生物納米孔道單分子多肽磷酸化識別與測量的創(chuàng)新綜合實(shí)驗(yàn)

胡正利，辛凱莉，劉少創(chuàng)，鐘誠兵，武雪原，應(yīng)佚倫,2，孔璇鳳，余曉冬，張劍榮，龍億濤,＊

1南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023

2南京大學(xué)化學(xué)和生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，南京 210023

3南京大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518057

實(shí)驗(yàn)教學(xué)是化學(xué)學(xué)科培養(yǎng)學(xué)生專業(yè)學(xué)習(xí)和實(shí)踐能力的重要組成部分，有助于學(xué)生在提升實(shí)驗(yàn)操作技能的同時(shí)加深對相關(guān)基礎(chǔ)理論知識的理解以及科學(xué)應(yīng)用?！翱平倘诤稀钡慕虒W(xué)改革模式注重將前沿科研成果轉(zhuǎn)化為特色教學(xué)內(nèi)容，并融入大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)課堂?？蒲信c教學(xué)相輔相成，能夠增強(qiáng)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和發(fā)掘?qū)W生的科研潛力，是新時(shí)代“推動科研反哺教學(xué)”和推進(jìn)創(chuàng)新型專業(yè)人才培養(yǎng)的有效途徑[1,2]。單分子科學(xué)致力于通過分子個(gè)體異質(zhì)性測量研究在分子層面上揭示生物、化學(xué)基本作用原理和反應(yīng)機(jī)制，已逐漸發(fā)展成為生物、化學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域的熱點(diǎn)前沿[3-7]。然而，目前國內(nèi)分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容多為針對大量分子群體行為的測量，很少涉及單分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)。因此，填補(bǔ)單分子技術(shù)在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)上的空白，具有重要的教學(xué)意義。目前，單分子測量技術(shù)引入實(shí)驗(yàn)教學(xué)的主要困難在于缺少成本低、便攜式的教學(xué)儀器設(shè)備以及適配的教學(xué)方案。

生物納米孔道技術(shù)是一種利用單分子電流信號的差異進(jìn)行待測物區(qū)分和分子間相互作用研究的單分子分析方法，具有操作簡單、高靈敏、高分辨、無需標(biāo)記等優(yōu)勢，被認(rèn)為是最具潛力的第三代單分子測序技術(shù)之一[8,9]。1996年，α-溶血素(α-Hemolysin)生物納米孔道被用于DNA單分子檢測[10]，自此以來，生物納米孔道技術(shù)已經(jīng)在核酸測序[11]、DNA損傷檢測[12,13]、蛋白質(zhì)測序[14-17]與構(gòu)象解析[18-20]以及單分子反應(yīng)監(jiān)測[21-24]等方面取得了重要進(jìn)展。經(jīng)過不斷優(yōu)化迭代，便攜式電化學(xué)微弱電流測量儀器及配套的數(shù)據(jù)軟件性能也日益完善，確保了本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟谟邢薜慕虒W(xué)空間和教學(xué)時(shí)間內(nèi)順利完成。例如，筆者課題組自主研發(fā)了Cube電化學(xué)測量儀器及SmartNanopore系列數(shù)據(jù)記錄軟件[25-28]，儀器主要包括集成化信號處理主機(jī)以及裝配有前置電流放大器探頭的法拉第屏蔽箱，兩者尺寸分別僅為12 cm × 12 cm × 8 cm和7.5 cm × 5.5 cm × 12.5 cm，法拉第屏蔽箱可極大地消除周圍環(huán)境的電磁噪音干擾，使其能夠在常規(guī)實(shí)驗(yàn)教室進(jìn)行納米孔道實(shí)驗(yàn)教學(xué)；自主開發(fā)了PyNanoLab數(shù)據(jù)處理軟件(https://www.pynanolab.com/)，能夠?qū)崿F(xiàn)從原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入到結(jié)果圖表繪制的全過程、快速處理分析，大大縮短了納米孔道實(shí)驗(yàn)教學(xué)所需的時(shí)間，可以充分滿足實(shí)驗(yàn)教學(xué)需求。因此，筆者團(tuán)隊(duì)在多年從事納米孔道單分子研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了利用生物納米孔道電化學(xué)技術(shù)測量單個(gè)生物分子的綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)，主要包括課前基礎(chǔ)知識講解、儀器和實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)、學(xué)生自主實(shí)驗(yàn)以及頭腦風(fēng)暴環(huán)節(jié)四部分內(nèi)容，旨在以興趣為導(dǎo)向，激勵(lì)學(xué)生主動學(xué)習(xí)、自由討論和自主創(chuàng)新。該實(shí)驗(yàn)以氣單胞菌溶素(Aerolysin)生物納米孔道檢測單個(gè)生物分子為實(shí)驗(yàn)范例，于2019年依托南京大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心開設(shè)試行，并根據(jù)教學(xué)實(shí)踐不斷改進(jìn)和完善，獲得了良好的教學(xué)效果[29]。由于單分子檢測靈敏度和分辨率主要取決于生物納米孔道測量界面的物理化學(xué)性質(zhì)[30-35]，本實(shí)驗(yàn)選擇使用突變型T232K/K238Q Aerolysin生物納米孔道檢測多肽磷酸化，模型分子是Tau蛋白微管結(jié)合區(qū)域的多肽片段，Tau蛋白磷酸化與多種神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茲海默癥)相關(guān)。隨著納米孔道單分子DNA測序的基本實(shí)現(xiàn)，近年來，準(zhǔn)確還原蛋白質(zhì)“原貌”，實(shí)現(xiàn)多肽/蛋白質(zhì)測序及其翻譯后修飾檢測逐漸成為生物納米孔道研究熱點(diǎn)，但是要真正達(dá)到實(shí)際應(yīng)用的目的仍有諸多問題需要解決[36,37]。因此，本實(shí)驗(yàn)兼具綜合性和前沿性，能夠很好地展現(xiàn)納米孔道單分子技術(shù)和前沿科學(xué)研究的魅力，較好地達(dá)到培養(yǎng)學(xué)生的科研興趣、團(tuán)隊(duì)合作和科學(xué)素養(yǎng)的教學(xué)目的。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

