非小細(xì)胞肺癌患者miR-744-5p、血清巨噬細(xì)胞抑制因子-1與臨床病理特征的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值研究

趙洪煥， 韓素桂， 陳艷梅， 李穎， 徐康， 鄭璇， 田立斌

肺癌是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)，其中非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌的常見(jiàn)類型，約占85%[1]。近年來(lái)，關(guān)于NSCLC的診斷和預(yù)后評(píng)估成為研究熱點(diǎn)。微小RNA(microRNA，miR)在細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2-3]。有研究表明，miR-744在肝癌患者中表達(dá)異常，miR-744可作為輔助評(píng)估肝癌預(yù)后的指標(biāo)之一[4-5]。但目前關(guān)于微小RNA-744-5p(miR-744-5p)在NSCLC患者中的表達(dá)情況及其與患者臨床病理特征相關(guān)性的報(bào)道尚少。有研究表明，血清巨噬細(xì)胞抑制因子-1(macrophage inhibitory cytokine-1, MIC-1)水平與肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但目前關(guān)于MIC-1表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的研究報(bào)道較少[6-7]。本研究通過(guò)研究NSCLC患者血清外泌體miR-744-5p及MIC-1水平與臨床病理特征的關(guān)系及其對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，以期為NSCLC的臨床診療及預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2018年1月至2019年12月唐山市人民醫(yī)院收治的126例NSCLC患者為觀察組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合NSCLC的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)影像、病理等檢查確診為NSCLC[8]；②年齡≥18周歲；③術(shù)前未接受抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并慢性阻塞性肺疾病或肺部感染等其他肺部疾病患者；②合并其他原發(fā)性惡性腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤患者；③嚴(yán)重肝、腎、心功能不全或有結(jié)核、血液病患者；④精神障礙或意識(shí)模糊患者；⑤隨訪資料不完整或缺失者。選取同期在我院體檢的126例體檢健康者為對(duì)照組。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2018015)。

1.2 研究方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清MIC-1水平[6]所有研究對(duì)象于入組次日清晨(未接受治療前)空腹抽取靜脈血5 ml，4 000 r/min離心10 min，分離血清并置于-80 ℃冷藏保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清MIC-1水平，試劑盒購(gòu)自上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司，操作步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測(cè)定血清外泌體miR-744-5p水平[9]取5 ml靜脈血，采用RNA提取試劑盒提取外周全血RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)SYBR RT-PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)35次。采用2-△△Ct法測(cè)定miR-744-5p相對(duì)表達(dá)量，以U6為內(nèi)參，每個(gè)樣本重復(fù)3次，取平均值。引物由北京博爾邁生物技術(shù)有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 觀察組與對(duì)照組miR-744-5p、MIC-1水平比較

觀察組的miR-744-5p水平低于對(duì)照組，MIC-1水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表2。

表2 觀察組與對(duì)照組miR-744-5p、MIC-1水平比較

2.2 不同預(yù)后NSCLC患者miR-744-5p及MIC-1水平比較

隨訪3年后，根據(jù)存活狀態(tài)將126例NSCLC患者分為生存組(94例)與死亡組(32例)。生存組的miR-744-5p水平高于死亡組，MIC-1水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表3。

表3 生存組與死亡組miR-744-5p及MIC-1水平比較

2.3 miR-744-5p及MIC-1判斷NSCLC患者預(yù)后的價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-744-5p判斷NSCLC患者預(yù)后的截?cái)嘀禐?.016，MIC-1為1 013.21 pg/ml，其他診斷試驗(yàn)參數(shù)見(jiàn)表4。

表4 ROC曲線分析miR-744-5p及MIC-1判斷NSCLC患者預(yù)后的價(jià)值

2.4 不同臨床病理特征患者的miR-744-5p及MIC-1水平比較

根據(jù)miR-744-5p截?cái)嘀?.016將126例NSCLC患者分為高表達(dá)組(74例)與低表達(dá)組(52例)，亞組分析結(jié)果顯示，兩亞組的腫瘤大小、TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表5)；根據(jù)MIC-1截?cái)嘀?013.21 pg/ml將126例NSCLC患者分為高表達(dá)組(48例)與低表達(dá)組(78例)，亞組分析結(jié)果顯示，兩亞組的腫瘤大小、TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表6)。

表5 miR-744-5p高表達(dá)組與低表達(dá)組的臨床病理特征比較 [例(%)]

表6 MIC-1高表達(dá)組與低表達(dá)組的臨床病理特征比較 [例(%)]

