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    外源褪黑素對(duì)菜用大豆殘留百菌清和多菌靈降解的影響

    2022-09-03 08:53:22陳秋森陳鳳瓊劉漢林褚霈宇王華美任春元趙強(qiáng)曹亮于高波張玉先
    關(guān)鍵詞:菜用百菌多菌靈

    陳秋森,陳鳳瓊,劉漢林,褚霈宇,王華美,任春元,趙強(qiáng),曹亮,于高波,張玉先

    (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),黑龍江 大慶,163319)

    菜用大豆又稱毛豆,是豆科大豆屬的栽培大豆種,屬于特用大豆[1,2]。作為世界上最大的菜用大豆生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó),中國(guó)的菜用大豆栽培面積不斷增加,其病蟲害也頻繁發(fā)生,嚴(yán)重影響了我國(guó)菜用大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)[3,4]。目前防治病蟲害的有效方式仍以施用農(nóng)藥為主。然而,由于菜用大豆是采收鮮莢,直接剝粒食用,農(nóng)藥的不當(dāng)使用會(huì)給人們的身體健康帶來巨大的隱患,同時(shí)對(duì)生態(tài)環(huán)境也有不利影響[5],各國(guó)對(duì)菜用大豆農(nóng)藥殘留也都有嚴(yán)格要求[6]。因此,減少菜用大豆的農(nóng)藥殘留已成為保障菜用大豆產(chǎn)品質(zhì)量和食用安全的基本要求,同時(shí)也是提高菜用大豆出口合格率的重要措施。

    多菌靈和百菌清是常見的殺菌劑,可有效防治菜用大豆灰斑病、莢枯病、根腐病等真菌性病害的發(fā)生,廣泛應(yīng)用于菜用大豆的生產(chǎn)[7],然而過量或不合理使用多菌靈和百菌清極易造成菜用大豆的農(nóng)藥殘留問題。因此,降低菜用大豆中多菌靈和百菌清殘留在大豆生產(chǎn)中具有重要的科學(xué)和現(xiàn)實(shí)意義。

    褪黑素是一種廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的多效性分子[8],在干旱、低溫、鹽堿等非生物脅迫中均具有積極的調(diào)控作用[9]。近年來,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),褪黑素在降解植物農(nóng)藥殘留中也具有重要作用。陳媛媛等[10]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素能夠緩解甜瓜幼苗三唑酮毒害的生理效應(yīng)。而Wei 等[11]研究也表明,褪黑素處理還可以提高蘋果對(duì)百草枯的耐受性。此外,近年來表達(dá)褪黑素合成相關(guān)基因被認(rèn)為可提高植物抗逆性,在擬南芥、水稻、番茄等植物中均已得到驗(yàn)證[12~14]。但是關(guān)于褪黑素對(duì)菜用大豆殘留殺菌劑的降解是否具有調(diào)控效應(yīng)鮮有報(bào)道。因此,本研究以菜用大豆為材料,以多菌靈和百菌清為殺菌劑,探究外源褪黑素處理對(duì)菜用大豆殘留殺菌劑降解的調(diào)控效應(yīng),以期為后續(xù)大豆農(nóng)藥殘留降解的研究和促進(jìn)殘留農(nóng)藥代謝試劑的開發(fā)應(yīng)用提供必要的理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    菜用大豆品種浙鮮12,由國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心提供;褪黑素(C13H16N2O2),購自Sigma Aldrich公司。

    1.2 試驗(yàn)處理

    試驗(yàn)于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生物技術(shù)中心人工氣候室進(jìn)行,盆栽,基質(zhì)為草炭土和蛭石(3∶1),播種前選取色澤均勻、顆粒飽滿、大小一致的種子,用5%的次氯酸鈉消毒,于2020 年5 月6 日進(jìn)行播種,播種后常規(guī)管理。待菜用大豆生長(zhǎng)至R3 期(初莢期,2020年7月3日)進(jìn)行處理與取樣。

