劉吉娟,楊 波,羅瑞明,李子欣,尤麗琴
(寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院,寧夏 銀川 750021)
保水性是衡量灘羊肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,可用蒸煮損失率和離心損失率來表示。目前,關(guān)于灘羊肉的研究主要集中于宰前控制對于灘羊肉品質(zhì)形成的影響。宰后因素對灘羊肉品質(zhì)影響方面,吳亮亮等研究發(fā)現(xiàn)不同食鹽添加量對灘羊肉保水性、剪切力以及水分分布均有顯著影響。張麗文等研究發(fā)現(xiàn)凍融處理的灘羊肉中不易流動水相對含量較高,自由水相對含量較低。而從蛋白質(zhì)水平解析貯藏過程中灘羊肉保水性的變化機(jī)制鮮有報道。
宰后貯藏期間,肉品的保水性受貯藏條件、糖酵解、肌肉pH值等因素影響,這些因素通過調(diào)節(jié)肌肉結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的降解影響肌肉結(jié)構(gòu)從而影響肌肉結(jié)構(gòu)中水分的貯存情況,而蛋白質(zhì)水平的變化是引起肌肉結(jié)構(gòu)變化的根本原因。左惠心研究表明糖酵解關(guān)鍵酶磷酸丙糖異構(gòu)酶可能是牦牛肉保水性的指示蛋白之一。劉秋鳳研究表明,糖代謝通過改變肌肉pH值影響豬肉保水性、肉色等品質(zhì)性狀的形成。因此,從蛋白質(zhì)水平解析貯藏過程中保水性變化的機(jī)制,從而尋找改善汁液損失的方法,對提高冷鮮肉品質(zhì)、降低企業(yè)經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。
蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細(xì)胞、組織或生物體中所表達(dá)的蛋白質(zhì)組成、變化及相互作用規(guī)律的學(xué)科。蛋白質(zhì)組學(xué)在肉品保水性研究相關(guān)領(lǐng)域也取得了可觀的進(jìn)展。di Luca等采用高分辨率雙向熒光差異凝膠電泳(twodimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE)和免疫印跡法研究豬肉滲出液,發(fā)現(xiàn)磷酸丙糖異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)鐵蛋白可能是預(yù)測保水性的生物標(biāo)志物。Zuo Huixin等研究表明,肌球蛋白輕鏈、熱休克蛋白27和磷酸丙糖異構(gòu)酶可能是牦牛腰長肌保水性的指示蛋白。然而,關(guān)于揭示宰后貯藏過程中灘羊肉保水性變化的機(jī)制鮮見報道。因此,本研究以6 月齡灘羊背最長肌為研究對象,測定4 ℃貯藏0、4、8 d時樣品的pH值、蒸煮損失率和離心損失率;采用基于同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究貯藏期間灘羊肌肉組織中蛋白質(zhì)表達(dá)情況,篩選差異蛋白質(zhì)并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,鑒定0~4 d和4~8 d兩個貯藏階段共有的差異表達(dá)蛋白質(zhì)并構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),利用Cytoscape 3.8.0軟件對PPI進(jìn)行分析并篩選核心網(wǎng)絡(luò);通過分析品質(zhì)指標(biāo)與核心網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)表達(dá)量的關(guān)系,初步揭示宰后貯藏過程中灘羊肉保水性變化的機(jī)制,為冷鮮灘羊肉品質(zhì)控制技術(shù)提供理論指導(dǎo)。
6 月齡公灘羊采集于寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司。
尿素、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、IPG buffer、甲酸美國GE公司;十二烷基磺酸鈉、三羧基氨基甲烷、三氯乙酸、過硫酸銨、四甲基乙二胺 美國Amresco公司;三乙二胺碳酸鹽、考馬斯亮藍(lán)G-250 美國Sigma公司;胰蛋白酶 美國普洛麥格公司;乙腈 美國Thermo公司。
便攜式pH計 上海德圖儀器國際貿(mào)易有限公司;TG16W型離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;DZKW-C型電子恒溫水浴鍋 滄州新三思試驗(yàn)儀器有限公司;Sciex Triple TOF 5600質(zhì)譜儀、Eksigent nanoLC-1D plus液相色譜系統(tǒng)(配有納升噴霧III離子源、Analyst TF 1.6數(shù)據(jù)處理軟件) 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;5910R冷凍離心機(jī) 德國艾本德公司;Image Scanner III光密度掃描儀 美國GE Healthcare公司;真空冷凍干燥機(jī) 美國賽默飛公司;VCX130超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 美國Sonics公司;Mini PROTEAN tetra Cell電泳儀 美國伯樂公司。
