野鴉椿和圓齒野鴉椿對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)及抗寒性評(píng)價(jià)

劉 聰，陸思羽，涂淑萍，姜雪茹

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江西南昌 330045）

0 引言

【研究意義】低溫是限制植物地理分布及影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因子（Pearce，2001）。野鴉椿［（Thunb.）Dippel］和圓齒野鴉椿（Hayata）均屬省沽油科（Staphyleaceae）野鴉椿屬（）灌木或小喬木，為藥賞兼用樹種，前者為落葉樹種，分布范圍廣，后者為常綠樹種，主要分布在南亞熱帶。作為觀賞樹種，圓齒野鴉椿觀賞性明顯優(yōu)于野鴉椿，但適宜生長(zhǎng)范圍小于野鴉椿。圓齒野鴉椿的抗寒性是影響其推廣應(yīng)用的主要因素之一。低溫脅迫可引起植物生理代謝紊亂，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致植株死亡。篩選評(píng)價(jià)與野鴉椿和圓齒野鴉椿抗寒性相關(guān)的生理指標(biāo)，對(duì)培育抗寒品種和擴(kuò)大生產(chǎn)應(yīng)用范圍具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物的抗寒性與抗氧化酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)關(guān)系密切（朱愛民等，2021）。同時(shí)，同科同屬的不同植物間抗寒性差異也比較明顯（于飛等，2014）。黃一波等（2021）在對(duì)7種木蓮屬（）植物抗寒性評(píng)價(jià)及其生理機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，其抗寒性與相對(duì)電導(dǎo)率呈顯著正相關(guān)。謝雨萱等（2021）在研究自然越冬期不同姜花屬（）植物的抗寒性時(shí)發(fā)現(xiàn)，抗寒性強(qiáng)的種質(zhì)葉片其抗氧化物酶（過氧化物酶POD、超氧化物歧化酶SOD）活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性蛋白Pro）含量更高。在有關(guān)野鴉椿屬抗寒性的研究中，康文娟（2015）研究得出，可溶性糖（SP）和丙二醛（MDA）含量及SOD活性與不同家系圓齒野鴉椿苗木抗寒能力顯著相關(guān)。也有研究表明，過氧化氫酶（CAT）、POD和SOD等細(xì)胞保護(hù)酶活性，以及相對(duì)電導(dǎo)率（REC）、脯氨酸、MDA、SP和Pro含量等是評(píng)價(jià)植物抗寒性的重要生理指標(biāo)（田星等，2018；馬曉華等，2021），同時(shí)結(jié)合主成分分析和隸屬函數(shù)法對(duì)植物抗寒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，能較全面、準(zhǔn)確地反映植物間抗寒能力的差異，避免單一指標(biāo)的片面性（王娜等，2016；李瑞雪等，2017；金龍飛等，2021）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì)野鴉椿和圓齒野鴉椿抗寒性的研究較少見，尚未見將野鴉椿與圓齒野鴉椿二者進(jìn)行抗寒性比較的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】比較野鴉椿與圓齒野鴉椿在4 ℃低溫條件下處理隨時(shí)間變化，其葉片Pro、SP、MDA含量，CAT、POD、SOD活性及REC的變化，并利用主成分分析和隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)二者的抗寒性。篩選出判斷野鴉椿與圓齒野鴉椿抗寒性的最佳生理生化指標(biāo)，并驗(yàn)證二者抗寒性的強(qiáng)弱，為野鴉椿屬植物的抗寒性育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地設(shè)在南昌市青山湖區(qū)江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)，位于東經(jīng)115°4948、北緯28°4534，屬于亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，溫和濕潤(rùn)，降雨充沛，年平均降雨量1600～1700 mm，日照充足。年平均氣溫17.0～17.7 ℃，氣溫最高40.9 ℃、最低-15.2 ℃（劉娟等，2018）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以當(dāng)年春季播種繁殖的野鴉椿和圓齒野鴉椿盆栽苗為試材。花盆規(guī)格為10 cm×10 cm；培養(yǎng)土為園土∶泥炭∶蛭石=3∶1∶1，加少量有機(jī)肥。于2019年9月份挑選生長(zhǎng)健壯、無病蟲危害的野鴉椿和圓齒野鴉椿各120株，置于25±2 ℃的人工氣候培養(yǎng)室培養(yǎng)7 d后，剪下長(zhǎng)度為20～30 cm的枝梢，先后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，擦干表面水，剪口處封蠟，然后每10根一扎裝入自封袋，置于4 ℃的冰箱中進(jìn)行低溫處理；依次于低溫處理的第0、5、10和15 d，每個(gè)樹種各取出3扎枝梢（3次重復(fù)），先取少許葉片測(cè)定REC，然后將其余葉片剪下，用錫箔紙包裹后迅速放入液氮中，隨后裝入自封袋，置于-80 ℃的超低溫冰箱中保存，用于生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，CAT活性采用紫外吸收法測(cè)定，SOD活性采用氮藍(lán)四唑光化還原法測(cè)定（李合生，2000）。MDA含量采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定，Pro含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，SP含量采用蒽酮比色法測(cè)定，REC采用浸泡法測(cè)定（孔祥生和易現(xiàn)峰，2008）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsoft Excel 2017和Origin 2019b進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖。利用SPSS 22.0進(jìn)行多重比較（Duncan’s法）、皮爾遜（Pearson）相關(guān)分析及主成分分析。利用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法對(duì)2個(gè)樹種的抗寒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下野鴉椿和圓齒野鴨椿葉片的SOD、POD和CAT活性變化

