基途徑降解DMSP的細菌96株，分屬于4門、6綱、38屬、71種，通過裂解途徑降解DMSP的細菌52株分屬于4門、6綱、29屬、42種。其中有37種(45株)細菌兼有2種降解途徑，34種(51株)細菌只有脫甲基途徑，5種(7株)細菌只有DMSP裂解途徑(見圖2A)，其中Aeromicrobiumginsengisoli和Kocuriarosea屬于放線菌綱，Lelliottiaamnigena和Stenotrophomonasrhizophila屬于γ-變形菌綱。能夠通過脫甲基和裂解途徑降解DMSP并能夠從Met合成DMSP的極地細菌共14種、17株(見圖2A)，其中12株屬于γ-變形菌綱，表明同時具有DMSP合成和降解能力的細菌在γ-變形菌綱中分布較為廣泛。而變形菌門(占比>60%)和所屬的γ-變形菌綱(占比>40%)是參與DMSP/DMS循環(huán)的優(yōu)勢類群(見圖2B、C)。

(A：不同代謝途徑細菌類群Bacterial groups with different metabolic pathways；B：門水平Phylum level；C：綱水平Class level。DMSP脫甲基：經(jīng)脫甲基途徑降解DMSP；DMSP裂解：DMSP的裂解途徑；DMSP合成：DMSP的合成途徑。DMSP demethylation: Degradation of DMSP through demethylation pathway; DMSP cleavage: Cleavage pathway of DMSP; DMSP Synthesis: synthesis pathway of DMSP.)

2.4 具有DMSP代謝活性極地細菌多樣性

174株極地細菌分別分離自北歐海表層海水樣品(112株)和南極菲爾德斯半島潮間帶沉積物和海水樣品(62株)。在綱和屬的分類水平上，分離自北極的DMSP降解菌包括γ-變形菌綱的萊茵海默氏菌屬(Rheinheimera)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和海桿菌屬(Marinobacter)、α-變形菌綱的副球菌屬(Paracoccus)和亞硫酸鹽桿菌(Sulfitobacter)、放線菌綱的鹽水桿菌屬(Salinibacterium)、芽孢桿菌綱的大洋芽胞桿菌屬(Oceanobacillus)等占優(yōu)勢；分離自南極的DMSP降解菌中，γ-變形菌綱的嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、放線菌綱的鹽水桿菌屬(Salinibacterium)、黃桿菌綱的黃桿菌屬(Flavobacterium)、芽孢桿菌綱的動性球菌屬(Planococcus)等占主導(dǎo)地位(見圖3A)。北極來源的DMSP合成菌以γ-變形菌綱的假單胞菌屬(Pseudomonas)和海桿菌屬(Marinobacter)、α-變形菌綱的亞硫酸鹽桿菌(Sulfitobacter)為主；南極來源的DMSP合成細菌以γ-變形菌綱的嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和黃桿菌綱的黃桿菌屬(Flavobacterium)、莫拉氏菌屬(Moraxella)為主(見圖3B)。可以發(fā)現(xiàn)，γ-變形菌綱細菌在南北極都廣泛參與DMSP/DMS循環(huán)，α-變形菌綱類群中的功能細菌在北極較為活躍，黃桿菌綱細菌在南極可培養(yǎng)細菌中占據(jù)優(yōu)勢，且該類群中的某些細菌兼有DMSP降解和合成活性?？梢钥闯?，極地環(huán)境中，具有DMSP合成活性的細菌類群少于DMSP降解細菌的類群，而南極來源的功能細菌類群少于北極來源的細菌群落。

(A：綱水平Class level；B：屬水平Genus level。北極降解菌：北極來源的DMSP降解菌，南極降解菌：南極來源的DMSP降解菌；北極合成菌：北極來源的DMSP合成菌；南極合成菌：南極來源的DMSP合成菌。Degrading bacteria from Arctic: DMSP degrading bacteria from the North Polar, Degrading bacteria form Antarctic: DMSP degrading bacteria from from the South Polar; Synthetic bacteria from Arctic: DMSP synthesizing bacteria from the North Polar; Synthetic bacteria form Antarctic: DMSP synthesizing bacteria from the South Polar.)

