大麻二酚通過(guò)調(diào)節(jié)腦內(nèi)AMPA受體表達(dá)改善癡呆模型大鼠認(rèn)知損害

周珊珊， 劉曉朦， Elona Khasanova， 武繼婷， 李子欣， 周 悅， 張黎明

老年癡呆是衛(wèi)生領(lǐng)域重大疾病，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。從1990年到2016年，全球老年癡呆癥患者數(shù)量增長(zhǎng)了一倍多，主要原因是人口增長(zhǎng)和老齡化[1]。阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常見(jiàn)的老年癡呆類(lèi)型。隨著人口的老齡化的加劇，AD患病率迅速攀升，預(yù)計(jì)到2050年，中國(guó)AD患病人口將超過(guò)2000萬(wàn)，是世界上AD患病人口最多、增長(zhǎng)速度最快的地區(qū)[2]。目前AD的治療手段有限，僅有的幾種口服藥物，常難以達(dá)到滿(mǎn)意的效果。2021年美國(guó)加速批準(zhǔn)上市針對(duì)β淀粉樣蛋白(amyloid protein β，Aβ)的AD治療藥物——阿杜那(Aduhelm)單抗因昂貴的價(jià)格和嚴(yán)重的副作用備受爭(zhēng)議[3]。

大麻二酚(cannabidiol，CBD)是從大麻植物中提取的一種化學(xué)物質(zhì)，但它與大麻的另一種化學(xué)成分四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol，THC)不同，CBD沒(méi)有致幻作用。既往研究表明，CBD在癲癇、抑郁癥、多發(fā)性硬化和帕金森病中通過(guò)抗氧化、抗炎等多種方式發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4]。近幾年，CBD在AD中的作用成為研究熱點(diǎn)，進(jìn)一步探討CBD改善AD認(rèn)知障礙的作用機(jī)制，為CBD的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)勢(shì)在必行[5]。本研究探討了CBD對(duì)鏈脲菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的認(rèn)知損害模型大鼠認(rèn)知功能和腦內(nèi)α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptor，AMPAR)表達(dá)的變化。旨在探討CBD改善認(rèn)知障礙的潛在機(jī)制，為CBD防治AD提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑 CBD(上海麥克林生化科技有限公司，C875838)，STZ(美國(guó)Sigma公司，V900890)，兔抗大鼠多克隆GluR1和GluR2抗體(一抗，美國(guó)Affinity生物科技公司，AF6306，AF6307)，內(nèi)參抗體 β-actin(一抗，沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司，WL01845)，全蛋白提取試劑盒(沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司，WLA019)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司，WLA004)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(二抗，沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司，WLA023)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及給藥方法 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和監(jiān)督下實(shí)施(倫理學(xué)審批編號(hào)：2020-075)。成年雄性SD大鼠40只，購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(黑)2019-001。體重300～350 g。按每組10只隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(S)，CBD+假手術(shù)組(CBD+S)，模型組(STZ)，CBD+模型組(CBD+STZ)。CBD和吐溫80按1∶1溶解后加入生理鹽水稀釋至濃度為1%的CBD溶液。CBD+S和CBD+STZ組大鼠按10 mg/kg給與CBD溶液每日一次腹腔注射，共28 d。其余兩組每日給與等量溶劑腹腔注射。

1.3 雙側(cè)腦室內(nèi)注射STZ誘導(dǎo)的認(rèn)知損害模型的建立 依照文獻(xiàn)[6]的方法制模：10%水合氯醛3 ml/kg 腹腔注射麻醉，將大鼠頭部固定于立體定位儀上，沿頭部正中線(xiàn)做矢狀切口，分離皮下組織暴露顱骨。取前囟后0.8 mm，左右旁開(kāi)1.6 mm顱骨打孔，垂直深度4.0 mm微量加樣器緩慢 雙側(cè)腦室內(nèi)注射STZ 3 mg/kg。注入的STZ生理鹽水溶液體積控制在10 μl左右，假 手術(shù)組腦室內(nèi)注射相應(yīng)體積的生理鹽水。注射完畢用骨蠟封填顱骨缺損，縫合頭皮。48 h后重復(fù)上述手術(shù)注藥過(guò)程。