2.5 Logistic回歸分析結(jié)果

分別以miR-744-5p水平低表達(dá)為因變量(是=1，否=0)，以MIC-1水平高表達(dá)為因變量(是=1，否=0)，以年齡(<60=0，≥60=1)，性別(女=0，男=1)，腫瘤大小(<3 cm=0，≥3 cm=1)，病理類型(鱗癌=0，腺癌=1)，TNM分期(Ⅰ～Ⅱ=0，Ⅲ～Ⅳ=1)，分化程度(中高分化=0，低分化=1)，吸煙(無(wú)=0，有=1)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無(wú)=0，有=1)為自變量進(jìn)行Logistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示，腫瘤≥3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及低分化是影響NSCLC患者miR-744-5p水平低表達(dá)和MIC-1水平高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表7、8。

表7 影響miR-744-5p水平低表達(dá)的Logistic回歸分析結(jié)果

表8 影響MIC-1水平高表達(dá)的Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

NSCLC是臨床最常見(jiàn)的肺癌類型，其組織學(xué)類型以鱗癌和腺癌為主。在臨床上，NSCLC發(fā)病率高，惡性程度高，無(wú)進(jìn)展生存期短，預(yù)后較差[10-11]。目前，NSCLC的治療仍以手術(shù)聯(lián)合放療、化療方式為主，但在治療的同時(shí)也面臨著諸多問(wèn)題，如治療費(fèi)用高、手術(shù)創(chuàng)傷大、治療效果不理想、早期不易診斷等，再加之腫瘤轉(zhuǎn)移、突變等也給NSCLC患者的臨床治療帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)[12]。因此尋找可用于NSCLC早期篩查及預(yù)測(cè)預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物具有重要的臨床意義。血清腫瘤標(biāo)志物濃度的變化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是肺癌診查和預(yù)后評(píng)估的重要手段[13]。

miRNA是長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的非編碼內(nèi)源性短鏈RNA，其在血清中性質(zhì)穩(wěn)定，通過(guò)檢測(cè)其特異表達(dá)水平能夠及時(shí)有效地反映腫瘤的病理進(jìn)程，在癌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用[14-15]。近年來(lái)，miRNA已作為潛在的腫瘤標(biāo)志物常被應(yīng)用于腫瘤的早期篩查[15]。外泌體是由多種物質(zhì)組成、直徑為30～100 nm的微小囊泡，存在于人體血、尿、唾液中[16]，其結(jié)構(gòu)有利于保護(hù)miRNA不受核糖核酸酶催化活性的影響，能精確反映腫瘤的主要特征[16-18]。

血清外泌體miR-744-5p是miRNA中特異性較高的一種，近年來(lái)被廣泛用于NSCLC的檢測(cè)。李少鵬等[9]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血清外泌體miR-744-5p水平較健康組明顯降低，ROC曲線的AUC為0.934，提示血清外泌體miR-744-5p對(duì)NSCLC具有良好的診斷性能。本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者的血清外泌體miR-744-5p呈低表達(dá)，與先前的研究結(jié)果一致。

MIC-1作為細(xì)胞因子，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族中的重要成員，其通過(guò)激活信號(hào)通路或抑制基因表達(dá)的方式對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分離及轉(zhuǎn)移均具有重要影響，是參與肺癌細(xì)胞凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移的重要生物標(biāo)志物[6-7]。本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者的血清MIC-1水平呈高表達(dá)，與王紅敏等[7]的研究一致。

本研究進(jìn)一步行ROC曲線分析顯示，當(dāng)外周血miR-744-5p和MIC-1截?cái)嘀捣謩e為0.016和1 013.21時(shí)，其預(yù)測(cè)患者死亡的AUC分別為0.875和0.821，提示外周血miR-744-5p和MIC-1水平可作為輔助指標(biāo)用于預(yù)測(cè)NSCLC患者的預(yù)后。本研究進(jìn)一步以miR-744-5p和MIC-1的截?cái)嘀禐榻?，將患者分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，比較不同臨床病理特征患者的miR-744-5p和MIC-1表達(dá)情況。結(jié)果顯示，腫瘤≥3 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度為低分化以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的miR-744-5p表達(dá)水平更低，MIC-1表達(dá)水平更高，說(shuō)明miR-744-5p低表達(dá)和MIC-1高表達(dá)均與腫瘤大小、TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而Logistic回歸分析結(jié)果進(jìn)一步提示腫瘤≥3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及低分化是影響miR-744-5p水平低表達(dá)和MIC-1水平高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究未探討血清miR-744-5p和MIC-1對(duì)NSCLC發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制，且樣本量不大，仍需后續(xù)研究進(jìn)一步探討。

綜上所述，NSCLC患者miR-744-5p呈低表達(dá)，MIC-1呈高表達(dá)，二者均與患者病情程度存在一定聯(lián)系，且在預(yù)測(cè)患者預(yù)后中具有一定的臨床價(jià)值。腫瘤≥3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及低分化是影響miR-744-5p水平低表達(dá)和MIC-1水平高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。