組織駐留記憶T細(xì)胞在抗結(jié)核分枝桿菌感染中的研究進(jìn)展*

耿 雪，宮照乾，于嘉霖，鄧光存，吳曉玲

（寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一種嚴(yán)重威脅人畜健康的傳染性疾病，目前仍然是全球十大致死率疾病之一［1］。據(jù)WHO 報(bào)告指出：由于這兩年受到COVID-19大流行的影響，TB患者的數(shù)量大幅度下降，但由于多重耐藥、共患病等因素的上升以及對TB 診斷、預(yù)防和服務(wù)支出的下降，導(dǎo)致TB 的預(yù)防和治療現(xiàn)狀變得更加棘手［2-3］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球目前有近四分之一的MTB 潛伏感染者，這部分感染者免疫力下降后，就可能發(fā)展為活動(dòng)性TB 患者。由此可見，結(jié)核病發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫應(yīng)答功能密切相關(guān)。

動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)主要包括免疫器官和免疫細(xì)胞，其中免疫活性細(xì)胞包括T 細(xì)胞和B細(xì)胞，而T細(xì)胞在機(jī)體抗病原菌感染過程中發(fā)揮了重要作用。關(guān)于T 細(xì)胞亞群劃分的原則和命名尚沒有統(tǒng)一，根據(jù)T 細(xì)胞受體雙肽鏈構(gòu)成的不同，T 細(xì)胞可分為αβT 細(xì)胞和γδT 細(xì)胞；根據(jù)表面標(biāo)志和分化抗原的不同，αβT 細(xì)胞可分為CD4+T 細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞；根據(jù)所處的活化狀態(tài)不同，T細(xì)胞分為初始T細(xì)胞、效應(yīng)T 細(xì)胞和記憶T 細(xì)胞［4］。目前在TB 的預(yù)防和治療過程中，T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是研究重點(diǎn)，其中以記憶T 細(xì)胞為熱點(diǎn)研究對象［5］。研究發(fā)現(xiàn)，組織駐留記憶T 細(xì)胞（tissue-resident memory T cells，TRM）可以高度定位病原體感染部位，在宿主抵御入侵病原體并產(chǎn)生免疫保護(hù)中發(fā)揮重要作用，除了可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫監(jiān)視功能外，更重要的是具備再次感染病原體時(shí)產(chǎn)生記憶應(yīng)答的能力［6］。由于TRM作為TB 適應(yīng)性免疫應(yīng)答的一個(gè)重要組成部分，討論如何更好地理解這種應(yīng)答，為研究TB 在肺部感染的局部免疫反應(yīng)可以成為解決TB 防治困難的一種新方法和抑制TB發(fā)病提供新的思路。

1 TRM簡介

記憶性T 細(xì)胞可分為效應(yīng)記憶T 細(xì)胞（effector memory T cells，TEM）和中樞記憶T細(xì)胞（center memory T cell，TCM）亞群，它們在血液、次級(jí)淋巴器官和非淋巴組織之間循環(huán)，近年來發(fā)現(xiàn)的TRM是記憶性T 細(xì)胞的第三個(gè)亞群，它不再經(jīng)過循環(huán)而存在于組織中，這些組織被定位為抵御宿主感染的第一道防線［7］。據(jù)2001 年Hogan 等［8］的研究報(bào)道，李斯特菌和水皰性口炎病毒感染小鼠后，抗原特異性CD8+T 細(xì)胞可遷移至非淋巴結(jié)組織并長期存活，當(dāng)再次受到相同抗原刺激時(shí)，該細(xì)胞會(huì)第一時(shí)間被激活并對抗感染，這類細(xì)胞被命名為TRM。越來越多的研究表明TRM對抵抗局部病原菌感染發(fā)揮了保護(hù)性免疫的作用［9］。除此之外，TRM在調(diào)控/抵御腫瘤、過敏和自身免疫性疾病作用顯著。更加值得我們關(guān)注的是，在MTB 侵入組織時(shí)，TRM能夠直接快速地發(fā)揮防御反應(yīng)并永久駐留在其感染部位，同時(shí)能夠促進(jìn)組織修復(fù)，維持組織免疫穩(wěn)態(tài)。因此，開發(fā)有利于TRM的形成以及功能的免疫治療方法不僅對控制MTB 的生長至關(guān)重要，而且對防止TB的發(fā)展也至關(guān)重要。