1.4 Morris水迷宮試驗(yàn) 造模28 d后進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力[7]。水迷宮是一個(gè)直徑150 cm，高60 cm充滿(mǎn)水的圓形不銹鋼水池，水池壁為黑色，水池分為4個(gè)象限。逃逸平臺(tái)是一個(gè)透明的直徑為10 cm的可移動(dòng)圓柱形平臺(tái)，其表面距水面2 cm。在測(cè)試中將平臺(tái)放置在任一象限，選擇某個(gè)象限將大鼠面朝池壁放入水中。大鼠到達(dá)平臺(tái)后令其在平臺(tái)停留30 s，然后繼續(xù)下一次訓(xùn)練。每次尋找平臺(tái)時(shí)間不超過(guò)60 s，記錄大鼠每次到達(dá)平臺(tái)所用的時(shí)間(逃逸潛伏期)，60 s內(nèi)未找到平臺(tái)逃逸潛伏期按60 s記錄。每天訓(xùn)練4次，共訓(xùn)練5 d。

1.5 跳臺(tái)試驗(yàn) 水迷宮試驗(yàn)后進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn)評(píng)價(jià)各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。跳臺(tái)試驗(yàn)箱大小為25 cm ×25 cm ×75 cm，箱底鋪滿(mǎn)金屬方格網(wǎng)，在箱底一角放置一個(gè)高5cm，直徑8cm的安全平臺(tái)。首日將大鼠放在安全平臺(tái)上，當(dāng)大鼠跳下平臺(tái)，四肢會(huì)受到電擊(3 Hz，0.4 mA)，經(jīng)過(guò)反復(fù)的跳上跳下，大鼠最終會(huì)停留在平臺(tái)上，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為300 s。次日重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)并記錄大鼠第一次跳下平臺(tái)的時(shí) 間(潛伏期)和300 s內(nèi)大鼠從平臺(tái)跳下的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))。

1.6 Western-blot檢測(cè)AMPAR表達(dá) 按試劑說(shuō)明書(shū)抽提總蛋白質(zhì)。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，制備蛋白質(zhì)待測(cè)液，BCA反應(yīng)，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度及對(duì)應(yīng)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并通過(guò)回歸方程計(jì)算樣本蛋白濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，即為樣本的蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白分子量大小選用對(duì)應(yīng)濃度的聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白質(zhì)(40 μg)轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用TBST緩沖液配制的5%(M/V)脫脂奶粉封閉后，孵育GluR1(1∶1000)和GluR2(1∶1000)一抗，4℃過(guò)夜。孵育二抗(1∶5000)，37 ℃，45 min，以超敏ECL試劑顯影拍照。將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA)，方差齊性時(shí)，用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，方差不齊時(shí)，組間比較用Dunnett’s T3。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮 Morris水迷宮試驗(yàn)中，各組大鼠1 d至5 d平均逃逸潛伏期(s)呈逐漸縮短趨勢(shì)。5 d逃逸潛伏期(s)結(jié)果為：S組(13.00±5.40)，CBD+S組(14.00±3.77)，STZ組(41.3±5.29)，CBD+STZ組(21.4±5.52)。STZ組與S組比較，逃逸潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.01)；CBD+STZ組與STZ組比較，逃逸潛伏期顯著縮短(P<0.01)；S組與CBD+S組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖1)。

與S組比較**P<0.01；與STZ組比較##P<0.01

2.2 跳臺(tái)試驗(yàn) 跳臺(tái)試驗(yàn)中，各組大鼠潛伏期(s)結(jié)果為：S組(275.90±30.74)，CBD+S組(265.50±34.60)，STZ組(207.70±37.08)，CBD+STZ組(244.60±41.59)。STZ組與S組比較，潛伏期顯著縮短(P<0.01)；CBD+STZ組與STZ組比較，潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05)；S組與CBD+S組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(見(jiàn)圖2A)。各組大鼠錯(cuò)誤次數(shù)(次)結(jié)果為：S組(2.10±2.47)，CBD+S組(2.80±2.53)，STZ組(5.40±1.71)，CBD+STZ組(3.20±2.35)。STZ組與S組比較，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加(P<0.01)；CBD+STZ組與STZ組比較，錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少(P<0.05)；S組與CBD+S組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖2B)。