2.1.1 葉片SOD活性 由表1可知，野鴉椿與圓齒野鴉椿的葉片SOD活性在低溫脅迫下的變化趨勢(shì)一致，均在4 ℃處理5 d時(shí)達(dá)最大值，并隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，活性逐漸降低；且在相同處理時(shí)間下，野鴉椿的葉片SOD活性始終高于圓齒野鴉椿。此外，二者在處理初期（前5 d）葉片SOD活性均上升，隨著處理的進(jìn)行，二者葉片SOD活性均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，并逐漸與其低溫處理0 d時(shí)的活性相近，表明此時(shí)二者已經(jīng)對(duì)該低溫產(chǎn)生適應(yīng)性。

2.1.2 葉片POD活性 野鴉椿的葉片POD活性整體上高于圓齒野鴉椿，在低溫脅迫下，二者POD活性均表現(xiàn)為先升后降。野鴉椿葉片POD活性變化起伏相對(duì)較小，最大值出現(xiàn)在低溫處理10 d時(shí)，之后略有下降；圓齒野鴉椿葉片POD活性變化起伏相對(duì)較大，最大值出現(xiàn)在低溫處理5 d時(shí)，之后大幅下降。

2.1.3 葉片CAT活性 野鴉椿與圓齒野鴉椿葉片CAT活性的變化趨勢(shì)大致相同，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，均表現(xiàn)為先升后降。其中，野鴉椿葉片CAT活性在低溫處理5 d時(shí)迅速上升，10 d時(shí)開始下降；圓齒野鴉椿葉片CAT活性在低溫處理5 d時(shí)緩慢上升，10 d時(shí)開始下降，但下降幅度不顯著（＞0.05，下同）。野鴉椿CAT活性變化幅度大于圓齒野鴉椿。

綜上所述，野鴉椿與圓齒野鴉椿的葉片SOD、POD和CAT活性在低溫脅迫下均表現(xiàn)為先升后降的變化趨勢(shì)。除野鴉椿葉片POD活性在低溫處理第10 d達(dá)最大值外，其他均在低溫處理的第5 d酶活性達(dá)最大值。表明2個(gè)樹種在4 ℃低溫處理的初期均產(chǎn)生抵抗低溫逆境傷害的反應(yīng)，此后，隨著植物對(duì)低溫的逐漸適應(yīng)，酶活性開始逐漸降低。

2.2 低溫脅迫下野鴉椿和圓齒野鴨椿葉片SP和Pro含量變化

2.2.1 葉片SP含量 由圖1可知，低溫處理0 d時(shí)，圓齒野鴉椿的葉片SP含量顯著高于野鴉椿（＜0.05，下同），但在低溫處理5 d以后，野鴉椿與圓齒野鴨椿的SP含量差異不顯著；且在整個(gè)低溫處理過程中，二者的SP含量均呈現(xiàn)降—升—降的變化趨勢(shì)。在處理初期，圓齒野鴉椿葉片SP含量顯著下降，而野鴉椿葉片SP含量下降不顯著，至低溫處理5 d時(shí)，圓齒野鴉椿的葉片SP低于野鴉椿。低溫處理5～10 d，二者的葉片SP含量均顯著升高；低溫處理10～15 d時(shí)，野鴉椿葉片可SP含量顯著降低，而圓齒野鴉椿葉片SP含量降低未達(dá)顯著水平。