TRM功能的行使與其細(xì)胞表面標(biāo)志物密切相關(guān)，表面標(biāo)志物決定了TRM在免疫反應(yīng)部位駐留的持久性［10］。其相關(guān)的標(biāo)志物包括整合素（CD11a、VLA-4、CD49a 和CD103）、細(xì)胞表面標(biāo)志物（PD-1、CD44、CD101 和CD69）和趨化因子受體（CXCR3 和CD73），見圖1［11］。但值得一提的是，不是所有的TRM群都顯示所有表面標(biāo)志物，例如：CD49a、CD103、CD44 和CD69的某些組合能夠共同定位到細(xì)胞上并將其維持在最初感染的部位。研究表明，CD103可以與上皮表面的E-cadherin 相互作用且已被證明介導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間的黏附，這表明CD103 對上皮組織內(nèi)的駐留中起重要作用［12］；CD49a能夠與上皮細(xì)胞下致密層的IV 型膠原蛋白結(jié)合以建立組織駐留；CD44參與維持細(xì)胞形狀和完整性，并能與透明質(zhì)酸、纖維連接蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等許多不同的組織成分相互作用［13］；而CD69 能夠拮抗S1P1，從而在本質(zhì)上阻斷了對S1P 梯度的任何反應(yīng)［14］。其中CD103和CD69的表達(dá)可以作為TRM的一個(gè)識(shí)別標(biāo)志。在早期研究報(bào)道中，在MTB 感染過后，TRM特有的基因表達(dá)的鞘氨醇-1-磷酸受體1很可能參與介導(dǎo)了TRM局部組織駐留和存活；此外，在肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞中觀察到CD69 的高表達(dá)可能與肺組織的駐留有關(guān)［15］。然而，最近有報(bào)道稱TRM可以駐留于MTB感染部位，當(dāng)MTB再次入侵機(jī)體時(shí)可以抑制MTB 的擴(kuò)散，從而使機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答［16］。因此，TRM對控制人類肺TB至關(guān)重要，但迄今仍未確定TRM的獨(dú)特表型標(biāo)志物。

Figure 1.TRM surface-related markers and localization in lung tissues（as modified according to references［9-10］）.圖1 TRM表面相關(guān)的標(biāo)志物及在肺組織內(nèi)的定位（根據(jù)參考文獻(xiàn)［9-10］修改）

2 TRM功能概述

TRM的種類和功能取決于其所在的組織。在泌尿生殖系統(tǒng)中，TRM在誘導(dǎo)病原菌感染所引起的保護(hù)性免疫中起著核心作用；在人的腦組織中，TRM受到關(guān)鍵免疫檢查點(diǎn)分子的嚴(yán)格控制，進(jìn)而對嗜神經(jīng)病毒的再次激活提供了保護(hù)作用［17］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)和功能上是獨(dú)特的，神經(jīng)病變病毒進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)而引起危及生命的感染的能力說明了其需要免疫反應(yīng)保護(hù)來對抗病原菌的感染［18］。但對呼吸系統(tǒng)中TRM的表型、功能和調(diào)節(jié)特征研究較少［15］。TRM主要包括CD8+TRM、CD4+TRM、Treg TRM及NKT TRM（圖2），它們不僅在抗腫瘤、自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起調(diào)控作用，而且CD8+TRM和CD4+TRM在宿主抗TB 的保護(hù)性免疫過程中發(fā)揮重要作用（表1）［19］。但是目前關(guān)于Treg TRM和NKT TRM在抗MTB 感染的作用和功能研究相對較少。