(1) 了解納米孔道電化學(xué)單分子檢測的原理和方法；

(2) 掌握磷脂雙分子層和蛋白納米孔道的制備技術(shù)；

(3) 熟悉微弱電化學(xué)信號測量系統(tǒng)的使用要點(diǎn)；

(4) 熟悉單分子微弱電流信號的數(shù)據(jù)處理；

(5) 通過單分子多肽磷酸化檢測研究，培養(yǎng)學(xué)生的科研思維和解決問題的能力。

2 實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)采用的生物納米孔道技術(shù)是一種通過解析單個(gè)分子引起的孔道內(nèi)離子電流的特征性變化，在單分子水平上獲取待測物信息的檢測方法。如圖1所示，該方法的關(guān)鍵步驟是在垂直伸展的雙分子層磷脂膜上自組裝形成單個(gè)Aerolysin生物納米孔道，該孔道作為唯一通道執(zhí)行孔道兩側(cè)溶液中的分子離子轉(zhuǎn)運(yùn)[38,39]。實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要在檢測池兩個(gè)腔室內(nèi)分別灌注500 μL的1.0 mol·L?1的Tris-KCl溶液，隨后加入待測多肽，在電壓驅(qū)動下多肽分子逐一通過單個(gè)Aerolysin納米孔道，改變流經(jīng)孔道限域空間的離子流，產(chǎn)生皮安培級、(亞)毫秒級的單分子離子電流阻斷信號。不同多肽分子由于其電荷、分子量、構(gòu)象等存在差異，導(dǎo)致其在通過納米孔道時(shí)將產(chǎn)生不同的特征離子電流信號，通過分析這些單分子信號的形狀、電流幅值和阻斷時(shí)間等特征，即可實(shí)現(xiàn)單分子多肽的區(qū)分。

圖1 突變型T232K/K238Q Aerolysin生物納米孔道檢測Tau多肽磷酸化的原理示意圖

在測量微弱電流過程中，環(huán)境電磁及儀器中存在的噪音會影響電流信號，從而導(dǎo)致較微弱的單分子信號被埋沒在噪音中。因此，本實(shí)驗(yàn)中選用了課題組研發(fā)的Cube 3.0納米孔道儀器裝置，使用法拉第屏蔽箱進(jìn)行噪音屏蔽、采用電阻反饋式的微弱電流放大系統(tǒng)來記錄并采集電流信號。