    將植株隨機(jī)分為4組:①百菌清處理:使用蒸餾水連續(xù)噴施3 d,第4 d噴施有效濃度為11.2 mmol/L的百菌清;②百菌清+褪黑素處理:100μmol/L 褪黑素進(jìn)行葉面噴施,連續(xù)處理3 d,第4 d噴施有效濃度為11.2 mmol/L 的百菌清;③多菌靈處理:使用蒸餾水連續(xù)噴施3 d,第4 d噴施有效濃度為13.1 mmol/L的多菌靈;④多菌靈+褪黑素處理:100μmol/L 的褪黑素進(jìn)行葉面噴施,連續(xù)處理3 d,第4 d噴施有效濃度為13.1 mmol/L 的多菌靈溶液。于殺菌劑處理24 h 后取樣,部分保存于-20℃,用于生理生化指標(biāo)的測(cè)定,部分保存于-80℃,用于基因表達(dá)量的測(cè)定。農(nóng)藥處理7 d 后取樣,-20℃保存用于測(cè)定農(nóng)藥殘留量。

    1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

    1.3.1 農(nóng)藥殘留量 參照任曉萍等[15]的方法測(cè)定菜用大豆葉片中百菌清殘留量,參照郝露露等[16]的方法測(cè)定菜用大豆葉片中多菌靈殘留量。

    1.3.2 氧化損傷指標(biāo) 采用硫代巴比妥酸法[17]測(cè)定菜用大豆葉片中丙二醛(MDA)含量,參考劉俊等[18]的方法測(cè)定菜用大豆葉片中過氧化氫(H2O2)含量。

    1.3.3 抗氧化系統(tǒng) 采用比色法[19]測(cè)定菜用大豆葉片中的抗壞血酸(AsA)含量,參考Ma 等[20]的方法測(cè)定菜用大豆葉片中的還原型谷胱甘肽(GSH)含量,采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶(POD)活性,采用紫外吸收法測(cè)定過氧化氫酶(CAT)活性和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性[21]。1.3.4 解毒系統(tǒng) 參考Sharma 等[22]的方法測(cè)定菜用大豆葉片中的非蛋白結(jié)合態(tài)巰基(NPT)含量,采用試劑盒方法測(cè)定(購自睿信生物科技有限公司)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測(cè)定菜用大豆葉片中解毒相關(guān)基因(P450、GST22和ABC-C3)表達(dá)量[23]。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    所得數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,并采用利用SPSS 21.0 軟件對(duì)各處理間顯著性進(jìn)行分析,最終利用Origin 2019軟件繪制圖表。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 外源褪黑素處理對(duì)菜用大豆體內(nèi)農(nóng)藥殘留量的影響

    如圖1A 所示,經(jīng)褪黑素預(yù)處理后,菜用大豆葉片中多菌靈和百菌清殘留量均顯著降低。其中百菌清殘留量為單獨(dú)農(nóng)藥處理的56%,多菌靈殘留量為單獨(dú)農(nóng)藥處理的84%。非蛋白結(jié)合態(tài)巰基(NPT)主要包括谷胱甘肽及其共軛物和代謝產(chǎn)物。如圖1B 所示,與單獨(dú)多菌靈和百菌清處理相比,外源褪黑素預(yù)處理后菜用大豆葉片中NPT 含量均顯著上升,說明外源褪黑素處理有效地促進(jìn)菜用大豆中NPT的形成,增強(qiáng)多菌靈和百菌清的降解代謝,減少菜用大豆體內(nèi)的農(nóng)藥殘留含量。

    圖1 外源褪黑素處理后菜用大豆葉片中農(nóng)藥殘留量(A)和NPT含量(B)Fig.1 Pesticide residue(A)and NPT content(B)under exogenous melatonin treatment on vegetable soybean leaves

    2.2 外源褪黑素處理對(duì)菜用大豆體內(nèi)GSH-AsA途徑的影響

    外源褪黑素處理影響菜用大豆葉片中GSH 和AsA的含量(圖2)。在多菌靈和百菌清處理下,外源褪黑素預(yù)處理可顯著提高菜用大豆中GSH(圖2A)和AsA(圖2B)含量。其中,與單獨(dú)百菌清處理相比,褪黑素預(yù)處理后菜用大豆中GSH和AsA含量分別上升24.1%和72.5%;與單獨(dú)多菌靈處理相比,褪黑素預(yù)處理后菜用大豆中GSH和AsA含量分別上升40.5%和34.7%。由此可見,外源褪黑素處理可以通過提高GSH和AsA含量促進(jìn)GSH-AsA循環(huán),進(jìn)而促進(jìn)菜用大豆中殘留多菌靈和百菌清的降解。