與S組比較**P<0.01；與STZ組比較#P<0.05

2.3 Western-blot檢測(cè)AMPAR表達(dá) 各組大鼠皮質(zhì)和海馬GluR1相對(duì)表達(dá)量分別為：S組(0.52±0.06)、(0.54±0.05)，CBD+S組(0.44±0.06)、(0.43±0.12)，STZ組(1.03±0.18)、(1.36±0.24)，CBD+STZ組(0.82±0.06)、(0.99±0.09)。STZ組與S組比較，皮質(zhì)和海馬的GluR1表達(dá)均顯著增加(P<0.01)、(P<0.01)；CBD+STZ組與STZ組比較，皮質(zhì)和海馬的GluR1表達(dá)均顯著減少(P<0.01)、(P<0.05)。S組與CBD+S組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖3)。各組大鼠皮質(zhì)和海馬GluR2相對(duì)表達(dá)量分別為：S組(0.55±0.07)、(0.52±0.16)，CBD+S組(0.39±0.12)、(0.44±0.06)，STZ組(1.36±0.07)、(1.05±0.15)，CBD+STZ組(0.86±0.19)、(0.82±0.08)。STZ組與S組比較，皮質(zhì)和海馬的GluR2表達(dá)均顯著增加(P<0.01)、(P<0.01)；CBD+STZ組與STZ組比較，皮質(zhì)和海馬的GluR2表達(dá)均顯著減少(P<0.01)、(P<0.01)。S組與CBD+S組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖3)。

與S組比較**P<0.01；與STZ組比較#P<0.05；與STZ組比較##P<0.01

3 討 論

AD發(fā)病機(jī)制不清，可能的機(jī)制包括β淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)，過(guò)度磷酸化tau蛋白引起的神經(jīng)原纖維纏結(jié)，炎性機(jī)制，線(xiàn)粒體功能障礙，興奮性毒性和突觸功能障礙等。目前，常用于AD治療的藥物包括膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑，AD 的新藥研發(fā)進(jìn)展緩慢。曾被人們寄予厚望的Aβ抗體以及tau蛋白聚集抑制劑的相關(guān)臨床試驗(yàn)都以失敗告終[8，9]。隨著癡呆患者數(shù)量不斷增加以及患者和家屬對(duì)認(rèn)知功能改善的迫切需求，開(kāi)發(fā)廉價(jià)有效的治療方法已成為當(dāng)務(wù)之急。

CBD是一種在大麻中發(fā)現(xiàn)的植物大麻素，其脂溶性較高，容易通過(guò)血腦屏障。與四氫大麻酚(Tetrahydrocannabinol，THC)不同，CBD沒(méi)有致幻作用和成癮性[10]。已有研究表明CBD具有抗氧化應(yīng)激，抗炎，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生等藥理作用[4]。2018年6月，首個(gè)CBD藥物Epidiolex?被批準(zhǔn)用于治療難治性癲癇[11]。除癲癇外，CBD在焦慮抑郁，多發(fā)性硬化和帕金森病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中通過(guò)多種方式發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4]。針對(duì)AD多種復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，單一作用于疾病某一環(huán)節(jié)很難有好的治療效果，而CBD這種可以作用于多個(gè)靶點(diǎn)的藥物可能在AD的防治中更具有潛力。

體外研究發(fā)現(xiàn)，CBD具有抗炎、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用，可防止海馬和皮質(zhì)神經(jīng)退行性變，減少tau蛋白過(guò)度磷酸化，并調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移[5]。此外，CBD被證明可以預(yù)防Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)毒性和小膠質(zhì)細(xì)胞激活的神經(jīng)毒性，通過(guò)誘導(dǎo)APP泛素化減少Aβ的生成，并且CBD可能通過(guò)與PPARγ的相互作用逆轉(zhuǎn)Aβ誘導(dǎo)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)減弱[12]。然而，CBD在AD中的體內(nèi)研究還相對(duì)較少，尤其是CBD對(duì)認(rèn)知障礙動(dòng)物模型腦內(nèi)谷氨酸傳遞的作用鮮有報(bào)道。本研究觀(guān)察了STZ誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙模型大鼠腦內(nèi)AMPAR的表達(dá)變化以及CBD的作用，旨在探討CBD改善認(rèn)知作用的新靶點(diǎn)。