3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

3.1 實(shí)驗(yàn)試劑

1,2-二植烷?；字?DPhPC)購自Avanti Polar Lipids Inc.試劑公司；正癸烷(無水，≥ 99%)、氯化鉀(≥ 99.5%)和胰蛋白酶均購自Sigma-Aldrich試劑公司；乙二胺四乙酸(EDTA，99.995%)、三羥甲基氨基甲烷(Tris，≥ 99.9%)和異丙醇(≥ 99.7%)均購自阿拉丁試劑公司；濃鹽酸(36.0%-38.0%)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。待測多肽由南京金斯瑞生物科技有限公司合成純化(圖2)，未修飾多肽序列為N’-VQIVYKPVDLS-C’ (Tau306-316)，磷酸化多肽序列為N’-VQIVYKPVDLpS-C’ (pTau306-316)，使用電解液作為溶劑現(xiàn)配現(xiàn)用，濃度為1.0 mmol·L?1。T232K/K238Q Aerolysin蛋白溶液(1.5 μg·mL?1)由筆者課題組制備提供。如沒有特殊說明，所有購買試劑均為分析純并且使用時(shí)未經(jīng)過進(jìn)一步純化。實(shí)驗(yàn)用超純水由美國Millipore公司的Milli-Q純水儀制備得到，所有實(shí)驗(yàn)溶液均用超純水(25 °C時(shí)電阻率為18.2 MΩ·cm?1)配制。

圖2 多肽質(zhì)譜表征圖

為節(jié)約教學(xué)時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)需要用到的30 mg·mL?1磷脂正癸烷溶液、1%的正十六烷-正己烷溶液、1.0 mol·L?1Tris-KCl電解質(zhì)溶液(pH 8.0)均由助教提前準(zhǔn)備。本文所有實(shí)驗(yàn)均在室溫(25 ± 2 °C)條件下完成。

3.2 實(shí)驗(yàn)儀器

銀/氯化銀電極；納米孔道檢測池，由聚四氟乙烯薄膜隔開的兩個(gè)腔室組成，薄膜中間有一個(gè)直徑為50 μm左右的圓形微孔；Cube 3.0納米孔道電化學(xué)測量儀器，包括配套的SmartNanopore數(shù)據(jù)記錄軟件；PyNanoLab數(shù)據(jù)處理軟件為筆者所在實(shí)驗(yàn)室研制。根據(jù)教學(xué)需要，上述儀器裝置筆者課題組均可提供。

4 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

4.1 儀器參數(shù)設(shè)置

(1) 分別使用音頻線連接Cube 3.0儀器主機(jī)與電流放大器探頭、USB數(shù)據(jù)線連接Cube 3.0儀器主機(jī)與電腦，打開電流放大器探頭供電電池開關(guān)；

(2) 依次開啟Cube 3.0儀器及SmartNanopore軟件，單擊軟件左上角的“Connect to Device (連接設(shè)備)”連接儀器與軟件，單擊軟件左上角電池圖標(biāo)連接儀器主機(jī)與電流放大器探頭(圖3)；

圖3 Cube儀器裝置圖與SmartNanopore數(shù)據(jù)記錄軟件界面

(3) 設(shè)置儀器實(shí)驗(yàn)參數(shù)，具體如下：Format(模式)為V2，Sampling Rate (采樣頻率)為100 kHz，Bessel Filter (貝塞爾濾波)為5 kHz，Gain (增益)為?1；

(4) 單擊軟件面板左上第一個(gè)“Conf. (設(shè)置)”，依次設(shè)置“Rec. Path (數(shù)據(jù)保存路徑)”“File name(文件名稱)”并勾選“AutoNum (自動編號)”，如文件名設(shè)為211027，該次實(shí)驗(yàn)記錄的第一個(gè)和第二個(gè)數(shù)據(jù)文件會依次自動保存為211027000.dat和211027001.dat；

(5) 單擊“Data Acq. (數(shù)據(jù)獲取)”窗口的“Start (開始)”，運(yùn)行程序。將“Volt. Command (電壓命令)”窗口的電壓值設(shè)為0 mV，單擊“auto (自動)”，將電壓自動校準(zhǔn)至0 mV，可從CH2窗口的右上方實(shí)時(shí)讀取電壓值；

(6) 電壓校準(zhǔn)完成后，在“Data Acq. (數(shù)據(jù)獲取)”窗口，單擊“auto (自動)”，將電流自動校準(zhǔn)至0 pA，可從CH1窗口的右上方實(shí)時(shí)讀取電流值和RMS值(基線噪音的均方根值)，一般情況下RMS值應(yīng)小于1 pA。