表1 不同TRM的功能（根據(jù)參考文獻(xiàn)［19］改編）Table 1.Functions of different TRM（adapted from reference［19］）

Figure 2.Types of TRM（modified according to reference［19］）.圖2 TRM的種類（根據(jù)參考文獻(xiàn)［19］修改）

2.1 CD4+TRM在肺、生殖道、皮膚、小腸、腦等許多非淋巴組織中存在著大量的CD4+TRM［20］。在這些組織中，CD4+TRM主要表達(dá)CD11a 和CD69，同時(shí)CD103的表達(dá)收到T-bet的抑制。值得一提的是，關(guān)于CD4+TRM的分布情況，其中一部分CD4+TRM細(xì)胞隨時(shí)間推移能永久駐留在組織中并保持?jǐn)?shù)量穩(wěn)定；當(dāng)CD4+TRM細(xì)胞再次暴露于相同抗原時(shí)可促進(jìn)快速免疫防御，并在識(shí)別和應(yīng)對反復(fù)感染時(shí)可取代固有免疫；另一部分CD4+TRM僅能短暫駐留并與循環(huán)T 淋巴細(xì)胞發(fā)生交換。由于CD4+TRM主要通過輸出淋巴管離開皮膚，因此多數(shù)CD4+TRM是循環(huán)細(xì)胞［10］。此外，研究報(bào)道，在TB 患者體內(nèi)CD4+TRM的存在與MTB 負(fù)荷有關(guān)，且抗TB 治療完成后機(jī)體中CD4+TRM數(shù)量明顯減少［21］，因此說明CD4+TRM可以作為活動(dòng)性TB 的標(biāo)志物。然而，關(guān)于CD4+TRM在MTB 感染過程中的表型、功能仍有許多問題有待探索。

2.2 CD8+TRMCD8+TRM是一種獨(dú)特的記憶群體，最初在皮膚和腸道被識(shí)別，且在在肺、皮膚、腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等非淋巴組織中長期駐留，當(dāng)再次遭遇相同抗原時(shí)可快速增殖，發(fā)揮抗感染作用。CD8+TRM主要表達(dá)CD103 和CD69，絕大多數(shù)CD103 與ITGB7 結(jié)合并形成異二聚體，使組織駐留整合素αEβ7成為E-鈣黏蛋白的配體。研究表明，缺乏CD4+TRM輔助的CD8+TRM不能上調(diào)CD69 和CD103 的表達(dá)，無法駐留在氣道上皮內(nèi)，不能形成CD8+TRM［22］。近期有實(shí)驗(yàn)研究表明：在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了CD8+T細(xì)胞，它們通過介導(dǎo)局部細(xì)胞毒作用，抑制病毒感染［23］。

2.3 Treg TRM在皮膚、肺、腸道、肌肉和脂肪等非淋巴組織中也發(fā)現(xiàn)了Treg TRM，這些細(xì)胞不參與外周循環(huán)。但Treg TRM表達(dá)CD103 和CD69，因此在促進(jìn)組織修復(fù)、維持組織免疫穩(wěn)態(tài)和抗病毒免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外另有研究表明，病原體感染后，Treg TRM在小鼠腦內(nèi)大量募集，具有不同的免疫調(diào)節(jié)作用。一方面，Treg TRM在中樞系統(tǒng)中控制神經(jīng)免疫應(yīng)答方面起著關(guān)鍵作用；另一方面，Treg TRM在多種慢性感染中也能夠抑制組織損傷［24］。

2.4 NKT TRMNKT TRM已被證實(shí)在肝、肺、骨髓和脂肪等組織中駐留。某些組織中NKT TRM具有獨(dú)特的整合素［25］，如淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1 和細(xì)胞間黏附分子1 是維持NKT TRM長期駐留的重要分子［26］。NKT TRM同樣表達(dá)CD103，此外肝臟血管內(nèi)NKT TRM細(xì)胞表達(dá)CXCR6。關(guān)于NKT TRM的研究中表明在CD1d 存在的情況下，NKT TRM識(shí)別糖脂抗原并在細(xì)菌感染中起作用［27］。