1.3.1 樣品采集
選取體質(zhì)量相近的6 月齡公灘羊,屠宰后用滅菌刀取右側(cè)背最長肌,編號后置于聚乙稀薄膜內(nèi),于風(fēng)速3 m/s、相對濕度80%、溫度4 ℃條件下貯存。
取貯藏0、4、8 d的樣品各200 g用于測定pH值、離心損失率及蒸煮損失率;取0、4、8 d的樣品各200 mg迅速置于液氮中放置2 h后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存,用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析。
1.3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)分析
采用尤麗琴等的方法從灘羊肉中提取總蛋白。iTRAQ-蛋白質(zhì)組學(xué)分析委托上海鹿明生物科技有限公司進(jìn)行,運(yùn)用Analyst TS 1.1軟件系統(tǒng)獲得蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)的定性及定量信采用Protein Pilot 5.0軟件獲得。檢索的數(shù)據(jù)庫為數(shù)據(jù)庫,數(shù)據(jù)庫來源為UniProt。數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后,以差異倍數(shù)(fold change,F(xiàn)C)>1.5或FC<1/1.5且<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異豐度蛋白質(zhì)。篩選出的差異豐度蛋白質(zhì)利用OmicsBean軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析,比對后獲得差異基因的基因本體(gene ontology,GO)(包括生物過程、分子功能、細(xì)胞組分)功能信息,選擇差異最顯著的前10 個條目作圖。采用京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫對所篩選的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行通路注釋分析。利用String數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)和Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行PPI分析及核心互作網(wǎng)絡(luò)篩選。
1.3.3 指標(biāo)測定
1.3.3.1 pH值
取4 cm×4 cm×4 cm(60 g左右)灘羊背最長肌,使用便攜式數(shù)字pH計測量肌肉pH值,探頭沿肌纖維方向插入肉樣內(nèi)部,每個樣品至少測定3 個點(diǎn),結(jié)果取均值。測定前剔除樣品可見脂肪與結(jié)締組織。
1.3.3.2 蒸煮損失率
蒸煮損失率的測定參考文獻(xiàn)[14]的方法并稍作修改。將樣品切割成6 cm×3 cm×3 cm的肉塊并稱質(zhì)量(),然后在80 ℃水浴鍋中加熱至樣品中心溫度75 ℃,取出后冷卻至室溫,用濾紙擦干表面水分后稱質(zhì)量(),按式(1)計算蒸煮損失率。
1.3.3.3 離心損失率
離心損失率的測定參照文獻(xiàn)[15]的方法并稍作修改。將約5 g的樣品準(zhǔn)確稱質(zhì)量()后放置于10 mL離心管中,4 ℃以8 000 r/min離心10 min。除去離心管中滲出液后以濾紙吸干樣品表面水分后準(zhǔn)確稱質(zhì)量()。按式(2)計算離心損失率。
所有指標(biāo)重復(fù)測定3 次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù),采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析及Pearson相關(guān)性分析,采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析,<0.05表示差異顯著,采用Origin軟件作圖。采用微生信在線平臺(http://www.bioinformatics.com.cn)對篩選的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行主成分分析。
由表1可知,宰后0~4 d,pH值顯著降低(<0.05),并于4 d時降至最低(5.58),4 d后略有回升。王薇等發(fā)現(xiàn)灘羊肉于0~4 ℃貯藏條件下連續(xù)放置7 d后其pH值呈先下降后上升趨勢,本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與其一致。國內(nèi)外諸多學(xué)者研究表明家畜屠宰后初期ATP水解產(chǎn)生導(dǎo)致H含量增加以及能量代謝方式轉(zhuǎn)變引起的乳酸積累是導(dǎo)致貯藏初期pH值下降的主要原因,而pH值4~8 d升高可能是由于分解代謝消耗肌肉中所積累的酸性物質(zhì)。宰后貯藏過程中,肌肉pH值下降的速率和程度顯著影響代謝酶的活性,對于肉色、嫩度、保水性和風(fēng)味前體的形成有重要影響,是宰后初期肌肉最重要的品質(zhì)指標(biāo)。貯藏8 d內(nèi)蒸煮損失率與離心損失率均呈持續(xù)升高趨勢,二者均可表示肌肉的保水性,蒸煮損失率與離心損失率持續(xù)升高表明灘羊肉的保水性隨時間的延長逐漸變差。這與李升升的研究結(jié)果一致。據(jù)研究表明,畜禽屠宰后影響肌肉保水性的主要因素有肌肉結(jié)構(gòu)、pH值、糖酵解等。肌肉中有自由水、結(jié)合水和不易流動水3 種形式存在,共占肌肉的80%左右。肌肉結(jié)構(gòu)、pH值及糖酵解等變化所引起的水分狀態(tài)轉(zhuǎn)換以及水分儲存空間減少是導(dǎo)致灘羊肉保水性變差的主要原因。