4.2 磷脂雙分子層膜的制備與表征

(1) 使用移液器抽取少量(1.0-2.0 μL)正十六烷-正己烷溶液，移液器吸頭貼近檢測池的聚四氟乙烯薄膜，將烷烴溶液輕輕旋涂在薄膜兩側(cè)微孔附近，隨后靜置10-15分鐘，使正己烷充分揮發(fā)；

(2) 檢測池放入法拉第屏蔽箱內(nèi)，分別向池子兩個(gè)腔室加入500 μL的Tris-KCl電解質(zhì)溶液，并將一對Ag/AgCl電極的一端分別浸入檢測池兩側(cè)的電解質(zhì)溶液中，另一端與放大器探頭相連，指定cis端電極接地。此時(shí)，檢測池兩側(cè)的電解質(zhì)溶液通過薄膜上的微孔連通，軟件面板顯示電流為溢出狀態(tài)；

(3) 電壓設(shè)置為0 mV，分別在檢測池兩個(gè)腔室液面上方附近懸空滴加2.0 μL的磷脂溶液，靜置3-5分鐘，等待磷脂分子分散平鋪在氣液界面；

(4) 電壓調(diào)整為+100 mV，用1 mL注射器緩慢地上下提拉cis或trans腔室中的電解質(zhì)溶液，磷脂分子在檢測池微孔處聚集形成穩(wěn)定的磷脂雙分子層膜，此時(shí)電流顯示為0 pA；

(5) 調(diào)整電壓，若在+300 - +400 mV范圍內(nèi)電流溢出，則說明磷脂膜破裂；應(yīng)立刻重新提拉溶液成膜，在此情況下大多數(shù)新成的膜是強(qiáng)度合適的雙分子層磷脂膜，可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

4.3 AeroIysin生物納米孔道的構(gòu)建與表征

(1) 電壓調(diào)整為+200 mV，向薄膜cis側(cè)靠近微孔處的溶液中緩慢加入1.0 μL的T232K/K238Q Aerolysin蛋白溶液，等待3-5分鐘，若觀察到離子電流突然從0 pA階躍至約110 pA，表明磷脂膜上自組裝形成了單個(gè)T232K/K238Q Aerolysin納米孔道，迅速調(diào)整電壓為+100 mV以防形成多孔；

(2) 單擊“REC. (記錄)”，從0 mV到+160 mV以及0 mV到?160 mV，每隔10 mV記錄10-15秒數(shù)據(jù)，再次單擊“REC. (記錄)”完成記錄，用于后續(xù)I-V表征孔道；

(3) 電壓調(diào)整為+100 mV，記錄2分鐘，同上，分別在+80 mV、+90 mV、+110 mV和+120 mV記錄2分鐘，用做后續(xù)空白對照。

4.4 未修飾與磷酸化Tau多肽的檢測識別

(1) 電壓調(diào)整為+100 mV，向薄膜cis側(cè)溶液中緩慢加入15.0 μL的Tau306-316或pTau306-316多肽溶液，在+80到+120 mV范圍內(nèi)，每隔10 mV分別記錄3-5分鐘，確保每個(gè)電壓下單分子事件數(shù)量在1000以上；

(2) 電壓調(diào)整為+100 mV，向薄膜cis側(cè)溶液中緩慢加入15.0 μL的pTau306-316多肽溶液，同上述步驟相同，獲得足夠的單分子事件；

(3) 結(jié)束后，依次關(guān)閉軟件和斷開儀器；

(4) 取出檢測池并將溶液轉(zhuǎn)移至專用廢液缸，無需拆分，直接依次使用超純水、異丙醇和超純水沖洗檢測池兩個(gè)腔室，洗好吹干后置于自封袋內(nèi)妥善保存；

(5) 參照上述4.1-4.4步驟，重復(fù)實(shí)驗(yàn)兩次。

4.5 納米孔道單分子多肽數(shù)據(jù)處理與分析

(1) 讀取不同電壓下的電流數(shù)值，繪制I-V曲線并計(jì)算電導(dǎo)，表征納米孔道的性質(zhì)；

(2) 打開PyNanoLab軟件(圖4)，導(dǎo)入原始數(shù)據(jù)并設(shè)置相應(yīng)參數(shù)，自動逐個(gè)識別并提取單分子事件的殘余電流(Current或I)、阻斷電流(ΔI)、殘余電流程度(I/I0)、阻斷時(shí)間(toff或tD)等信息和相關(guān)統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖表，包括阻斷電流、阻斷時(shí)間、間隔時(shí)間的直方圖以及阻斷電流-阻斷時(shí)間散點(diǎn)圖等；