    圖2 外源褪黑素處理后菜用大豆葉片中GSH(A)和AsA含量(B)Fig.2 GSH(A)and AsA content(B)under exogenous melatonin treatment on vegetable soybean leaves

    2.3 外源褪黑素處理對(duì)菜用大豆體內(nèi)抗氧化酶活性的影響

    外源褪黑素預(yù)處理可顯著提高菜用大豆葉片中抗氧化酶活性(圖3)。與單獨(dú)百菌清處理相比,褪黑素預(yù)處理后菜用大豆葉片中SOD 活性(圖3A)和CAT 活性(圖3C)均顯著上升,且分別上升14.5%和25.4%,而菜用大豆中POD 活性卻有所下降(圖3B),APX活性則無顯著性差異(圖3D);與單獨(dú)多菌靈處理相比,預(yù)處理褪黑素后菜用大豆中SOD、POD、CAT 和APX 活性均顯著上升,其中SOD 活性提高最為顯著,比單獨(dú)多菌靈處理提高了4.5倍(圖3A),其次為POD 活性,比單獨(dú)多菌靈處理提高了102.2%(圖3B),而CAT 活性和APX 活性則分別提高了92.3%和38.7%(圖3C、D)。由此可見,外源噴施褪黑素可顯著增強(qiáng)菜用大豆中抗氧化酶活性,促進(jìn)活性氧的清除,進(jìn)而緩解農(nóng)藥處理造成的細(xì)胞損傷,降低菜用大豆體內(nèi)的農(nóng)藥殘留。

    圖3 外源褪黑素處理下菜用大豆葉片中抗氧化酶活性Fig.3 Antioxidant enzyme activitiesunder exogenous melatonin treatment onvegetable soybean leaves

    2.4 外源褪黑素處理對(duì)菜用大豆體內(nèi)MDA 和H2O2含量的影響

    外源褪黑素預(yù)處理對(duì)菜用大豆葉片中MDA 和H2O2含量的影響如圖4所示。在多菌靈和百菌清處理下,通過外源褪黑素預(yù)處理可顯著降低菜用大豆中MDA 含量(圖4A)。與單獨(dú)百菌清和多菌靈處理相比,預(yù)處理褪黑素可使菜用大豆中MDA含量分別降低了8.5%和8.9%??梢娡庠赐屎谒靥幚砜梢酝ㄟ^降低菜用大豆中MDA含量,從而抑制細(xì)胞膜脂過氧化程度的增加,緩解農(nóng)藥脅迫下菜用大豆細(xì)胞受到的損傷。此外,外源褪黑素預(yù)處理后,大豆體內(nèi)H2O2含量也顯著性降低(圖4B),與單獨(dú)百菌清處理相比,外源褪黑素預(yù)處理使菜用大豆體內(nèi)H2O2含量降低13.6%,與單獨(dú)多菌靈處理相比,預(yù)處理褪黑素使菜用大豆體內(nèi)H2O2含量降低8.0%。這說明外源褪黑素處理可通過直接清除菜用大豆體內(nèi)活性氧來緩解農(nóng)藥對(duì)植株造成的氧化損傷,進(jìn)而促進(jìn)大豆體內(nèi)殘留農(nóng)藥的降解代謝。

    圖4 外源褪黑素處理后菜用大豆葉片中MDA(A)和H2O2(B)含量Fig.4 MDA(A)and H2O2(B)contents under exogenous melatonin treatment on vegetable soybean leaves