3 討論

以DMSP/DMS為載體的海-氣界面硫循環(huán)是生源物質(zhì)的生物地球化學(xué)循環(huán)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和重要組成部分，同時也對全球氣候變化具有重要影響，因此研究海洋生境中介導(dǎo)該循環(huán)的細菌類群成為一個熱點[26]，但目前為止，諸多研究報道中參與DMSP/DMS循環(huán)的海洋細菌群落大多分離自溫帶、亞熱帶海域，較少關(guān)注極地環(huán)境中的細菌群落及其在硫循環(huán)方面的貢獻[27]。本研究通過對分離自北歐海表層海水樣品和南極菲爾德斯半島潮間帶沉積物樣品的174株細菌進行初步篩選，發(fā)現(xiàn)了一些能夠參與DMSP/DMS循環(huán)的極地細菌類群，并初步闡明了其細菌群落結(jié)構(gòu)和分布情況。

本研究以極地來源的100種、174株待測菌株為實驗對象，經(jīng)過初步篩選，發(fā)現(xiàn)其中約59.2%的細菌具有不同程度的DMSP降解能力，說明能夠降解DMSP的細菌在極地廣泛存在，Howard等[28]研究發(fā)現(xiàn)海洋表層水體中能夠通過脫甲基途徑降解DMSP的細菌占細菌總數(shù)的一半以上，與本研究結(jié)果相近。研究還發(fā)現(xiàn)在可培養(yǎng)的DMSP降解菌中，約93.2%(96株細菌)能夠通過脫甲基途徑降解DMSP，分屬于4門、6綱、38屬、71種，通過裂解途徑降解DMSP的細菌占比約50.5%，52株細菌分屬于4門、6綱、29屬、42種，絕大多數(shù)降解菌采用脫甲基途徑，而擁有裂解途徑的細菌相對較少且物種多樣性較低，此外，可降解細菌中，43.7%的菌株兼有脫甲基和裂解2種途徑，表明在營養(yǎng)匱乏的極地海洋或沉積物中，大多數(shù)細菌傾向于利用DMSP作為碳源或硫源生長，而這一生理過程需要脫甲基途徑產(chǎn)生的MeSH和乙醛，這與Kiene[29]等研究中報道的50%～90%的DMSP都會通過脫甲基途徑為浮游細菌所降解的結(jié)論相一致。對極地DMSP降解菌的物種多樣性研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門、放線菌門、變形菌門的潛在DMSP降解細菌占比在50%～75%之間，主要分布在γ-變形菌綱、α-變形菌綱和放線菌綱中，擬桿菌門黃桿菌綱具有DMSP降解能力的細菌低于其他類群。Curson等通過對具有DMSP降解活性的海洋細菌的研究指出裂解途徑主要由Ddd裂解酶來完成，這些酶主要存在于變形菌門的γ-變形菌綱[30]和α-變形菌綱中[31]，與本研究的結(jié)果一致。此外還發(fā)現(xiàn)具有DMSP降解活性的細菌類群在綱水平上的分布情況與本研究獲得的DMSP降解菌株類群多樣性接近，說明具有DMSP降解能力的細菌(經(jīng)脫甲基和裂解途徑)在極地環(huán)境中分布廣泛。