3 TRM在抗MTB感染中的作用

T細(xì)胞免疫應(yīng)答對于控制TB的發(fā)展至關(guān)重要［28］。然而，越來越多的證據(jù)表明，TRM在控制MTB在內(nèi)的許多病原體生長方面具有優(yōu)勢［29］。已有研究表明，在TB患者的肺組織中能夠鑒定出CD4+TRM和CD8+TRM，它們具有產(chǎn)生并富集IL-17的功能，而IL-17的表達(dá)與TB 的嚴(yán)重程度存在潛在聯(lián)系。利用TB 患者肺部肉芽腫模型發(fā)現(xiàn)外源添加IL-17 可以促進(jìn)MTB 的增值［30］。Fan等［31］的研究結(jié)果表明，在患者感染后52周內(nèi)CD4+TRM群數(shù)目保持不變，可能是由于卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）接種后在組織中持續(xù)存在，提供了持續(xù)的抗原刺激，從而維持了穩(wěn)定的CD4+TRM群數(shù)目。此外，Turner等［32］發(fā)現(xiàn)，在氣道疾病的小鼠模型中，停止接觸過敏原后，只有CD4+TRM在肺中長期駐留，而CD8+TRM不能駐留在肺組織中。TRM不僅發(fā)揮直接作用，還能激活針對病原菌再次感染的固有免疫反應(yīng)。已有研究表明，MTB能誘導(dǎo)小鼠肺泡灌洗液、鼻黏膜、氣管和肺組織中INF-γ、TNF-α 和IL-2 的表達(dá)，以及MTB感染產(chǎn)生的TRM能夠在組織中駐留很長時(shí)間，從而具有防止肺部再次感染MTB的能力［33］。

3.1 CD4+TRM通過II型主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex class II，MHC-II）類 途徑識(shí)別并清除MTB CD4+TRM是宿主抵抗MTB 的細(xì)胞免疫應(yīng)答中的主要細(xì)胞。在MHC-II 基因缺失或CD4+TRM缺失的小鼠中，MTB 感染早期導(dǎo)致IFN-γ 水平嚴(yán)重減少，使MTB 呈持續(xù)進(jìn)行性生長［34］。CD4+TRM應(yīng)答程度還與TB 患者病變程度有關(guān)，病變嚴(yán)重或處于進(jìn)展期的患者CD4+TRM在體外對MTB 蛋白抗原僅有低增殖應(yīng)答反應(yīng)，病變范圍小或已控制病情的患者對純蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）反應(yīng)較強(qiáng)［35］。CD4+TRM的變化提示機(jī)體免疫反應(yīng)能力差異，預(yù)示患者治療轉(zhuǎn)歸的不同［36］。

Teijaro 等［37］證實(shí)，CD4+TRM在MHC-II 類分子的存在下識(shí)別來源于吞噬體的抗原肽，并促進(jìn)具有抗MTB活性的IFN-γ和TNF-α分泌（圖3A）。

與潛伏性感染的受試者相比，在活動(dòng)性TB 患者中檢測到能夠同時(shí)產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α、IL-17和IL-2的CD4+TRM，其中IFN-γ 和IL-2 雙重分泌主導(dǎo)了抗MTB的免疫反應(yīng)［38］。在抗MTB 治療完成后CD4+TRM明顯減少，說明CD4+TRM是活動(dòng)性TB的標(biāo)志物［39］。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了CD4+TRM影響局部免疫反應(yīng)結(jié)果的重要性。

3.2 CD8+TRM通過MHC-I類途徑識(shí)別并清除MTB CD8+TRM能夠識(shí)別來自細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的抗原并作為細(xì)菌負(fù)荷的傳感器，優(yōu)先識(shí)別嚴(yán)重感染MTB 的細(xì)胞。最新的研究表明，強(qiáng)毒MTB 可以從吞噬體逃逸到細(xì)胞質(zhì)中，并有可能直接進(jìn)入MHC-I類路徑［40］。

