徐琳杰,李夢(mèng)雅,許 凱,徐 燕,紀(jì)德華,王文磊,陳昌生,謝潮添
(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,福建 廈門(mén) 361021)
大型海藻主要分布在潮間帶,接受的光照強(qiáng)度和波長(zhǎng)會(huì)隨著混合層深度及海水透光性的變化而發(fā)生改變。因此,大型海藻必須具備光適應(yīng)機(jī)制,以滿(mǎn)足自身對(duì)光照的需求。壇紫菜由葉狀體(配子體)和絲狀體(孢子體)兩個(gè)世代構(gòu)成異形世代交替生活史,兩個(gè)世代在形態(tài)及生活環(huán)境等方面都差異顯著[7]。在自然環(huán)境中,絲狀體生長(zhǎng)在低潮區(qū)或潮下帶的貝殼等石灰?guī)r基質(zhì)的內(nèi)部,葉狀體附著在中高潮區(qū)的巖礁上生長(zhǎng)[8]。這種生活環(huán)境的差異表明壇紫菜的兩個(gè)世代對(duì)光強(qiáng)的要求可能不同[9]。為此,研究人員分析了光強(qiáng)對(duì)壇紫菜生長(zhǎng)的影響[10-12]:在50 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下,壇紫菜葉狀體的生長(zhǎng)和光合速率都高于絲狀體;當(dāng)光強(qiáng)高于100 μmol·m-2·s-1時(shí),壇紫菜絲狀體生長(zhǎng)受到抑制;而在550 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下,葉狀體生長(zhǎng)速率沒(méi)有受到顯著抑制。
壇紫菜生長(zhǎng)的基礎(chǔ)是光合作用,即以光能為能量來(lái)源,吸收無(wú)機(jī)碳并合成有機(jī)物。理論上光與無(wú)機(jī)碳利用的關(guān)系非常緊密,但以往研究并不認(rèn)可這一點(diǎn)[13]。為此,本研究擬分析壇紫菜葉狀體及絲狀體在不同光照條件下生長(zhǎng)和無(wú)機(jī)碳利用上的差異。本研究擬通過(guò)室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),分析在10,50,500 μmol·m-2·s-1三種光強(qiáng)下,壇紫菜光合速率、生長(zhǎng)、色素、無(wú)機(jī)碳吸收速率和碳酸酐酶活性等應(yīng)答光照強(qiáng)度的變化,有利于進(jìn)一步了解壇紫菜光合生理及無(wú)機(jī)碳利用的差異。
實(shí)驗(yàn)材料為壇紫菜Z-61品系,由集美大學(xué)壇紫菜團(tuán)隊(duì)通過(guò)雜交方法選育獲得,以自由絲狀體形式保存在福建省壇紫菜種質(zhì)資源庫(kù)。藻體培養(yǎng)溫度為21 ℃,光周期為12 L∶12 D,光照強(qiáng)度為50 μmol·m-2·s-1,培養(yǎng)液每2 d更換一次,以保證生長(zhǎng)過(guò)程中有充足的營(yíng)養(yǎng)鹽。葉狀體培養(yǎng)至15 cm 左右,剪成2~3 cm長(zhǎng)的片段。絲狀體用茶漏匙收集。藻體用無(wú)菌紗布吸干表面水分備用。將藻體分別放入1 L培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)2 d(短期)和7 d(長(zhǎng)期),設(shè)置10,50,500 μmol·m-2·s-1三種光強(qiáng),每種處理設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。
將藻體放置于21 ℃溫度恒定的培養(yǎng)室內(nèi),暗處理15 min,隨后用Diving-PAM(Walz,Germany)分別測(cè)定絲狀體和葉狀體的光系統(tǒng) Ⅱ 最大光化學(xué)效率Fv/Fm,其飽和脈沖光強(qiáng)為8000 μmol·m-2·s-1。