STZ是一種氨基葡萄糖化合物代謝后產(chǎn)生的細(xì)胞毒性產(chǎn)物，它能夠誘導(dǎo)胰腺β細(xì)胞損傷。在大鼠雙側(cè)腦室內(nèi)注射亞致糖尿病劑量的STZ被認(rèn)為是一種散發(fā)AD動(dòng)物模型，可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，腦內(nèi)葡萄糖和能量代謝受損，氧化應(yīng)激增加，谷氨酸興奮性毒性增加和tau蛋白過(guò)度磷酸化等類(lèi)似AD的病理變化[13，14]。本研究應(yīng)用雙側(cè)腦室內(nèi)注射STZ建立大鼠認(rèn)知障礙模型，給與CBD治療，通過(guò)Morris水迷宮和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)測(cè)試發(fā)現(xiàn)CBD干預(yù)后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善。

神經(jīng)遞質(zhì)失衡，興奮性毒性和突觸喪失被認(rèn)為是認(rèn)知功能障礙長(zhǎng)期存在的原因。對(duì)APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠的皮質(zhì)神經(jīng)元的研究發(fā)現(xiàn)，在病理進(jìn)展的早期和晚期階段神經(jīng)興奮性是不同的：幼齡期表現(xiàn)為低興奮性，老齡期表現(xiàn)為高興奮性；超興奮性的原因可能是興奮性谷氨酸受體上調(diào)和網(wǎng)絡(luò)抑制減少的結(jié)果[15]。除此之外，Nakajima等研究發(fā)現(xiàn)AMPAR阻滯劑(吡侖帕奈)可改善動(dòng)物卒中后認(rèn)知障礙[16]。最近的研究顯示STZ誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙大鼠腦內(nèi)谷氨酸含量增加[14]，本研究發(fā)現(xiàn)雙側(cè)腦室注射STZ四周后大鼠腦內(nèi)AMPAR顯著增加，提示興奮性谷氨酸受體的上調(diào)在STZ誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙中起作用。

研究發(fā)現(xiàn)CBD對(duì)AD轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知障礙的改善作用與Aβ負(fù)荷減少無(wú)關(guān)，此外，CBD治療不會(huì)改變皮質(zhì)脂質(zhì)氧化水平[5]。多項(xiàng)研究表明CBD 在體內(nèi)發(fā)揮作用與內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)密切相關(guān)。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)包含兩種大麻素受體(CB1R和CB2R)，CBD對(duì)CB1R具有負(fù)向別構(gòu)調(diào)節(jié)作用，對(duì)CB2R具有部分激動(dòng)作用[17]。然而，選擇性CB2激動(dòng)劑并不能預(yù)防認(rèn)知障礙，這表明CBD通過(guò)其他機(jī)制發(fā)揮改善認(rèn)知的作用。Poulia等研究發(fā)現(xiàn)大麻二酚通過(guò)激活ERK1/2逆轉(zhuǎn)氯胺酮引起的大鼠腦內(nèi)AMPAR增加[18]。本研究觀(guān)察了CBD對(duì)STZ誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙模型大鼠腦內(nèi)AMPAR表達(dá)的影響，結(jié)果顯示CBD顯著降低了STZ誘導(dǎo)的AMPAR表達(dá)上調(diào)。提示CBD通過(guò)減少AMPAR在病理狀態(tài)下的異常過(guò)表達(dá)，降低谷氨酸興奮性毒性，從而改善認(rèn)知功能。最近的一項(xiàng)研究首次表明CBD可作為AMPAR的負(fù)變構(gòu)調(diào)節(jié)劑(當(dāng)AMPAR特異由GluA1/GluA2亞基構(gòu)成時(shí))，CBD顯著降低了AMPAR介導(dǎo)的誘發(fā)性興奮性突觸后電流(eEPSCs)和微小興奮性突觸后電流(mEPSCs)的振幅和頻率，并且顯著加速GluA1和GluA2亞基的失活[19]。CBD對(duì)AMPAR的上述抑制作用依賴(lài)于其與GluA1/GluA2 N-末端結(jié)構(gòu)域的相互作用。

綜上，病理狀態(tài)下AMPAR表達(dá)的上調(diào)可能是機(jī)體促進(jìn)神經(jīng)突觸傳遞和突觸可塑性正?；拇鷥敊C(jī)制。然而，上調(diào)的AMPAR增加了腦內(nèi)谷氨酸興奮性毒性，出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣累積，導(dǎo)致細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的破壞和腦組織的結(jié)構(gòu)損傷。CBD通過(guò)調(diào)控AMPAR表達(dá)改善認(rèn)知障礙的作用提示AMPAR可能是CBD的重要作用靶點(diǎn)，其改善認(rèn)知作用的具體機(jī)制值得深入研究。