細胞色素P450 2C19快代謝基因型缺血性卒中患者氯吡格雷抵抗的影響因素分析

尹書會 曹清禹 張倩 王默力

抗血小板聚集治療能降低缺血性卒中的復發(fā)率，其作為二級預防的策略已被指南明確推薦[1]。臨床中，有部分患者經(jīng)正規(guī)抗血小板聚集藥物治療后仍發(fā)生了復發(fā)缺血性腦血管事件。氯吡格雷是臨床常用的抗血小板聚集藥物，可有選擇、不可逆地阻斷腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，ADP)與血小板上的受體結(jié)合，從而抑制血小板聚集。該藥需經(jīng)肝臟細胞色素P450 2C19(cytochrome P450 2C19，CYP2C19)氧化后成為有活性的代謝產(chǎn)物，因此，CYP2C19的遺傳變異可能降低氯吡格雷的轉(zhuǎn)化效率。既往研究表明，CYP2C19的遺傳變異與氯吡格雷抵抗有關[2-4]，但也有研究認為二者的關系不肯定[5-7]。本研究團隊前期對251例缺血性卒中患者CYP2C19不同代謝型基因的血小板抑制水平進行比較，結(jié)果顯示其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)[8]，故本研究對CYP2C19快代謝基因型缺血性卒中患者的臨床資料進行分析，擬探討其與氯吡格雷抵抗的相關臨床因素。

1 對象與方法

1.1 對象

連續(xù)納入2014年5月至2019年2月首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的204例缺血性卒中患者進行回顧性分析，缺血性卒中的診斷符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》標準[9]，且均為需要服用氯吡格雷的CYP2C19快代謝型基因(CYP2C19*1/*1)。204 例患者中，男153 例，女51 例；年齡31～86 歲，平均(62±11)歲。本研究方案已獲得首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院倫理委員會批準[倫理號：臨研審(2017)011號]，患者或其家屬簽署了診療知情同意書。

1.2 納入與排除標準

納入標準：(1)漢族；(2)年齡≥18 歲；(3)距最近一次非心源性腦梗死≤1 個月；(4)卒中風險評估量表(essen stroke risk score，ESRS)評分≥3分[10]；(5)CYP2C19基因分型為快代謝型(CYP2C19*1/*1)[11]；(6)影像學及基線資料完整；(7)生命體征平穩(wěn)，依從性好。

排除標準：(1)對氯吡格雷過敏；(2)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和(或)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶大于正常值上限的2倍；(3)重度腎功能不全(內(nèi)生肌酐清除率<30 ml/min)；(4)血小板計數(shù)<100×109/L、白細胞計數(shù)<4.0×109/L；(5)入院前1個月內(nèi)活動性出血(顱內(nèi)出血、消化性潰瘍等)；(6)存在可能造成心源性栓塞的疾病(心房顫動、心臟瓣膜病、入院前4周內(nèi)心肌梗死、心室壁瘤形成等)；(7)患有其他系統(tǒng)疾病不能配合治療。

1.3 資料收集及藥物治療策略

收集并記錄入組患者的基線資料和實驗室檢測指標，基線資料包括年齡、性別、既往史(高血壓病、高脂血癥、糖尿病、冠心病)，實驗室檢測指標包括血常規(guī)、空腹血糖、糖化血紅蛋白、肝腎功能、血脂、尿酸、同型半胱氨酸等。

既往史的診斷依據(jù)為入院前已診斷或正在使用相關藥物，或入院時符合相應的診斷標準，分別為《中國高血壓防治指南(2018 年修訂版)》[12]、《中國成人血脂異常防治指南(2016 年修訂版)》[13]、《中國2型糖尿病防治指南(2020年版)》[14]、《穩(wěn)定性冠心病診斷與治療指南》[15]。

根據(jù)《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[9]，于確認后給予患者口服氯吡格雷(杭州賽諾菲公司，批號：5A797)75 mg/d，除阿司匹林腸溶片外，禁止使用其他抗血小板聚集藥物，并進行調(diào)脂、降壓、降糖等治療。連續(xù)服用氯吡格雷7 d，第8天晨起空腹抽取靜脈血，2 h內(nèi)完成血栓彈力圖血小板圖的檢測。實驗室指標均為入院次日晨起空腹靜脈血檢測所得。

1.4 基因測序方法

入院次日晨起抽取空腹靜脈血，使用CYP2C19基因檢測試劑盒(上海百傲科技有限公司生產(chǎn))，從外周血中提取基因組DNA。用CYP2C19基因特異引物，經(jīng)聚合酶鏈反應擴增后，將擴增產(chǎn)物與試劑盒(DNA微陣列芯片)雜交。使用BE-2.0生物芯片識讀儀分析圖像并判斷基因型。檢測的CYP2C19基因位點有*1/*1、*1/*2、*1/*3、*2/*2、*2/*3、*3/*3，利用CYP2C19基因檢測試劑，經(jīng)基因測序篩選出CYP2C19基因快代謝型(野生純合子CYP2C19 *1/*1)。