圖4 PyNanoLab軟件數(shù)據(jù)處理界面

(3) 根據(jù)直方圖的高斯或指數(shù)擬合結(jié)果，獲取各相應(yīng)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)平均值，誤差為三次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，繪制阻斷時(shí)間與電壓的關(guān)系圖。

本實(shí)驗(yàn)中，分別定義：開孔電流(I0)為孔道內(nèi)無分子時(shí)的基線電流幅值；阻斷電流(ΔI)為單個(gè)分子在孔道內(nèi)時(shí)造成的電流變化；殘余電流(I)為開孔電流與阻斷電流的差值；殘余電流程度(I/I0)為殘余電流與開孔電流的比值；阻斷時(shí)間(toff或tD)為單分子阻斷事件的持續(xù)時(shí)間。

5 結(jié)果與討論

5.1 單個(gè)生物納米孔道的I-V表征

如圖5所示，T232K/K238Q Aerolysin納米孔道表現(xiàn)出非對稱I-V曲線，表明由于非對稱孔道結(jié)構(gòu)以及非均勻分布的孔道測量界面電荷，導(dǎo)致納米孔道對正負(fù)離子的選擇性輸運(yùn)差異，從而出現(xiàn)整流現(xiàn)象。計(jì)算可得，在+100 mV和?100 mV時(shí)，T232K/K238Q Aerolysin納米孔道整流比R= |I+|/|I?|為1.70 ± 0.08。在0到+160 mV范圍內(nèi)，計(jì)算獲得相應(yīng)的孔道電導(dǎo)G=I/V為0.58 ± 0.02 nS。

圖5 突變型T232K/K238Q Aerolysin生物納米孔道的I-V曲線

5.2 單分子多肽阻斷電流與阻斷時(shí)間分析

使用T232K/K238Q Aerolysin納米孔道分別檢測pTau306-316和Tau306-316多肽，實(shí)時(shí)記錄單分子電流響應(yīng)，可以觀察到pTau306-316單分子特征事件的阻斷時(shí)間(toff)明顯大于Tau306-316 (圖6a)。如圖6b所示，使用一組對應(yīng)的(I/I0，log(toff))描述每一個(gè)單分子事件，根據(jù)橫縱坐標(biāo)范圍按照100 × 100劃分區(qū)域，統(tǒng)計(jì)落在每個(gè)區(qū)域內(nèi)的單分子事件個(gè)數(shù)作為Counts，據(jù)此對整幅圖填充相應(yīng)的顏色，得到log(toff)-I/I0的二維(2D)直方圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pTau306-316單分子事件主要分布在P1和P2兩個(gè)區(qū)域范圍內(nèi)，P2區(qū)域事件的阻斷時(shí)間較長且單分子事件的殘余電流程度(I/I0)分布集中；而Tau306-316單分子事件主要分布在P1區(qū)域內(nèi)，阻斷時(shí)間大多在1 ms以下。進(jìn)一步，圖6c將I/I0按照橫坐標(biāo)0.0-1.0范圍等分為100個(gè)子區(qū)間，統(tǒng)計(jì)每個(gè)I/I0子區(qū)間內(nèi)的單分子事件數(shù)量作為縱坐標(biāo)Counts，得到100組(I/I0，Counts)，繪制I/I0的一維統(tǒng)計(jì)直方圖。分析可得，pTau306-316和Tau306-316的阻斷電流程度也存在一定的差異，pTau306-316單分子事件在P2區(qū)域的I/I0= 0.46 ± 0.01。由此可知，pTau306-316和Tau306-316兩種多肽在納米孔道內(nèi)的動態(tài)行為具有顯著差異。推測是由于絲氨酸磷酸化增加了pTau306-316的帶電量，改變了其與T232K/K238Q Aerolysin納米孔道測量界面氨基酸殘基之間的靜電相互作用。

圖6 pTau306-316和Tau306-316多肽的阻斷電流信號特征圖(a)；log(toff)-I/I0 2D直方圖(b)和I/I0統(tǒng)計(jì)直方圖(c)