    2.5 外源褪黑素處理對(duì)菜用大豆體內(nèi)解毒系統(tǒng)的影響

    細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是植物體內(nèi)重要的解毒酶,可以有效緩解農(nóng)藥處理對(duì)植物造成的損傷。外源褪黑素預(yù)處理影響菜用大豆體內(nèi)解毒系統(tǒng)(圖5)。經(jīng)外源褪黑素預(yù)處理后,菜用大豆葉片中解毒基因表達(dá)量顯著上升。與單獨(dú)百菌清處理相比,預(yù)處理褪黑素后菜用大豆葉片中P450和GST22的相關(guān)基因表達(dá)量顯著上調(diào),其中P450相關(guān)基因表達(dá)量為單獨(dú)百菌清處理的14.5倍(圖5A),GST22相關(guān)基因表達(dá)量為單獨(dú)百菌清處理的1.3 倍(圖5B)。而ABC-C3相關(guān)基因表達(dá)量經(jīng)褪黑素預(yù)處理后反而低于單獨(dú)百菌清處理(圖5C),為此我們測(cè)定了菜用大豆葉片中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性進(jìn)行驗(yàn)證(圖5D),其結(jié)果與相關(guān)基因表達(dá)量變化趨勢(shì)一致。與單獨(dú)多菌靈處理相比,外源褪黑素預(yù)處理后菜用大豆葉片中P450、GST22和ABC-C3相關(guān)基因表達(dá)量均顯著上調(diào),且分別比單獨(dú)多菌靈處理上調(diào)了182.2%、141.9%和413.4%(圖5A、B、C),此外,經(jīng)褪黑素預(yù)處理后ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性也比單獨(dú)多菌靈處理提高了36.2%(圖5D)。由此可見,外源褪黑素處理可調(diào)控菜用大豆中解毒基因的表達(dá),進(jìn)而提高解毒酶活性,促進(jìn)菜用大豆體內(nèi)多菌靈和百菌清的代謝,從而降解菜用大豆中的農(nóng)藥殘留。

    圖5 外源褪黑素處理后菜用大豆解毒系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.5 Expression of genes related to detoxification system of vegetable soybean treated with exogenous melatonin

    3 討論

    對(duì)于植物來說,農(nóng)藥是一種異源物質(zhì),高劑量的農(nóng)藥導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生,這些活性氧具有高度的活性和毒性,最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激,對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[24]。Kanwar等[25]研究發(fā)現(xiàn),外源褪黑素處理使番茄中的活性氧含量顯著降低,提高了作物對(duì)雙酚A 的解毒作用。在本研究中,預(yù)處理外源褪黑素降低了殺菌劑處理下菜用大豆中H2O2的含量,從而緩解了殺菌劑對(duì)菜用大豆造成的細(xì)胞毒性??梢娡庠赐屎谒靥幚砜赏ㄟ^直接清除菜用大豆體內(nèi)的活性氧,從而有效緩解農(nóng)藥處理對(duì)菜用大豆造成的氧化損傷,提高菜用大豆對(duì)農(nóng)藥的耐受性。同時(shí),在外源褪黑素處理下,菜用大豆中MDA 含量也顯著降低,說明外源褪黑素可有效抑制菜用大豆的膜脂過氧化,降低農(nóng)藥處理對(duì)菜用大豆造成的細(xì)胞損傷。

    植物細(xì)胞及其細(xì)胞器如葉綠體、線粒體和過氧化物酶體等通過抗氧化防御系統(tǒng)保護(hù)自身免受活性氧的傷害。植物的抗氧化防御系統(tǒng)包括非酶抗氧化劑和抗氧化酶[26]。AsA-GSH 循環(huán)是非酶抗氧化劑防御的主要途徑,它們不僅可以直接清除一定范圍的ROS,而且在細(xì)胞質(zhì)和其他細(xì)胞器中維持氧化還原狀態(tài),從而增強(qiáng)抗氧化能力,并減少由不同的非生物脅迫引起的氧化應(yīng)激[27]。Fatma 等[28]研究發(fā)現(xiàn),芥菜中AsA、GSH 含量提高可通過清除活性氧緩解鹽脅迫帶來的傷害;Xia 等[29]研究發(fā)現(xiàn),外源褪黑素處理可以誘導(dǎo)干旱脅迫下獼猴桃中的AsAGSH 循環(huán)。在本研究中,多菌靈和百菌清處理下,外源褪黑素處理可以顯著提高菜用大豆中GSH 和AsA 含量,說明外源褪黑素處理可以通過調(diào)節(jié)AsA-GSH 循環(huán)清除菜用大豆體內(nèi)活性氧,從而減少菜用大豆在農(nóng)藥處理下受到的傷害,降低農(nóng)藥殘留量。

    逆境脅迫下,植物體內(nèi)的抗氧化酶活性顯著增強(qiáng),SOD、POD、CAT 和APX 是植物酶促防御系統(tǒng)的四種重要抗氧化酶,能有效分解活性氧自由基,從而減少植物在逆境脅迫中受到的傷害[30]。Li 等[31]研究表明,外源褪黑素處理可以提高鹽脅迫下西瓜體內(nèi)的抗氧化酶活性;張明聰?shù)萚32]研究發(fā)現(xiàn),外源褪黑素處理可以提高干旱脅迫下大豆體內(nèi)的抗氧化酶活性。在本研究中,外源褪黑素處理顯著提高了多菌靈處理下菜用大豆中4 種抗氧化酶(SOD、POD、CAT、APX)的活性,并且顯著提高了百菌清處理下菜用大豆中SOD 和CAT 的活性,從而促進(jìn)了活性氧的清除,緩解了菜用大豆在多菌靈和百菌清處理中受到的傷害,促進(jìn)了殘留百菌清和多菌靈的降解。