表1 灘羊宰后貯藏過程中肌肉pH值及保水性的變化Table 1 Changes of pH and water holding capacity in Tan sheep meat from different aging stages
對3 個貯藏時間段樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果進(jìn)行主成分分析,如圖1所示,貯藏時間可將樣本很好地區(qū)分開,同一貯藏時間樣本之間區(qū)分不明顯,不同貯藏時間樣本之間區(qū)分明顯,表明本實(shí)驗(yàn)樣品采集合理,蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)可靠,滿足后續(xù)分析要求。
圖1 不同貯藏期樣本蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的主成分分析結(jié)果Fig. 1 Principal component analysis plot of proteomic data of samples stored for different periods
2.2.1 差異蛋白質(zhì)篩選
以FC>1.5或FC<1/1.5且<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異豐度蛋白質(zhì),4 d組對比0 d組共鑒定出83 個豐度顯著差異蛋白質(zhì),其中,61 個為顯著上調(diào),22 個為顯著下調(diào)(圖2A);8 d組對比4 d組共鑒定出104 個豐度顯著差異蛋白質(zhì),其中,14 個為顯著上調(diào),90 個為顯著下調(diào)(圖2B)。
圖2 不同貯藏期灘羊肉差異豐度蛋白質(zhì)的火山圖Fig. 2 Volcano plot of differential abundant proteins in Tan sheep meat during chilled storage
2.2.2 冷藏期間灘羊背最長肌差異蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析結(jié)果
2.2.2.1 GO功能注釋富集分析結(jié)果
通過GO功能注釋對所篩選的差異豐度蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息分析,通過生物過程、細(xì)胞組分、分子功能三方面解析其功能,結(jié)果表明,4 d對比0 d組顯著富集到441 個生物過程條目、117 個細(xì)胞組分條目和110 個分子功能條目;8 d對比4 d組顯著富集到769 個生物過程條目、85 個細(xì)胞組分條目和180 個分子功能條目,富集最顯著的前10 個條目如圖3所示。
圖3 不同貯藏期灘羊肉差異豐度蛋白質(zhì)的GO注釋Fig. 3 Gene ontology annotation of differential abundant proteins in Tan sheep meat during chilled storage
由圖3A可知,宰后貯藏0~4 d,差異蛋白質(zhì)主要涉及到的生物過程包括肌肉收縮、肌肉系統(tǒng)過程、橫紋肌收縮、ATP代謝過程、骨骼肌收縮等;細(xì)胞組分主要包括肌原纖維、收縮纖維、收縮纖維部分、肌節(jié)、超分子纖維等;分子功能主要包括肌動蛋白結(jié)合、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活力、氫離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活力、電子載流子活度等。以上結(jié)果表明,灘羊屠宰后初期構(gòu)成肌肉結(jié)構(gòu)的肌原纖維、收縮纖維、肌節(jié)、超分子纖維等發(fā)生變化,這些變化可能引起了肌肉收縮、骨骼肌收縮等,發(fā)生變化的蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)主要負(fù)責(zé)肌動蛋白結(jié)合、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合、離子轉(zhuǎn)運(yùn)等功能。已有諸多研究表明肌肉的收縮狀態(tài)會引起肌肉結(jié)構(gòu)的變化,從而引起肉品保水性的變化。
由圖3B可知,宰后貯藏4~8 d,差異蛋白質(zhì)主要涉及到的生物過程包括肌肉收縮、肌肉系統(tǒng)過程、橫紋肌收縮、嘌呤核糖核苷三磷酸代謝過程、核糖核苷三磷酸代謝過程等;在細(xì)胞組分中主要包括細(xì)胞外膜結(jié)合的細(xì)胞器、胞外外泌體、細(xì)胞外囊泡、胞外細(xì)胞器、肌原纖維等;在分子功能中主要包括細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合、過氧化物酶活力、FATZ綁定、抗氧化活性、肌動蛋白結(jié)合等。以上結(jié)果表明,灘羊肉貯藏4 d后,除了肌肉收縮等變化,差異豐度蛋白質(zhì)還涉及了嘌呤核糖核苷三磷酸代謝過程、核糖核苷三磷酸代謝過程等。