1.5 血小板抑制率檢測及分組標準

使用血栓彈力圖分析儀(型號：TEG5000，Haemoscope公司，美國)測定的數(shù)據(jù)計算血小板抑制率。由2 μmol/L ADP誘導的血小板抑制率<30%為氯吡格雷抵抗，血小板抑制率≥30%為氯吡格雷非抵抗[16]，分別分為氯吡格雷抵抗組和氯吡格雷非抵抗組。

由計算機軟件計算血小板抑制率，其計算方法[17]：血小板抑制率(%)=[1-(MAADP-MAfibrin)/(MAthrombin-MAfibrin)]×100%，其中MA為最大幅度，表示形成血凝塊的最大強度；MAADP為ADP誘導的血凝塊強度，包括纖維蛋白和服用氯吡格雷未被抑制的血小板；MAfibrin為纖維蛋白的血凝塊強度；MAthrombin為凝血酶誘導的血凝塊強度。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 基線資料和實驗室檢測指標比較

204 例CYP2C19快代謝型(CYP2C19*1*1)缺血性卒中患者中，氯吡格雷抵抗組65 例(31.9%)，氯吡格雷非抵抗組139例(68.1%)。氯吡格雷抵抗組女性、高血壓病史比例及白細胞計數(shù)均高于氯吡格雷非抵抗組，組間差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。兩組患者年齡、高脂血癥、糖尿病、冠心病、血小板計數(shù)、糖化血紅蛋白、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、空腹血糖、三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、尿酸、同型半胱氨酸的組間差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 兩組CYP2C19快代謝型缺血性卒中患者基線資料和實驗室檢測指標比較

2.2 氯吡格雷抵抗的影響因素分析

以氯吡格雷抵抗為因變量，將單因素分析中P<0.05的項目作為自變量納入二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，女性、既往高血壓病史、高白細胞計數(shù)均為發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨立危險因素(均P<0.05)。見表2。

表2 CYP2C19快代謝型缺血性卒中患者氯吡格雷抵抗的多因素Logistic回歸分析

3 討論

氯吡格雷是臨床常用的一種抗血小板聚集藥物，其抗血小板聚集效果存在差異。經(jīng)標準劑量氯吡格雷治療后，ADP誘導的血小板功能未達到有效抑制，稱為氯吡格雷抵抗[18]，也有研究將其稱為血小板高反應性，其發(fā)生率報道不一[19-20]。Jover等[19]對缺血性腦血管病患者服用氯吡格雷7 d后分別使用血小板功能分析儀、血管擴張刺激磷蛋白磷酸化法、光學比濁法、VerifyNow P2Y12測定法檢測血小板功能，結(jié)果顯示，治療后血小板高反應性占比分別為7/18、8/18、9/18、10/18，且治療后90 d與7 d的血小板高反應性占比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Fu等[20]對急性缺血性卒中患者服用氯吡格雷7 d后的血小板功能應用光學比濁法進行檢測，顯示仍有48.1%(63/131)的患者呈現(xiàn)血小板高反應性。Kinsella等[21]對服用氯吡格雷的短暫性腦缺血發(fā)作或缺血性卒中患者應用血小板功能分析儀檢測血小板功能，研究發(fā)現(xiàn)治療后血小板高反應性患者占比達92.0%(23/25)。上述研究對治療后血小板高反應性占比存在差異的原因可能與檢驗方法和評定標準不同有關，光學比濁法是檢驗血小板功能的“金標準”，但該方法的影響因素較多，穩(wěn)定性欠佳，可重復性差[22]。血栓彈力圖檢測血小板功能是近幾年常用的一種快速、可靠的檢測方法[23-25]。本研究利用血栓彈力圖檢測CYP2C19快代謝型(CYP2C19*1*1)缺血性卒中患者連續(xù)服用氯吡格雷7 d后的血小板功能，顯示氯吡格雷抵抗發(fā)生率為31.9%(65/204)。

除了藥物代謝酶的基因多態(tài)性對氯吡格雷療效的影響，氯吡格雷抑制血小板聚集的作用還可能受很多因素的影響，包括年齡[26-28]、性別[26-27，29]、吸煙[26]、體質(zhì)量指數(shù)[28，30]、高脂血癥[26，31]、高血壓病[32]、糖尿病[28,33-35]、糖耐量減低[36]、炎癥因子[27，34]、白細胞計數(shù)[27，31]、平均血小板體積[37]、糖化血紅蛋白[26]、同型半胱氨酸[31]、鈣通道阻滯劑[38-39]、質(zhì)子泵抑制劑[40]、苯二氮類藥物[30]等。既往研究多針對臨床因素及藥物代謝酶CYP2C19基因多態(tài)性對氯吡格雷抗血小板聚集藥物療效的影響，而本研究未對主要藥物代謝酶CYP2C19基因多態(tài)性的影響，僅納入了CYP2C19快代謝基因型(CYP2C19*1*1)的缺血性卒中患者，結(jié)果顯示，氯吡格雷抵抗組女性、高血壓病史比例及白細胞計數(shù)均高于氯吡格雷非抵抗組，組間差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，且進一步行多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，女性、高血壓病、高白細胞計數(shù)水平均是發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨立危險因素(均P<0.05)。