2.2.2 葉片Pro含量 由圖2可知，無論是在低溫處理前還是處理過程中，圓齒野鴉椿的葉片Pro含量均顯著高于野鴉椿。在低溫處理初期野鴉椿和圓齒野鴉椿的葉片Pro的含量均顯著上升；低溫處理5 d以后，野鴉椿葉片Pro含量至低溫處理10 d時(shí)下降至低溫處理0 d的水平并維持，而圓齒野鴉椿Pro含量下降不明顯，一直維持在較高水平。

2.3 低溫脅迫下野鴉椿和圓齒野鴨椿葉片MDA和REC的變化

2.3.1 葉片MDA含量 由圖3可知，無論是在低溫處理前還是在處理過程中，圓齒野鴉椿的葉片MDA含量始終高于野鴉椿。圓齒野鴉椿葉片MDA含量在前10 d的變化幅度不大，10 d之后顯著上升；而野鴉椿葉片MDA含量在低溫處理初期顯著降低，此后變化不大。

2.3.2 葉片REC 由圖4可知，在低溫脅迫處理前，2種植物的葉片REC相近，隨著低溫脅迫天數(shù)的增加，2種植物葉片REC均呈穩(wěn)步上升的趨勢(shì)，低溫處理5 d以后，圓齒野鴉椿的葉片REC上升速度快于野鴉椿，低溫脅迫10 d后，圓齒野鴉椿的葉片REC顯著高于野鴉椿。

2.4 低溫脅迫下野鴉椿和圓齒野鴉椿抗寒性生理指標(biāo)的相關(guān)分析

由表2可知，低溫脅迫下，MDA含量與SP含量呈顯著正相關(guān)，其他生理指標(biāo)間均不顯著相關(guān)，無法直接通過相關(guān)性來判定各生理指標(biāo)對(duì)野鴉椿和圓齒野鴨椿抗寒性的影響。因此要準(zhǔn)確篩選出對(duì)抗寒性強(qiáng)弱影響較大的生理指標(biāo)，還需進(jìn)一步進(jìn)行主成分分析。

2.5 低溫脅迫下野鴉椿與圓齒野鴉椿抗寒性生理指標(biāo)的主成分分析

選取野鴉椿與圓齒野鴉椿4 ℃低溫處理10 d時(shí)的7個(gè)生理生化指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，計(jì)算其特征值的方差貢獻(xiàn)率和累積方差貢獻(xiàn)率，并根據(jù)主成分的特征值大于1.00的原則提取主成分。由表3可知，前2個(gè)綜合指標(biāo)的方差貢獻(xiàn)率分別為72.575%和17.235%，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)89.810%，超過85.000%，基本包含所測(cè)指標(biāo)的全部信息。故取第一主成分（Y）和第二主成分（Y），其余主成分可忽略不計(jì)。決定第一主成分的指標(biāo)主要有POD（0.988）、REC（-0.988）、Pro（-0.936）、MDA（-0.896）、SP（0.864），決定第二主成分的主要是CAT（0.917）。因此，判別野鴉椿與圓齒野鴉椿抗寒性的生理指標(biāo)及其重要性排序依次為POD=REC＞Pro＞MDA＞SP＞CAT。

2.6 野鴉椿和圓齒野鴉椿抗寒性的綜合評(píng)價(jià)

2.6.1 主成分分析法 表3中2個(gè)主成分的表達(dá)式分別為：

把每個(gè)原始指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)代入到公式（1）和公式（2）中，可得到野鴉椿與圓齒野鴉椿對(duì)應(yīng)的前2個(gè)主成分的值，再分別以2個(gè)主成分所對(duì)應(yīng)的貢獻(xiàn)率為各自的權(quán)重，從而得到基于主成分分析法的野鴉椿與圓齒野鴉椿的抗寒性綜合評(píng)價(jià)模型，即加權(quán)值計(jì)算公式（陸思羽等，2020）為：

從表4可看出，第一主成分得分較高的為野鴉椿，第二主成分得分較高的為圓齒野鴉椿，而綜合主成分得分，野鴉椿（614.94分）遠(yuǎn)高于圓齒野鴉椿（40.36分），說明野鴉椿抗寒性遠(yuǎn)強(qiáng)于圓齒野鴉椿。