2.2.2.2 KEGG通路分析結(jié)果
通過KEGG數(shù)據(jù)庫對所篩選的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行通路注釋分析,結(jié)果表明,4 d對比0 d組顯著富集到23 個KEGG通路,8 d對比4 d組顯著富集到18 個KEGG通路。由圖4A可知,宰后貯藏0~4 d差異蛋白質(zhì)主要參與的KEGG通路包括代謝途徑、碳代謝、氨基酸的生物合成、2-氧代羰基酸代謝、淀粉和蔗糖代謝等;由圖4B可知,宰后貯藏4~8 d差異蛋白質(zhì)主要參與的KEGG通路包括碳代謝、氨基酸的生物合成、代謝途徑、2-氧代羰基酸代謝、糖酵解/糖異生等。這些代謝過程可能通過影響結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)參與的生物學(xué)過程間接影響肉品的保水性。
圖4 不同貯藏期灘羊肉差異蛋白質(zhì)的 KEGG通路注釋Fig. 4 KEGG pathway annotation of differential abundant proteins in Tan sheep muscle during chilled storage
2.2.3 核心網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建
如圖5所示,34 個蛋白質(zhì)為0~4 d與4~8 d兩個貯藏階段共有的差異豐度蛋白質(zhì)。利用String數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)對共有的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行PPI分析,結(jié)果如圖6所示,共有34 個節(jié)點(diǎn),其中24 個差異蛋白質(zhì)之間具有明顯的互作關(guān)系。該網(wǎng)絡(luò)中PPI富集的值為1.0×10,聚類系數(shù)為0.521。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行核心互作網(wǎng)絡(luò)篩選,結(jié)果如圖7所示,10 個蛋白質(zhì)(原肌球蛋白2(tropomyosin 2,TPM2)、肌球蛋白輕鏈1(myosin light chain 1,MYL1)、肌鈣蛋白I2(troponin I2,TNNI2)、肌鈣蛋白C2(troponin C2,TNNC2)、肌鈣蛋白T3(troponin T3,TNNT3)、肌球蛋白輕鏈2(myosin light chain 2,MYL2)、輔肌動蛋白α3(actinin alpha 3,ACTN3)、肌動蛋白(細(xì)胞質(zhì)1)(actin cytoplasmic 1,ACTB)、肌動蛋白α1(actin alpha 1,ACTA1)、輔肌動蛋白α2(actinin alpha 2,ACTN2))處于該核心網(wǎng)絡(luò)中,且全部為灘羊肌肉結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。
圖5 不同貯藏期灘羊肉差異豐度蛋白質(zhì)的維恩圖Fig. 5 Venn diagram showing unique and shared differential abundant proteins
圖6 共有差異豐度蛋白質(zhì)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig. 6 Interaction network of shared differential abundance proteins
圖7 PPI核心網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建Fig. 7 Constructed core protein-protein interaction (PPI) network
由表2可知,TPM2、MYL1、TNNI2、TNNC2、TNNT3、MYL2、ACTN3、ACTB、ACTA1、ACTN2均為灘羊肌肉結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),且絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的表達(dá)下調(diào)發(fā)生在4~8 d,可能是由于這些結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)于貯藏后期發(fā)生了降解,而肌肉中的水分又儲存于肌肉結(jié)構(gòu)中,因此對灘羊肉保水性具有重要影響。TPM2、MYL1和肌鈣蛋白等在0~4 d內(nèi)上調(diào)表達(dá)可能是由于應(yīng)激蛋白的防護(hù)作用試圖維持肌肉結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。這些蛋白質(zhì)位于肌節(jié)、細(xì)胞器,與細(xì)胞骨架蛋白或離子結(jié)合,參與肌肉收縮以及ATP酶活性的調(diào)節(jié),富集于心肌收縮和肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)的代謝通路,表明這些蛋白質(zhì)通過肌肉的收縮及肌肉結(jié)構(gòu)的變化來影響灘羊肉的保水性。