5.3 單分子多肽穿孔行為解析

為了探究單分子多肽的動態(tài)行為與過孔機(jī)制，進(jìn)一步考察了pTau306-316和Tau306-316兩種多肽的阻斷時(shí)間與外加電壓的依賴關(guān)系。結(jié)果顯示，在80-120 mV范圍內(nèi)，隨著電壓的升高，pTau306-316的阻斷時(shí)間呈現(xiàn)增加的趨勢(圖7a)，而Tau306-316的阻斷時(shí)間則基本不變(圖7b)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[40]，兩種多肽的動態(tài)行為模式不同。負(fù)電性較強(qiáng)的pTau306-316所受外加電場的驅(qū)動力更大，更容易被捕獲，隨后被捕獲的多肽向著孔道trans側(cè)前進(jìn)，直至受到較強(qiáng)阻力后被迫退出孔道，返回到cis側(cè)溶液中(圖7c)。與pTau306-316 (pI = 3.84)不同，Tau306-316 (pI = 5.82)在pH 8.0條件下基本不帶電[31]，在cis側(cè)與孔道碰撞之后，幾乎不進(jìn)入孔道，更傾向于繼續(xù)在溶液中隨機(jī)運(yùn)動，故其阻斷時(shí)間隨電壓無明顯變化(圖7d)，產(chǎn)生了單個(gè)分子在孔口的碰撞信號。因此，通過納米孔道單分子實(shí)驗(yàn)，不僅可以得到單分子水平的阻斷電流和阻斷時(shí)間特征等，還能夠獲得單個(gè)分子的動態(tài)行為信息，這與整體測量方法(如質(zhì)譜)相比，能夠幫助學(xué)生們更好地理解分子個(gè)體的異質(zhì)性并激發(fā)他們探索微觀世界的熱情。

圖7 兩種多肽的阻斷時(shí)間-電壓依賴性關(guān)系圖和動態(tài)行為解析示意圖

5.4 多肽混合樣品的納米孔道單分子檢測

依次添加Tau306-316、pTau306-316兩種多肽，實(shí)時(shí)監(jiān)控T232K/K238Q Aerolysin納米孔道的電流響應(yīng)變化。如圖8所示，在添加多肽樣品前，記錄得到的開孔電流基線幾乎無背景信號；當(dāng)加入Tau306-316時(shí)，觀察到了阻斷時(shí)間很短的脈沖型的單分子電流阻斷信號；緊接著加入pTau306-316，出現(xiàn)了阻斷時(shí)間較長、阻斷電流幅值比較均一的臺階型的單分子特征信號，這與單一樣品檢測結(jié)果一致。綜上，T232K/K238Q Aerolysin納米孔道能夠用于多肽磷酸化的單分子測量，通過進(jìn)一步優(yōu)化孔道界面與待測物分子的相互作用特性，未來有望實(shí)現(xiàn)多種多肽/蛋白質(zhì)翻譯后修飾的同時(shí)識別。納米孔道單分子檢測研究通常使用特征事件頻率來定量表征待測物濃度，由于課堂時(shí)間有限，綜合考慮實(shí)驗(yàn)教學(xué)目的以及教學(xué)量，將分析物定量檢測內(nèi)容作為拓展實(shí)驗(yàn)部分，布置給感興趣的學(xué)生課堂外進(jìn)一步思考和探索。

圖8 T232K/K238Q Aerolysin納米孔道實(shí)時(shí)檢測多肽混合物

6 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

(1) 添加磷脂溶液時(shí)，移液器的吸頭不要伸入檢測池液面以下；

(2) 溶液提拉速度會影響磷脂成膜質(zhì)量，應(yīng)緩慢提起并慢慢放掉溶液；

(3) 檢測池中磷脂溶液的濃度會影響磷脂膜的厚度，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況，適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)磷脂溶液的添加量；

(4) 電壓過高容易導(dǎo)致出現(xiàn)多個(gè)生物納米孔道，當(dāng)形成單個(gè)孔道后，應(yīng)立即將電壓降低至100 mV以下；

(5) 孔道蛋白活性影響成孔難易程度，由于不同批次蛋白的活性可能存在差異，可通過調(diào)節(jié)添加蛋白的濃度或體積，確保磷脂膜上僅形成單個(gè)生物納米孔道；