2.6.2 隸數(shù)函數(shù)法 利用隸屬函數(shù)法對(duì)主成分分析中提取的6個(gè)判別2個(gè)樹種抗寒性的重要生理指標(biāo)，即POD和CAT活性、Pro、MDA和SP含量及REC進(jìn)行綜合分析，綜合評(píng)價(jià)野鴉椿與圓齒野鴉椿抗寒性強(qiáng)弱。隸屬函數(shù)值的計(jì)算公式（涂淑萍等，2021）為：

如果某一項(xiàng)指標(biāo)與抗寒性為負(fù)相關(guān)，則用隸數(shù)函數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，計(jì)算公式為：

公式（4）和（5）中，為各處理某一指標(biāo)的實(shí)際測(cè)定數(shù)值，和分別為該指標(biāo)實(shí)際測(cè)定值中最小值和最大值。用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)方法對(duì)2個(gè)樹種6個(gè)指標(biāo)隸屬函數(shù)值進(jìn)行累加，求平均值。隸屬函數(shù)值越大，抗寒性越強(qiáng)；隸數(shù)函數(shù)值越小，抗寒性越弱（令凡等，2015）。由表5可知，野鴉椿抗寒性遠(yuǎn)強(qiáng)于圓齒野鴉椿。

3 討論

3.1 低溫脅迫對(duì)野鴉椿和圓齒野鴉椿保護(hù)酶活性的影響

POD、CAT和SOD保護(hù)酶共同構(gòu)成植物組織活性氧清除系統(tǒng)，保障植物組織活性氧處于動(dòng)態(tài)平衡，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)免受低溫的破壞，保障植物的抗寒能力（Krasensky-Wrzaczek and Jonak，2012）。本研究中POD、CAT和SOD保護(hù)酶呈先升后降的變化趨勢(shì)，與吳海寧等（2013）的研究結(jié)果類似，在低溫脅迫初期3種保護(hù)酶活性增強(qiáng)對(duì)植物體抵御低溫寒害起一定的作用（Javadian et al.，2010）。本研究中，除低溫處理0 d時(shí)，野鴉椿的葉片CAT活性低于圓齒野鴉椿外，其他各時(shí)間的脅迫處理野鴉椿的3種葉片酶活性圴高于圓齒野鴉椿。徐小軍等（2015）對(duì)26份甜瓜（）耐冷性相關(guān)生理指標(biāo)的綜合研究表明，抗寒性強(qiáng)的品種其保護(hù)酶活性亦較強(qiáng)。由此可見，野鴉椿抗性可能較圓齒野鴉椿強(qiáng)。同時(shí)，主成分分析表明，判別野鴉椿和圓齒野鴉椿抗寒性的生理指標(biāo)中，POD的重要性最高，與REC并列，可作為判定野鴉椿和圓齒野鴉椿抗寒性的生理指標(biāo)；CAT的重要性最低，表明其對(duì)野鴉椿和圓齒野鴉椿抗寒性的影響不大，不適合用來作為判定野鴉椿和圓齒野鴉椿抗寒性的生理指標(biāo)。

3.2 低溫脅迫對(duì)野鴉椿和圓齒野鴉椿滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

在本研究中，圓齒野鴉椿葉片SP含量總體呈先降后升再降的趨勢(shì)。低溫脅迫初期圓齒野鴉椿葉片SP含量的下降，可能是低溫脅迫初期，為適應(yīng)外界環(huán)境變化，糖的分解代謝增強(qiáng)所致（王一峰等，2019；劉鈺璽等，2020）。在大多數(shù)人的研究結(jié)果中，如林榕燕等（2021）對(duì)秋石斛（spp.）的抗寒性研究及黃麗芳等（2021）對(duì)咖啡的抗低溫脅迫研究均表明，SP含量隨著低溫脅迫的進(jìn)行而升高，且SP含量高的抗寒性強(qiáng)。而在本研究中，5 d后野鴉椿和圓齒野鴨椿葉片SP含量差異并不顯著，無法通過SP含量來判斷抗寒性強(qiáng)弱。因此，本研究中植物葉片SP含量可能與植物抗寒性關(guān)聯(lián)性不大。主成分分析中，葉片SP含量對(duì)判定野鴉椿和圓齒野鴉椿抗寒性的重要性排名也較低。綜合研究結(jié)果認(rèn)為，葉片SP含量不適合用作判定植野鴉椿和圓齒野鴉椿抗寒性的生理指標(biāo)。