CD8+TRM在感染防御病原菌入侵宿主中扮演著重要角色。它識(shí)別的細(xì)胞溶質(zhì)抗原表達(dá)在MHC-I分子上，其分泌的細(xì)胞毒性分子如穿孔素、顆粒酶和顆粒溶素可以溶解宿主細(xì)胞或者直接殺死MTB（圖3B）［32］。此外，當(dāng)CD8+TRM介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化并抑制MTB 生長時(shí)，CD8+TRM可以通過FAS或TNF-γ家族相關(guān)的細(xì)胞死亡受體等分子誘導(dǎo)感染的靶細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，從而破壞MTB的生長環(huán)境，使抗原呈遞細(xì)胞呈遞MTB 起到免疫監(jiān)視的作用（圖3C）。在機(jī)體受強(qiáng)毒MTB 感染時(shí)，CD8+TRM在調(diào)節(jié)免疫過程發(fā)揮重要的細(xì)胞毒作用，同時(shí)在促使MTB 暴露及病灶清除等方面也發(fā)揮了重要作用。因此，同CD4+TRM相比CD8+TRM能更有效的識(shí)別并消滅MTB。

CD8+TRM受MTB 刺激后會(huì)釋放IFN-γ、TNF-α、IL-2 等細(xì)胞因子來提供保護(hù)性免疫。從功能的角度來看，以小鼠模型進(jìn)行利用CD8+TRM控制MTB 感染的研究中發(fā)現(xiàn)，IFN-γ 和穿孔素是誘導(dǎo)MTB 感染小鼠過程中免疫保護(hù)反應(yīng)發(fā)生的必要因素［41］。此外，由于肺結(jié)核患者中CD8+TRM的表達(dá)高于肺外結(jié)核患者，因此，CD8+TRM的功能差異很可能取決于發(fā)生在不同部位的抗原刺激，且可能與細(xì)菌負(fù)荷相關(guān)［42］。綜上所述，CD8+TRM的表達(dá)對于理解免疫系統(tǒng)如何控制TB的進(jìn)展可能具有重要意義。

4 TRM與TB疫苗的研制

TB 每年造成的死亡人數(shù)超過任何單一病原菌［43］。BCG 是目前唯一獲得許可的抗TB 疫苗，這種疫苗在兒童時(shí)期有一定的保護(hù)作用［44］，其通過皮內(nèi)注射的方式可以預(yù)防兒童播散性粟粒性TB 和腦膜型TB，但在成人時(shí)期預(yù)防效果不佳。因此亟需了解MTB 對宿主的免疫反應(yīng)，以幫助開發(fā)新的疫苗［45］。由于TRM具有永久組織駐留特性和抗菌活性，因此TRM對TB疫苗的開發(fā)存在著巨大的潛力。

目前正在使用的疫苗，它的基本原理是模仿病原體誘導(dǎo)的適應(yīng)性免疫，TRM與針對MTB 感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)有關(guān)，但在MTB感染后的作用尚不清楚，黏膜疫苗接種被認(rèn)為是模擬自然感染，能提高感染部位的局部免疫力，全面分析肺氣道和肺實(shí)質(zhì)的局部免疫對于合理設(shè)計(jì)使用BCG的黏膜TB疫苗接種策略至關(guān)重要，通過黏膜接種來模擬自然感染途徑可以產(chǎn)生TRM，來更好的保護(hù)TB?，F(xiàn)已經(jīng)證明了黏膜疫苗誘導(dǎo)的TRM能夠在宿主抵抗肺TB中發(fā)揮關(guān)鍵作用［46］。

Figure 3.The role of TRM in the anti-MTB immune response.圖3 TRM在抗MTB免疫反應(yīng)中的作用