(6) 清洗檢測池時(shí)，提醒學(xué)生戴好口罩、手套及護(hù)目鏡。

7 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與組織運(yùn)行方式

本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括儀器操作、磷脂膜制備、納米孔道構(gòu)建、數(shù)據(jù)處理分析等，重點(diǎn)和難點(diǎn)是在平面的雙分子層磷脂膜上構(gòu)建單個(gè)生物納米孔道。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)長為每周5學(xué)時(shí)，共4周。依據(jù)教學(xué)要求和教學(xué)目標(biāo)，精心設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，共分為4部分，通過4個(gè)階段完成實(shí)驗(yàn)，具體如下：

(1) 第1周，介紹納米孔道技術(shù)原理及研究進(jìn)展，使學(xué)生系統(tǒng)性地了解納米孔道技術(shù)的發(fā)展歷程與應(yīng)用前景，調(diào)動學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情，啟發(fā)學(xué)生查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，探究納米孔道電化學(xué)領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)與機(jī)遇，培養(yǎng)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題與解決問題的能力；

(2) 第2周，講解并演示納米孔道電化學(xué)測量儀器操作與單分子實(shí)驗(yàn)方法。結(jié)合教學(xué)視頻幫助學(xué)生了解整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，指導(dǎo)學(xué)生認(rèn)真學(xué)習(xí)從儀器設(shè)置到磷脂膜制備、孔道構(gòu)建以及單分子檢測等每一步實(shí)驗(yàn)操作，幫助學(xué)生在實(shí)驗(yàn)實(shí)踐過程中加深對相關(guān)基礎(chǔ)理論知識的理解和運(yùn)用；

(3) 第3周，學(xué)生分組協(xié)作獨(dú)立完成生物納米孔道單分子檢測實(shí)驗(yàn)并學(xué)習(xí)數(shù)據(jù)處理。學(xué)生分工合作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，幫助學(xué)生提取解析單分子數(shù)據(jù)的電流、時(shí)間特征，并與質(zhì)譜手段等獲取的溶液中大量分子的平均測量結(jié)果進(jìn)行對比，在單分子水平上更好地理解分子的動態(tài)行為，培養(yǎng)學(xué)生團(tuán)隊(duì)合作意識并充分調(diào)動學(xué)生自主學(xué)習(xí)的積極性；

(4) 第4周，頭腦風(fēng)暴與自由討論。鼓勵(lì)學(xué)生大膽提出實(shí)驗(yàn)設(shè)想并分享對“納米孔道電化學(xué)”的新認(rèn)知，通過“模擬科研”的方式，發(fā)掘?qū)W生的科研潛能并培養(yǎng)其創(chuàng)新思維，旨在建立實(shí)驗(yàn)教學(xué)與科學(xué)研究之間的聯(lián)系，為學(xué)生今后的專業(yè)課學(xué)習(xí)和科研工作打下基礎(chǔ)。

該實(shí)驗(yàn)課程適用于小班教學(xué)，每次面向10-15名本科生授課，按照學(xué)號排序，每2-3名學(xué)生組建成1個(gè)實(shí)驗(yàn)小組，教師及助教引導(dǎo)學(xué)生合理分工，合作完成實(shí)驗(yàn)課程的全部內(nèi)容。為了全面考查學(xué)生的學(xué)習(xí)情況和動手、思考、交流以及團(tuán)隊(duì)合作能力等，課程考核以小組為單位，內(nèi)容涵蓋綜述論文、實(shí)驗(yàn)操作、實(shí)驗(yàn)報(bào)告和小組匯報(bào)4個(gè)部分，通過評估每位學(xué)生在論文寫作、實(shí)驗(yàn)實(shí)踐、結(jié)果分析與PPT匯報(bào)等方面的課堂整體表現(xiàn)，制定最終成績，其中科研綜述論文撰寫占比20%，實(shí)驗(yàn)操作占比20%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)報(bào)告占比30%，研究方案設(shè)計(jì)與分組匯報(bào)占比30%。在往期實(shí)驗(yàn)課程中，> 90%的學(xué)生小組都能夠完成實(shí)驗(yàn)并收集到課程要求的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中善于發(fā)現(xiàn)與解決問題，結(jié)合實(shí)驗(yàn)實(shí)踐在頭腦風(fēng)暴與自由討論階段大膽提出進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)設(shè)想，包括基于生物納米孔道的核苷類藥物代謝反應(yīng)監(jiān)測、單分子多肽/蛋白質(zhì)構(gòu)象研究以及納米孔道光電檢測等[29]。根據(jù)學(xué)生反饋意見以及科研進(jìn)展情況，教學(xué)團(tuán)隊(duì)及時(shí)總結(jié)分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)中遇到的問題，綜合考慮實(shí)驗(yàn)難度和課程前沿性，改善和優(yōu)化教學(xué)方案。近幾年，單分子多肽/蛋白質(zhì)檢測和測序逐漸成為納米孔道電化學(xué)領(lǐng)域的研究前沿，教學(xué)團(tuán)隊(duì)將這一熱點(diǎn)融入到實(shí)驗(yàn)教學(xué)，設(shè)計(jì)了“生物納米孔道檢測單分子多肽磷酸化”的實(shí)驗(yàn)教學(xué)方案。在前期教學(xué)團(tuán)隊(duì)課題組本科學(xué)生中的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，本科二年級和四年級學(xué)生以及研究生新生均能很快獨(dú)立完成生物納米孔道檢測多肽的實(shí)驗(yàn)，表明該實(shí)驗(yàn)具有高度的可行性，對于不同院校根據(jù)自身研究特色制定合適教學(xué)方案具有重要的參考意義。