本研究中共獲得具有DMSP合成能力的菌株28株(16.1%)，且大多數(shù)合成能力較弱。能夠利用Met底物合成DMSP的極地細菌類群主要包括γ-變形菌綱的假單胞菌屬(Pseudomonas)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和海桿菌屬(Marinobacter)等以及黃桿菌綱的黃桿菌屬(Flavobacterium)等，該結(jié)果與張曉華[32]等根據(jù)目前已有的報道認為能夠合成DMSP的細菌多來自α-變形菌綱中的海洋玫瑰桿菌的結(jié)論不一致，但吳蕾蕾[22]在南極非培養(yǎng)細菌多樣性研究中發(fā)現(xiàn)，γ-變形菌綱和黃桿菌綱等為優(yōu)勢類群，商麗[21]在北歐?？膳囵B(yǎng)細菌多樣性研究中也發(fā)現(xiàn)，γ-變形菌綱的假單胞菌屬處于優(yōu)勢地位，已有研究表明，DMSP可以發(fā)揮細菌抗凍劑的作用[33]，可能作為極地細菌的一種環(huán)境適應(yīng)策略，使具有DMSP合成能力的極地細菌獲得生長優(yōu)勢，因此本研究發(fā)現(xiàn)功能細菌類群(如嗜冷桿菌屬[34]和黃桿菌屬[35])，之所以在極地可培養(yǎng)細菌中具有較高豐度，可能也與其為適應(yīng)寒冷環(huán)境而逐漸演化出合成DMSP的相關(guān)基因有關(guān)。另一方面，28株DMSP合成菌中，14種、17株細菌兼有降解DMSP的脫甲基和裂解途徑，其中12株屬于γ-變形菌綱，表現(xiàn)出與陽性對照LabrenziaaggregataLZB033相似的活性，猜測這些菌株可能合成DMSP以提升抗逆能力，同時也利用環(huán)境中的DMSP作為營養(yǎng)物質(zhì)。本研究還發(fā)現(xiàn)2株DMSP合成能力較強的菌株，成都假單胞菌(Pseudomonaschengduensis)和棲藻黃桿菌(Flavobacteriumalgicola)，分別屬于γ-變形菌綱和黃桿菌綱，未見與其DMSP合成能力相關(guān)的報道，有待進一步研究。

從極地細菌的來源看，63.4%的北極可培養(yǎng)細菌(33屬、50種、71株)能夠不同程度地降解DMSP，51.6%的南極可培養(yǎng)細菌(14屬、27種、32株)具有DMSP降解活性，北極來源細菌中DMSP降解細菌占比較高，在可培養(yǎng)細菌中分布較廣。北極來源的DMSP合成細菌(15屬、18種、20株)菌株數(shù)占比約17.9%，南極來源的DMSP合成細菌(4屬、7種、8株)占比約12.9%，仍以北極來源的DMSP合成菌較高，特別是，28株潛在DMSP合成細菌中有9株菌合成能力較強，其中8株分離自北歐海水體樣品。結(jié)果表明，DMSP降解菌和合成菌中，北極來源的細菌占比較高，且生物多樣性更高。這可能與菲爾德斯半島與北歐海地理條件的差異有關(guān)[36]，也可能是表層水體中的浮游細菌和沉積物中細菌類群存在差異，但本研究還發(fā)現(xiàn)南北極可培養(yǎng)細菌的群落結(jié)構(gòu)比較相近，因此推測相較于6 ℃以上的南極沉積物環(huán)境[37]，北極表層水體中的可培養(yǎng)浮游細菌在較冷的環(huán)境中更可能利用DMSP作為細胞抗凍劑，使得其在北極海水中能夠參與DMSP/DMS循環(huán)的細菌類群更多樣且活躍。在DMSP降解菌和合成菌的類群分布上，研究發(fā)現(xiàn)γ-變形菌綱細菌在南、北極廣泛參與DMSP/DMS循環(huán)，α-變形菌綱類群中的功能細菌在北極較為活躍，黃桿菌綱為南極來源功能細菌的特征菌群，且該類群細菌兼有DMSP降解和合成活性。在本研究的菌株樣品中，不同分離來源的功能細菌群落在屬水平上存在較大差異，比如南北極來源的降解菌都主要分布于γ-變形菌綱，但北極來源的降解菌主要包括萊茵海默氏菌屬(Rheinheimera)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等，南極來源的降解菌主要包括嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)，這意味著對不同極地來源的DMSP相關(guān)功能細菌可能需要分別進行研究。

研究北極和南極環(huán)境中參與DMSP/DMS循環(huán)的細菌類群，一方面能夠加深對極地細菌生態(tài)功能的認識，并對細菌群落的演化及其與環(huán)境的互作過程獲得更多的了解，另一方面也能利用新發(fā)現(xiàn)的極地DMSP相關(guān)功能細菌對細菌介導(dǎo)的DMSP合成和代謝進行進一步的研究。本研究通過對不同來源的極地DMSP合成/降解菌株進行初步篩選和比較，發(fā)現(xiàn)了一些具有潛在研究價值的功能性細菌類群，并且發(fā)現(xiàn)DMSP/DMS相關(guān)細菌在極地廣泛分布，為深入研究參與全球DMSP/DMS循環(huán)的極地微生物提供了基礎(chǔ)資料。