采用黑白瓶法測(cè)定凈光合放氧速率。用紗布輕壓絲狀體和葉狀體去除表面的水分,稱(chēng)量其鮮重(WF)。然后將藻體放入玻璃溶氧瓶中,以不加藻體的作為空白瓶。白瓶置于對(duì)應(yīng)生長(zhǎng)光強(qiáng)下培養(yǎng)4 h。測(cè)定培養(yǎng)前后的溶解氧濃度。溶解氧測(cè)定方法參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB 7489—1987),用G20電位滴定儀(METTLER-TOLEDO)自動(dòng)檢測(cè)滴定終點(diǎn)并識(shí)別等當(dāng)點(diǎn)。白瓶和空白瓶的溶解氧差值用于計(jì)算凈光合速率。
參照Wilbur[14]的方法測(cè)定eCA及總碳酸酐酶(total CA)活性。取適量藻體稱(chēng)量鮮重(WF),并用無(wú)碳海水沖洗三遍。無(wú)碳海水的配置方法:加入鹽酸使新鮮海水培養(yǎng)基的pH值小于3,在冰浴條件下,充氮?dú)?30 min,隨后加入Tris試劑使最終質(zhì)量濃度為6 g·L-1,繼續(xù)充氮?dú)?0 min,然后添加NaOH將海水pH值調(diào)整為8.1。將漂洗后的藻體放入5 mL無(wú)碳海水中,迅速加入2.5 mL CO2飽和海水,立即計(jì)時(shí),記錄混合液pH值從8.1降到7.2的時(shí)間(T藻樣)。同時(shí)記錄不加藻體的無(wú)碳海水pH值下降時(shí)間(T空白),并依照公式E(eCA)=(T空白÷T藻樣-1)÷WF計(jì)算eCA的活性E(eCA)。
對(duì)于總碳酸酐酶活性,取適量藻體,用2 mL無(wú)CO2海水研磨粉碎,將1 mL勻漿與4 mL無(wú)碳海水及2.5 mL CO2飽和海水迅速于燒杯中混合。記錄T藻樣和T空白,并依照公式E(total CA)=(T空白÷T藻樣-1)÷(0.5×WF)計(jì)算總碳酸酐酶的活性E(tatal CA)。
用紗布吸掉藻體表面水分,稱(chēng)其鮮重。取3份藻體置于55 ℃烘箱中烘2 h,稱(chēng)其干重(WD)。測(cè)定藻體的含水率(WC)。
參照J(rèn)ensen[15]的方法測(cè)定葉綠素a(Chla)含量。將藻體在4 ℃的90%(體積分?jǐn)?shù))丙酮中研磨粉碎,將組織勻漿放入50 mL(V)磨口瓶中。室溫下,遮光萃取24 h,離心后取上清液,用分光光度計(jì)測(cè)定其在666 nm和730 nm處的吸光度值(A)。Chla質(zhì)量比(mg/g)的計(jì)算公式為:w(Chla)=(A666-A730)×10V÷890×[WF(1-WC)]。
參照高洪峰[16]的方法測(cè)定藻膽蛋白含量。將藻體在4 ℃的0.05 mol·L-1PBS(pH=6.8)緩沖液中研磨粉碎。將組織勻漿放入-20 ℃冰箱冷凍,待完全冷凍后取出放置在室溫下解凍,反復(fù)凍融6次,然后于4 ℃冰箱中過(guò)夜。離心后取上清液,用分光光度計(jì)測(cè)定其在565,615,650,615,730 nm處的吸光度值(A)。每克藻體中藻紅蛋白(PE)、藻藍(lán)蛋白(PC)、別藻藍(lán)蛋白(APC)質(zhì)量比w(mg/g)的計(jì)算公式[16]為:
w(PE)=[0.123(A565-A730)-0.068(A615-A730)+0.015(A650-A730)]×V÷[WF(1-WC)],
w(PC)=[0.162(A615-A730)-0.001(A565-A730)-0.098(A650-A730)]×V÷[WF(1-WC)],
w(APC)=[0.171(A650-A730)-0.006(A565-A730)-0.004(A615-A730)]×V÷[WF(1-WC)]。