8 結(jié)語

在當(dāng)今的后基因組時(shí)代，納米孔道電化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)逐漸發(fā)展為單分子多肽/蛋白質(zhì)的檢測和測序，磷酸化、乙酰化、甲基化等蛋白質(zhì)翻譯后修飾是其重要研究內(nèi)容。筆者在制定實(shí)驗(yàn)方案時(shí)，將興趣為導(dǎo)向、學(xué)生為中心作為指導(dǎo)思想，綜合考慮了實(shí)驗(yàn)的可操作性、創(chuàng)新性以及學(xué)生的適應(yīng)性和接受度，確保實(shí)驗(yàn)具有適度的挑戰(zhàn)性，能夠增強(qiáng)學(xué)生的學(xué)習(xí)信心和科研熱情，充分發(fā)揮“科教融合”對教學(xué)改革和高素質(zhì)人才培養(yǎng)的重要促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)利用突變型T232K/K238Q Aerolysin生物納米孔道檢測多肽磷酸化，研究對象為絲氨酸磷酸化的Tau多肽，其與阿爾茲海默癥等多種退行性疾病相關(guān)。由于磷酸化增加了絲氨酸的負(fù)電性并改變了其體積，突變型T232K/K238Q Aerolysin納米孔道232位點(diǎn)正電荷的增加可增強(qiáng)靜電相互作用，而238位點(diǎn)谷氨酰胺的引入則增加了分子過孔能壘，因此，能夠很好地應(yīng)對因多肽過孔速度太快而難以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確測量的難題。本實(shí)驗(yàn)原理簡單、現(xiàn)象明確，便于學(xué)生理解和掌握，具有較強(qiáng)的可設(shè)計(jì)性和推廣價(jià)值，不局限于多肽磷酸化檢測，允許拓展DNA損傷識別、蛋白構(gòu)象研究、生物標(biāo)志物檢測、離子選擇性測量等內(nèi)容[41-47]。此外，MinION、Orbit Mini、eONE等商品化儀器設(shè)備以及α-Hemolysin等商業(yè)化孔道蛋白也可應(yīng)用于納米孔道實(shí)驗(yàn)教學(xué)，不同院校可根據(jù)具體情況選擇合適的教學(xué)方案。在前期教學(xué)過程中，很多學(xué)生表示這是第一次接觸單分子實(shí)驗(yàn)，希望以后有機(jī)會能夠參與相關(guān)課題研究，進(jìn)一步了解納米孔道電化學(xué)及其交叉領(lǐng)域前沿進(jìn)展。這充分表明了將具有重大應(yīng)用前景的科學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)化為本科教學(xué)內(nèi)容，實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)與前沿研究并軌，對于培養(yǎng)學(xué)生的綜合創(chuàng)新能力和推動“全面的化學(xué)教育”具有重要教學(xué)意義。

致謝：感謝研究生牛紅艷和霍明珠的助教工作、張琳琳對納米孔道儀器的調(diào)試和維護(hù)，以及本科學(xué)生劉宇航、儲文浩參與突變型生物納米孔道的實(shí)驗(yàn)。