表2 核心網(wǎng)絡(luò)中差異豐度蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化趨勢Table 2 Changes in expression levels of differential abundance proteins in the core PPI network
通過Pearson相關(guān)性分析確定核心蛋白質(zhì)表達(dá)量與灘羊肉保水性的關(guān)系。由表3可知,蒸煮損失率與離心損失率及MYL1表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(<0.05),與肌肉pH值及ACTA1表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05),與ACTN3表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)(<0.01);離心損失率與MYL2表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05),ACTN)表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)(<0.01);pH值與ACTB、ACTA1呈極顯著正相關(guān)(<0.01),與MYL1、TNNC2、TNNT3和ACTN2表達(dá)量呈極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01),與TPM2、TNNI2表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果表明,MYL1、ACTN3、ACTA1直接影響灘羊肉蒸煮損失,MYL2和ACTN3直接影響灘羊肉離心損失,其他結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)可能通過間接方式影響貯藏過程中灘羊肉保水性的變化。
表3 灘羊肉品質(zhì)指標(biāo)與核心差異豐度蛋白質(zhì)的相關(guān)性Table 3 Correlations between meat quality traits and core differential abundance proteins
相關(guān)性分析表明,結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)對蒸煮損失、離心損失均有顯著影響,肌肉pH值影響宰后貯藏過程中TNNC2、TNNT3等結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的變化,且肌肉pH值與灘羊肉保水性密切相關(guān)。諸多研究表明宰后貯藏期間鈣蛋白酶體系和細(xì)胞凋亡酶體系等組織蛋白水解酶促使細(xì)胞骨架蛋白降解會引起肌肉結(jié)構(gòu)的變化。Koohmaraie等研究表明,鈣蛋白酶系統(tǒng)在宰后肌肉蛋白質(zhì)水解中起著重要作用。其中-鈣蛋白酶誘導(dǎo)的關(guān)鍵肌原纖維蛋白降解是宰后肌肉蛋白水解的原因之一。王琳琳等研究表明,通過控制宰后肌肉細(xì)胞凋亡發(fā)生進(jìn)程來調(diào)節(jié)肌肉內(nèi)環(huán)境變化。肌肉中的水分主要以自由水、結(jié)合水和不易流動水3 種形式儲存于肌肉結(jié)構(gòu)中,因此肌肉的收縮及肌肉結(jié)構(gòu)的變化均可引起保水性的變化。郭兆斌等研究表明由于pH值的下降導(dǎo)致肌原纖維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)收縮,同時蒸煮條件下肌肉蛋白質(zhì)的熱變性使得肌原纖維緊縮,儲存水分空間變小,部分不易流動水變?yōu)樽杂伤魇?。此外,pH值降低會導(dǎo)致維持細(xì)胞骨架的連接蛋白變性,致使離心損失升高,且當(dāng)pH值接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時,蛋白質(zhì)靜電荷為零,對水的吸引能力減弱,也會造成水分流失。
蒸煮損失及離心損失均可反映灘羊肉保水性的變化情況,本研究中蒸煮損失率與MYL1表達(dá)量呈顯著正相關(guān),與肌肉pH值及ACTA1表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān),與ACTN3表達(dá)量呈極顯著正相關(guān);離心損失率與MYL2表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān),與ACTN3表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)。肌動蛋白與肌球蛋白均為骨骼肌中主要的肌原纖維蛋白,其中肌球蛋白占骨骼肌總蛋白的1/3以上,構(gòu)成肌肉結(jié)構(gòu)中的粗絲,肌動蛋白構(gòu)成細(xì)絲,二者在肌肉收縮中起著關(guān)鍵作用,產(chǎn)生收縮力。