配置不同無(wú)機(jī)碳濃度的海水:往無(wú)碳海水中加入NaHCO3,配制無(wú)機(jī)碳濃度為0,0.05,0.1,0.5,1,2,4,10 mmol·L-1的海水。取適量藻體置于不同無(wú)機(jī)碳濃度海水中,培養(yǎng)4 h,測(cè)量10,50,500 μmol·m-2·s-1三種光照強(qiáng)度下的放氧速率。通過(guò)Michaelis-Menten方程v=vmax×[s]/(Km+[s]),求得最大光合速率(vmax)。其中:[s]為無(wú)機(jī)碳濃度;v為該無(wú)機(jī)碳濃度下的凈光合速率;Km為最大光合速率一半時(shí)的無(wú)機(jī)碳濃度。
用紗布吸干藻體表面水分,稱(chēng)量培養(yǎng)前后藻體鮮重,分別記為WF0、WFt。計(jì)算比生長(zhǎng)速率μ的公式為:μ=(lnWFt-lnWF0)÷t,其中t為培養(yǎng)時(shí)間(d)。
用t檢驗(yàn)、單因素方差分析和雙因素方差分析法,分析光強(qiáng)對(duì)壇紫菜兩個(gè)世代的影響和差異。設(shè)定顯著性差異為P<0.05,極顯著差異為P<0.001,所用軟件為SPSS statistics 22.0。
三種光強(qiáng)下,葉狀體的Fv/Fm均明顯高于絲狀體(P<0.05,見(jiàn)圖1)。其中,在10 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下,差異極顯著(P<0.001)。隨著光強(qiáng)的增加,絲狀體和葉狀體的Fv/Fm都明顯下降,即與光強(qiáng)呈負(fù)相關(guān)。在500 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下,葉狀體與絲狀體的Fv/Fm降幅都超過(guò)了55%。
培養(yǎng)時(shí)間相同時(shí),光強(qiáng)升高可以增大藻體的凈光合速率,并且葉狀體比絲狀體的增幅更大(見(jiàn)圖2)。與10 μmol·m-2·s-1相比,光強(qiáng)提高到500 μmol·m-2·s-1,葉狀體和絲狀體凈光合速率分別增加2.8和7.1以上。無(wú)論培養(yǎng)2 d或7 d,在10 μmol·m-2·s-1下,葉狀體與絲狀體的凈光合速率沒(méi)有明顯差異(P>0.05);提高光強(qiáng)后,葉狀體凈光合速率均顯著高于絲狀體(P<0.05)。
如圖3所示,壇紫菜葉狀體和絲狀體的光合放氧速率都先隨無(wú)機(jī)碳濃度(DIC)的升高而增加,趨近飽和后不再增加。無(wú)論培養(yǎng)2 d或7 d,光強(qiáng)為50,500 μmol·m-2·s-1時(shí),葉狀體的凈光合速率總是極顯著高于絲狀體(P<0.001)。這說(shuō)明壇紫菜絲狀體的光補(bǔ)償點(diǎn)比葉狀體低,更容易達(dá)到飽和。
如表1所示,絲狀體和葉狀體的最大光合速率(vmax)隨光照強(qiáng)度顯著增加(P<0.001),說(shuō)明光照強(qiáng)度可以影響壇紫菜的光合固碳能力。在50 μmol·m-2·s-1及500 μmol·m-2·s-1的光強(qiáng)下,無(wú)論培養(yǎng)2 d或7 d,絲狀體的vmax無(wú)顯著差異(P>0.05)。隨光強(qiáng)的增加,葉狀體vmax逐漸大于絲狀體,尤其在500 μmol·m-2·s-1下,葉狀體的vmax極顯著高于絲狀體(P<0.001),達(dá)到6倍以上,說(shuō)明壇紫菜不同世代對(duì)無(wú)機(jī)碳的利用能力存在較大差異。
表1 三種光強(qiáng)下壇紫菜的
不論培養(yǎng)2 d或7 d,絲狀體和葉狀體的Chla含量隨光照強(qiáng)度的增加而呈極顯著降低(P<0.001)。絲狀體和葉狀體中, PE含量在38~65 mg·g-1范圍內(nèi),遠(yuǎn)高于其他色素。葉狀體PE含量隨光強(qiáng)的增加而降低(P<0.05);但在絲狀體中,PE含量?jī)H在培養(yǎng)7 d下與光強(qiáng)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。整體而言,光強(qiáng)對(duì)PC和APC含量的影響較小(P>0.05)。僅在培養(yǎng)7 d后,葉狀體中PC含量與光強(qiáng)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)(見(jiàn)圖4)。