有研究表明，女性可能無法從抗血栓治療中獲得與男性相同的益處[41]。性別不同導致抗血小板聚集藥物效果不同的機制尚未完全清楚，Patti 等[42]研究表明，抗血小板聚集藥物效果不同的可能機制：血小板功能存在性別差異，包括血小板黏附或聚集分子機制的位點、血小板計數(shù)、血小板表面受體及結(jié)合的纖維蛋白原數(shù)量等均有差異，并且血管因素、凝血機制，甚至雌激素水平、體型等因素均可能參與其中。因此，女性缺血性卒中患者需要服用氯吡格雷時要考慮到可能出現(xiàn)的氯吡格雷抵抗風險，必要時監(jiān)測血小板抑制率。

目前，高血壓病史影響氯吡格雷抗血小板聚集藥物療效的機制尚未清楚。Nadar和Lip[43]認為，高血壓病患者血小板功能可因多種原因處于活化狀態(tài)，且可有更強的聚集性和黏附性。既往研究發(fā)現(xiàn)，鈣通道阻滯劑的使用可能與氯吡格雷抵抗有關，并且鈣通道阻滯劑在伴高血壓病的缺血性卒中患者中使用率較高，其與氯吡格雷的代謝均需經(jīng)肝臟藥物代謝酶CYP3A4的作用，后者為氯吡格雷代謝過程中比較重要的酶，因此，鈣通道阻滯劑可能影響氯吡格雷的轉(zhuǎn)化而使血小板抑制率降低[38-39]。Lee等[44]在氯吡格雷與其他藥物相互作用的研究中進一步肯定了氯吡格雷抵抗與鈣通道阻滯劑的使用有關。因此，伴高血壓病的缺血性卒中患者使用氯吡格雷時最好監(jiān)測血小板抑制率，尤其同時使用鈣通道阻滯劑時，更需要考慮可能出現(xiàn)的氯吡格雷抵抗。本研究不足之處在于未統(tǒng)計高血壓病患者降壓藥的使用情況，因此，服用氯吡格雷的缺血性卒中患者選用鈣通道阻滯劑降壓是否合適，尚需今后的研究進一步探討。

目前，白細胞計數(shù)水平參與氯吡格雷抵抗的機制尚未明確。謝文劍等[45]在冠心病存在氯吡格雷抵抗患者的外周血白細胞中發(fā)現(xiàn)3個長鏈非編碼RNA的表達，與氯吡格雷非抵抗組的差異有統(tǒng)計學意義，研究提示3個長鏈非編碼RNA可作為潛在生物標志物以評估氯吡格雷反應性。動脈粥樣硬化與血管內(nèi)皮的非特異性炎性反應有關，而白細胞尤其是中性粒細胞在這種非特異性炎性反應中發(fā)揮了重要作用[46]。在動脈粥樣硬化過程中，中性粒細胞不僅數(shù)量增多，功能增強，并且中性粒細胞可促進動脈粥樣硬化局部炎性反應，促進組織因子表達，并釋放中性粒細胞外誘捕陷阱，中性粒細胞外誘捕陷阱內(nèi)的組織因子誘導凝血酶生成和血小板活化、黏附和聚集，從而促進血栓形成[47]。因此，對于需要服用氯吡格雷的缺血性卒中患者，若其白細胞處于正常偏高水平，應警惕氯吡格雷抵抗。

本研究仍有很多不足之處：本研究為單中心回顧性研究，樣本的選擇上可能存在偏倚；未對CYP2C19基因多態(tài)性對氯吡格雷代謝的影響進行研究，故未能全面考慮氯吡格雷從腸道吸收、代謝及作用于血小板受體等過程中基因多態(tài)性及合并用藥的影響；樣本量較少，尤其是女性比例較低，可能使結(jié)果產(chǎn)生偏倚。另外，本研究僅在服用氯吡格雷7 d后檢測1次血小板抑制率，尚不能反映服用氯吡格雷過程中血小板抑制率的總體水平。盡管血小板抑制率與實際臨床事件之間的關系、導致氯吡格雷抵抗的因素均未明確，基于精準治療的目的，根據(jù)實驗室檢測指標調(diào)整治療有一定的臨床指導意義。