本研究中，野鴉椿和圓齒野鴉椿的葉片Pro含量在低溫脅迫過程中均表現(xiàn)為先升后降，與謝雨萱等（2021）對(duì)自然越冬期不同姜花屬植物的抗寒性研究結(jié)果類似。低溫脅迫初期，Pro含量升高的原因可能是分解了復(fù)合蛋白，或增加了具有特殊作用的新蛋白質(zhì)（王兆，2014）。低溫脅迫后期葉片Pro含量降低至脅迫之初的水平，這可能與野鴉椿與圓齒野鴨椿逐漸適應(yīng)了該低溫環(huán)境有關(guān)。在本研究中，圓齒野鴉椿葉片Pro含量在低溫脅迫5 d后有所下降，但下降不明顯，基本維持在一個(gè)較高的水平，說明該植物在4 ℃的低溫條件下產(chǎn)生了逆境脅迫反應(yīng)。而野鴉椿Pro含量在低溫脅迫5 d后出現(xiàn)回落，表明野鴉椿對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)性強(qiáng)于圓齒野鴉椿。在判別野鴉椿和圓齒野鴉椿抗寒性的生理指標(biāo)的重要性排序中，葉片Pro僅次于POD和REC，因此適合用作野鴉椿和圓齒野鴉椿抗寒性的判定。

3.3 低溫脅迫對(duì)野鴉椿和圓齒野鴉椿細(xì)胞膜透性的影響

植物的抗寒性越強(qiáng)，在低溫條件下受到的損傷越小，MDA含量越低（Gu，1999）。黃麗芳等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，不同咖啡（）葉片中MDA含量的變化幅度與其抗寒性呈負(fù)相關(guān)。本研究表明，圓齒野鴉椿葉片MDA含量在低溫脅迫處理前10 d變化不明顯，10 d后顯著上升；而野鴉椿葉片MDA含量在低溫脅迫初期顯著下降，之后其變化幅度較小，且野鴉椿的MDA含量始終低于圓齒野鴉椿。由此可見，野鴉椿的抗寒性比圓齒野鴉椿更強(qiáng)。在主成分分析中，MDA對(duì)野鴉椿和圓齒野鴉椿的抗寒性判定貢獻(xiàn)率較高，可用作篩選野鴉椿和圓齒野鴉椿抗寒性強(qiáng)弱的生理指標(biāo)。

本研究表明，野鴉椿和圓齒野鴉椿葉片REC均隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，與王搖寧等（2020）對(duì)樟（）的研究及李呈呈等（2021）對(duì)彩葉桂（‘Caiye Gui’）的研究結(jié)果一致；而鄭素蘭等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，姜荷花（）葉片REC與抗寒性呈反比，抗寒性較強(qiáng)的種類其REC低于抗寒性較弱的種類。本研究中野鴉椿的REC始終低于圓齒野鴉椿，說明野鴉椿的抗寒性優(yōu)于圓齒野鴉椿。因此，在判別野鴉椿和圓齒野鴉椿的抗寒性生理指標(biāo)重要性排序中，REC和POD并列第一，可用于野鴉椿和圓齒野鴉椿的抗寒育種篩選。

植物的抗寒性受多種因素及指標(biāo)影響。主成分分析是考察多個(gè)變量間相關(guān)性的一種多元統(tǒng)計(jì)方法，可從原始變量中導(dǎo)出少數(shù)幾個(gè)主成分，盡可能多地保留原始變量的信息，且彼此間互不相關(guān)作為新的綜合指標(biāo)（范宗民等，2020）；運(yùn)用隸屬函數(shù)法能較為科學(xué)地評(píng)價(jià)植物的抗寒性（陳小鳳等，2017；李瑞雪等，2017）。本研究利用主成分分析和隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評(píng)定，得出結(jié)果為野鴉椿幼苗抗寒性較圓齒野鴉椿更強(qiáng)；細(xì)胞膜透性對(duì)野鴉椿和圓齒野鴉椿的抗寒性強(qiáng)弱影響最大，其次是保護(hù)酶活性，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)二者的抗寒性強(qiáng)弱影響相對(duì)較小。

4 結(jié)論

POD、REC、Pro和MDA可用于野鴉椿和圓齒野鴉椿抗寒育種篩選，其中POD和REC對(duì)2個(gè)樹種的抗寒性強(qiáng)弱影響較大。此外，野鴉椿幼苗抗寒性遠(yuǎn)強(qiáng)于圓齒野鴉椿，可考慮將野鴉椿作為砧木對(duì)圓齒野鴉椿進(jìn)行嫁接，提高圓齒野鴉椿的抗寒性。