由圖5所示,培養(yǎng)2 d或7 d,total CA和eCA活性均與光強(qiáng)呈正相關(guān)(P<0.001)。與10 μmol·m-2·s-1相比,在500 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下,葉狀體和絲狀體的total CA和eCA活性增幅均超過(guò)40%。在10 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下培養(yǎng)7 d,total CA存在世代差異(P<0.05),但在其他光照與培養(yǎng)時(shí)間下,壇紫菜的total CA和eCA均無(wú)顯著的世代差異(P>0.05)(見(jiàn)圖5)。
如圖6可見(jiàn),壇紫菜絲狀體和葉狀體的生長(zhǎng)對(duì)光強(qiáng)的響應(yīng)存在差異。培養(yǎng)2 d或7 d,葉狀體生長(zhǎng)和光強(qiáng)均呈正相關(guān),相比于10 μmol·m-2·s-1,在500 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下葉狀體的生長(zhǎng)增加670%以上(P<0.001)。而絲狀體截然相反,相比于10 μmol·m-2·s-1,在500 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下培養(yǎng)2 d,絲狀體的生長(zhǎng)降低了90%(P<0.001)。在50,500 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下培養(yǎng),壇紫菜的生長(zhǎng)存在明顯的世代差異(P<0.05),尤其在500 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下培養(yǎng)2 d,葉狀體的比生長(zhǎng)速率μ比絲狀體高了近42倍。然而,在10 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下培養(yǎng)7 d,絲狀體μ比葉狀體高了近5倍。
藻體對(duì)無(wú)機(jī)碳的利用會(huì)影響光合速率,因此最大光合速率vmax是判斷藻類(lèi)無(wú)機(jī)碳親和力的重要參數(shù)。本研究結(jié)果表明,隨著無(wú)機(jī)碳濃度的提高,壇紫菜絲狀體的vmax比葉狀體更容易達(dá)到峰值,表明葉狀體對(duì)無(wú)機(jī)碳利用能力更強(qiáng)(見(jiàn)圖3)。此外,葉狀體與絲狀體的vmax均與光強(qiáng)呈正相關(guān)(見(jiàn)表1),這與Takashi[20]在衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)中的研究結(jié)果相一致,這表明光強(qiáng)可以影響CCM。凈光合速率是碳捕獲能力的最終體現(xiàn)。本研究中,相比于光強(qiáng)10 μmol·m-2·s-1,壇紫菜在光強(qiáng)500 μmol·m-2·s-1下培養(yǎng)2 d和7 d后,絲狀體和葉狀體的凈光合放氧速率提高至2.8倍和7.1倍(見(jiàn)圖2)。這些結(jié)果說(shuō)明光強(qiáng)的增加可以提高無(wú)機(jī)碳的利用能力,從而對(duì)壇紫菜的光合作用產(chǎn)生促進(jìn)效果。
綜上,壇紫菜兩個(gè)世代的無(wú)機(jī)碳利用對(duì)光強(qiáng)的應(yīng)答存在明顯差異。