ACTN3作為骨骼肌Z線的構(gòu)成部分,負(fù)責(zé)形成肌動蛋白-肌動蛋白交聯(lián),與快型肌纖維功能有關(guān),而快型肌纖維功能又是引起肌肉劇烈收縮的原因,肌肉收縮會引起細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)儲存水分的空間減小,且會導(dǎo)致不易流動水轉(zhuǎn)化為自由水,由此引起水分流失的增加。因此,ACTA1、ACTN3、MYL2對灘羊肉的保水性有顯著影響。由于ACTN3與蒸煮損失率、離心損失率均具有很高的相關(guān)性,推測其可作為灘羊肉保水性的指示蛋白。左惠心采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究宰后牦牛肉保水性機(jī)制的過程中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)作為差異蛋白的一類,對牦牛肉保水性有重要影響,本研究結(jié)果與其一致。
pH值對ACTB、ACTA1、MYL1、TNNC2、TNNT3、ACTN2、TPM2、TNNI2均有顯著影響,這些蛋白質(zhì)分別為肌動蛋白(ACTB、ACTA1、ACTN2)、肌球蛋白輕鏈(MYL1)、肌鈣蛋白(TNNC2、TNNT3、TNNI2)、原肌球蛋白(TPM2),是肌肉結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成蛋白質(zhì)。其中,原肌球蛋白是一種高度保守的肌動蛋白結(jié)合蛋白,對肌動蛋白絲的穩(wěn)定和許多肌動蛋白功能的協(xié)同調(diào)節(jié)至關(guān)重要;肌鈣蛋白復(fù)合物由3 種調(diào)節(jié)蛋白組成,分別是肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T,可調(diào)節(jié)骨骼肌和心肌的肌肉收縮,TNNT3是一種僅在骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)的快速骨骼肌肌鈣蛋白;ACTB參與了細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架的形成;ACTA1對交叉連接的肌動蛋白絲起作用,并將其穩(wěn)定在相鄰細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)連接等結(jié)構(gòu)上,在胞質(zhì)分裂、細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用。pH值對這些結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)有重要影響可能是由于pH值變化直接影響了結(jié)構(gòu)蛋白水解酶的活性。pH值對這些結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的重要影響意味著屠宰后pH值變化顯著影響肌肉保水性等品質(zhì)指標(biāo)。肖雄等研究表明,在屠宰初期,由于氧氣供應(yīng)中斷,機(jī)體細(xì)胞很快處于無氧環(huán)境,葡萄糖及糖原的有氧分解變?yōu)闊o氧酵解,產(chǎn)生乳酸,肌肉pH值下降,從而使蛋白質(zhì)分子的多肽鏈變緊密、分子間距縮小,肌肉中的部分水分子被擠出,因而保水性下降;且當(dāng)pH值下降至蛋白質(zhì)的等電點(diǎn),蛋白質(zhì)(尤其是肌球蛋白)所攜帶的凈電荷為零,其正負(fù)電荷數(shù)量基本相等,蛋白質(zhì)中的陽性和陰性基團(tuán)互相吸引,對水的吸引能力減弱,導(dǎo)致水分流失。此外,肌球蛋白頭部在低pH值下的部分變性也被認(rèn)為是肌原纖維晶格間距收縮的主要原因,收縮可能會壓迫肌細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的水分流出,最終也會影響灘羊肉的保水性。
宰后0~8 d內(nèi),隨著貯藏時間延長,灘羊肉pH值先降低后有所回升,蒸煮損失率與離心損失率持續(xù)升高。利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析鑒定發(fā)現(xiàn)TPM2、MYL1、TNNI2、TNNC2、TNNT3、MYL2、ACTN3、ACTB、ACTA1、ACTN2共10 個核心差異豐度蛋白質(zhì)。其中TPM2、MYL1、TNNI2、TNNC2、TNNT3、MYL2、ACTN2在0~4 d表達(dá)上調(diào),4~8 d下調(diào);ACTB、ACTA1在0~4 d表達(dá)下調(diào),4~8 d 上調(diào);ACTN3 在0~8 d持續(xù)上調(diào)。這些蛋白質(zhì)位于肌節(jié)、肌纖維、細(xì)胞膜,通過與細(xì)胞骨架蛋白或離子結(jié)合,參與肌肉收縮以及ATP酶活性的調(diào)節(jié),引起肌肉收縮及肌肉結(jié)構(gòu)變化,最終影響灘羊肉的保水性。肌肉pH值對肌肉結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成蛋白質(zhì)ACTB、ACTA1、MYL1、TNNC2、TNNT3、ACTN2、TPM2、TNNI2有顯著影響,pH值及MYL1、ACTA1、ACTN3對蒸煮損失有重要影響,MYL2與ACTN3對離心損失有重要影響。