    褪黑素作為一種多效性分子,在植物體內(nèi)廣泛存在,可有效緩解植物面臨的多種非生物脅迫[33]。近年來,褪黑素在降解植物農(nóng)藥殘留中的作用引起了科研人員的廣泛研究。Ding 等[34]研究發(fā)現(xiàn),外源褪黑素處理可以有效提高楊樹對(duì)甲基紫精的耐受性,而Liu 等[35]研究也發(fā)現(xiàn),外源褪黑素處理可有效降低黃瓜中吡蟲啉的殘留量。此外,前人研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)植物遭受農(nóng)藥脅迫時(shí),激活自身解毒機(jī)制以緩解脅迫帶來的損傷[36]。植物的解毒過程可分為三個(gè)階段。第一階段是由細(xì)胞色素P450 催化的酶促反應(yīng)及非酶過程;第二階段主要是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)與糖基轉(zhuǎn)移酶等的軛合反應(yīng);在第三階段,代謝產(chǎn)物在ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控下被進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)外[37,38]。Yuan 等[39]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450 是生物體內(nèi)的重要代謝酶,能夠降解大多數(shù)外源有毒物質(zhì);而李冬琴等[40]研究證明,水稻中GST活性提高有利于緩解鎘脅迫帶來的傷害;此外,也有研究發(fā)現(xiàn),ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以提高植物對(duì)草甘膦的抗性[41]。本試驗(yàn)中,在百菌清處理下,外源褪黑素預(yù)處理可以顯著提高菜用大豆中P450、GST的相關(guān)基因表達(dá)量,但菜用大豆中ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因表達(dá)量經(jīng)褪黑素預(yù)處理后反而有所降低,因此,我們對(duì)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶活性進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果與ABC 相關(guān)基因表達(dá)量趨勢(shì)一致。而在多菌靈處理下,經(jīng)外源褪黑素預(yù)處理后菜用大豆中P450、GST、ABC的相關(guān)基因表達(dá)量均顯著提高。這說明百菌清處理下,外源褪黑素處理可以通過誘導(dǎo)一相和二相解毒相關(guān)基因的表達(dá)以促進(jìn)菜用大豆中殘留百菌清的降解;而在多菌靈處理下,外源褪黑素處理則可以通過誘導(dǎo)菜用大豆解毒過程三個(gè)階段的相關(guān)基因表達(dá)以促進(jìn)其殘留多菌靈的降解。本研究還發(fā)現(xiàn),通過外源褪黑素處理,菜用大豆中NPT 含量顯著上升,促進(jìn)了菜用大豆體內(nèi)殺菌劑的降解,有效降低了菜用大豆中多菌靈和百菌清的殘留量。這一結(jié)果與Liu 等研究發(fā)現(xiàn)的外源褪黑素可有效降低黃瓜中吡蟲啉殘留量的結(jié)果一致。

    4 結(jié)論

    外源褪黑素處理可以直接清除菜用大豆體內(nèi)的活性氧,緩解殺菌劑處理對(duì)菜用大豆的細(xì)胞損傷,也可以通過提高菜用大豆中GSH-AsA含量和抗氧化酶活性,從而促進(jìn)活性氧的清除,增強(qiáng)菜用大豆中殘留百菌清和多菌靈的代謝。與此同時(shí),在多菌靈和百菌清處理下,外源褪黑素預(yù)處理還可以通過誘導(dǎo)解毒相關(guān)基因的表達(dá),提高解毒酶活性,促進(jìn)菜用大豆中殘留多菌靈和百菌清的降解代謝。綜上所述,外源褪黑素處理可以有效緩解殺菌劑處理對(duì)菜用大豆受到的細(xì)胞損傷,促進(jìn)菜用大豆對(duì)殘留殺菌劑的解毒作用,從而降低菜用大豆中多菌靈和百菌清的殘留量。

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