光是影響大型海藻生長(zhǎng)的重要環(huán)境因素之一,光強(qiáng)變化會(huì)影響藻類(lèi)的光合作用、色素合成、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累及生長(zhǎng)速率[21]。Fv/Fm是一種準(zhǔn)確、靈敏的光響應(yīng)檢測(cè)指標(biāo),能反映藻體受到光抑制的程度[22]。在強(qiáng)光下,能量過(guò)載和對(duì)PS Ⅱ的損傷是Fv/Fm降低的主要原因[23]。在本研究中,隨著光強(qiáng)的增加,壇紫菜的兩個(gè)世代Fv/Fm均逐漸降低,說(shuō)明強(qiáng)光對(duì)葉狀體和絲狀體的光合系統(tǒng)均產(chǎn)生抑制作用(見(jiàn)圖1)。高等植物會(huì)改變捕光色素的濃度和比例,在強(qiáng)光下減少色素含量以減弱光抑制,而在弱光下提高色素含量以提高捕光效率[23-24]。壇紫菜的捕光色素不僅有葉綠素,還有大分子藻膽蛋白。本研究發(fā)現(xiàn),隨著光照增加,壇紫菜Chla和PE含量顯著降低,但PC和APC含量沒(méi)有顯著變化(見(jiàn)圖4)。這說(shuō)明壇紫菜的色素對(duì)光強(qiáng)的應(yīng)答比高等植物更復(fù)雜。Harb等[25]發(fā)現(xiàn),增加光強(qiáng),紅藻擬雞毛菜(Pterocladiellacapillacea)的PC含量減少,但Chla和APC含量沒(méi)有明顯變化,而PE含量是先增加后減少。龍須菜(Gracilarialemaneiformis)隨光強(qiáng)的增加,PC和Chla含量不變,而PE及APC含量減少[26]。由此可知,壇紫菜、龍須菜和擬雞毛菜三種紅藻對(duì)光的響應(yīng)并不相同。
光合作用是光合生物干物質(zhì)積累的基礎(chǔ),因此決定了經(jīng)濟(jì)海藻的產(chǎn)量[27]。但是不適宜的光強(qiáng)會(huì)抑制或減弱光合作用,從而抑制植株的生長(zhǎng)。趙振魯?shù)萚28]和Wang等[3]通過(guò)對(duì)蟲(chóng)黃藻(Symbiodiniumvoratum)、綠藻(Botryococcusbraunii)的研究發(fā)現(xiàn),藻體生長(zhǎng)速率隨光強(qiáng)增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。研究[10-12,29]表明,壇紫菜葉狀體比絲狀體更喜強(qiáng)光,但兩個(gè)世代來(lái)自不同的品系。本研究中,通過(guò)比較來(lái)自同一品系的葉狀體和絲狀體,發(fā)現(xiàn):相較于光強(qiáng)50 μmol·m-2·s-1,高光強(qiáng)500 μmol·m-2·s-1下絲狀體的生長(zhǎng)速率降低了90%,而葉狀體則升高了38%;低光強(qiáng)10 μmol·m-2·s-1下,絲狀體生長(zhǎng)速率下降了25%,葉狀體卻下降了85%(見(jiàn)圖6)。這說(shuō)明強(qiáng)光對(duì)壇紫菜葉狀體生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,但抑制絲狀體生長(zhǎng);壇紫菜絲狀體更適應(yīng)低光,而葉狀體更適應(yīng)高光,兩個(gè)世代的光合作用和生長(zhǎng),以及對(duì)光強(qiáng)的應(yīng)答存在明顯差異。
綜上所述,壇紫菜兩個(gè)世代對(duì)光強(qiáng)的應(yīng)答在無(wú)機(jī)碳利用、光合作用以及生長(zhǎng)上存在差異。壇紫菜的生長(zhǎng)速率不完全與光化學(xué)反應(yīng)和固碳效率相一致。因此,在壇紫菜高產(chǎn)新品系的選育與評(píng)估時(shí),生長(zhǎng)速率才是衡量產(chǎn)量的重要指標(biāo),凈光合速率只能作為輔助參考。在壇紫菜絲狀體育苗、葉狀體養(yǎng)殖以及種質(zhì)保存期間,應(yīng)選擇適宜的光照強(qiáng)度進(jìn)行培育以滿(mǎn)足生產(chǎn)需求。