在動(dòng)物模型中的研究發(fā)現(xiàn)，肺TRM細(xì)胞在MTB免疫反應(yīng)中的重要性。比較皮下接種、鼻內(nèi)接種和口服給藥3 種方法所產(chǎn)生的TRM的數(shù)量和種類，鼻內(nèi)接種和口服BCG 接種顯著誘導(dǎo)了TRM向肺實(shí)質(zhì)和氣道的浸潤，這與皮下注射BCG 接種誘導(dǎo)的浸潤非常相似［47］。皮下BCG 接種主要依賴于CD4+TRM的免疫反應(yīng)。然而，皮下BCG 接種的缺點(diǎn)之一是整體TRM的生成較弱，而且缺乏向肺遷移的黏膜趨化因子受體；口服BCG 給藥是一種低侵入性干預(yù)，但它不太可能作為人類疫苗接種策略的廣泛應(yīng)用。在目前的研究中，小鼠鼻內(nèi)BCG 接種被用于研究TRM在預(yù)防呼吸道感染中的作用。研究發(fā)現(xiàn)鼻黏膜中富含更高比例的TRM，表明小鼠鼻內(nèi)接種BCG 通過促進(jìn)TRM的比例和IFN-γ、INF-γ、TNF-α 和IL-2 等抗原特異性細(xì)胞因子的釋放來保護(hù)小鼠呼吸系統(tǒng)免受BCG 感染。同時(shí)，小鼠鼻內(nèi)接種BCG 后，呼吸系統(tǒng)中的TRM增加［48］。TRM在灌洗液、鼻黏膜、氣管和肺組織中持續(xù)存在很長時(shí)間，并具有防止肺部再次感染MTB的能力，表明鼻內(nèi)接種可能是通過激活呼吸系統(tǒng)黏膜組織中的TRM并預(yù)防TB 來誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的最佳方式。此外，BCG產(chǎn)生的TRM可以保護(hù)MTB的感染，表明疫苗接種途徑不同可能會(huì)產(chǎn)生不同數(shù)量的CD4+TRM和CD8+TRM。同時(shí)，TRM的生物標(biāo)志物可能是開發(fā)疫苗的關(guān)鍵物質(zhì)，從而需要改變評(píng)估疫苗有效性的方法［49］。由于約90%的MTB 感染者在感染后處于潛伏狀態(tài)，因此研發(fā)用于潛伏性感染者的疫苗也具有重要的作用。TRM能夠增強(qiáng)BCG 的免疫反應(yīng)，有可能成為研究疫苗的新靶點(diǎn)。了解MTB感染誘導(dǎo)TRM產(chǎn)生的機(jī)制，能為更好地開發(fā)新的TB疫苗提供理論依據(jù)。

5 展望

TRM定位于MTB 入侵的初始部位，參與外周組織的免疫監(jiān)測和免疫反應(yīng)，為MTB 入侵外周組織提供第一道防線。越來越多的研究認(rèn)識(shí)到TRM在組織免疫中發(fā)揮重要的作用。在對MTB 感染的免疫應(yīng)答中，CD4+TRM和CD8+TRM能更有效地抑制MTB 的生長。MTB 特異性CD4+TRM反應(yīng)對于理解免疫系統(tǒng)如何控制TB 的進(jìn)展具有重要意義。除此之外，TRM也可能驅(qū)動(dòng)其他重要的疾病過程，如免疫病理和自身免疫，并在癌癥的免疫監(jiān)測中發(fā)揮重要影響。雖然目前對TRM的認(rèn)識(shí)可能為疫苗或已知疾病的預(yù)防或治療干預(yù)提供新的轉(zhuǎn)化機(jī)會(huì)，但在人類組織中定義和檢測TRM有待進(jìn)一步研究。目前利用一些標(biāo)志物CD69 和CD103 定義TRM，但存在于非淋巴組織中或的TRM不容易被檢測，我們還需要尋找TRM更加準(zhǔn)確的表面標(biāo)志物，能夠真正識(shí)別其特征表型，這對于TRM維持的信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子以及應(yīng)用TRM來研究新的TB疫苗具有重要意義。