榆干離褶傘溶栓酶對動脈血栓大鼠血管內(nèi)膜的保護(hù)作用

崔日花，李 鈺，蘇 新，衛(wèi) 瑩，陳佳芮，沈明花,*

（1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

血栓形成過程中伴有血管的炎癥性損傷，內(nèi)皮細(xì)胞、血小板以及白細(xì)胞之間的相互作用是血管壁發(fā)生炎癥性損傷的病理基礎(chǔ)。血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能障礙、血小板的過度活化是血栓形成的重要因素。當(dāng)血管內(nèi)皮的完整性遭到破壞時內(nèi)皮下膠原被暴露，激活血小板，從而啟動血栓的形成。血小板的異?；罨蓪?dǎo)致病理性血栓的形成?；罨难“宀粌H參與血栓的形成，還通過脫顆粒或釋放5-羥色胺、細(xì)胞因子、組織胺等活性物質(zhì)參與并促進(jìn)炎癥反應(yīng)。血小板通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞以及白細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)血小板和白細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、滾動，從而加重炎癥反應(yīng)。因此，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和抑制血小板的過度活化對血栓性疾病的治療及預(yù)后具有重要意義。

榆干離褶傘（）屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、口蘑科、離褶傘屬，分布于我國河北、吉林等地。作為食藥用菌，榆干離褶傘具有抗氧化、保肝、抗栓等功效。榆干離褶傘溶栓酶（fibrinolytic enzyme，LUFE）是榆干離褶傘菌絲體中分離純化的一種溶栓酶，具有抗栓、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用。研究表明LUFE抑制血栓形成過程中血小板的過度活化。諸多研究結(jié)果表明，血栓形成過程中并存炎癥反應(yīng)，而且這種炎癥反應(yīng)和血栓的形成相互聯(lián)系、相互促進(jìn)。血小板作為炎癥細(xì)胞，在這種血栓-炎癥過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過大鼠動脈血栓模型研究LUFE在血栓形成過程中對血管內(nèi)膜炎性損傷的保護(hù)作用；同時在體外觀察膠原誘導(dǎo)的血小板活化過程中LUFE對血小板黏附功能的影響及其對相關(guān)信號通路的調(diào)控作用，進(jìn)一步明確其抗栓及抗炎機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

50 只SD大鼠（SCXK（吉）2017-0003，SYXK（吉）2020-0010），雌雄各半，體質(zhì)量180～200 g，延邊大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。

LUFE從榆干離褶傘菌絲體中分離提取，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室提供。

C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（platelet endothelial cell adhesion moleculer-1，PECAM-1）試劑盒上海嚴(yán)謹(jǐn)生物科技有限公司；四甲基異硫氰酸羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（tetramethylrhodamine isothiocyanate Phalloidin，TRITC Phalloidin）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 北京索萊寶科技有限公司；鈣離子熒光探針Fluo-4 AM 美國BD公司；膠原 美國Chrono-log公司；T細(xì)胞跨膜連接蛋白（linker for activation of T cells，LAT）抗體、磷酸化LAT（phospho-LAT，p-LAT）抗體、磷脂酶Cγ（phospholipase Cγ，PLCγ）抗體、磷酸化PLCγ（phospho-PLCγ，p-PLCγ）抗體 英國Abcam公司；-actin抗體 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RT-2100型酶標(biāo)儀 深圳雷杜公司；流式細(xì)胞儀美國Beckman公司；凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；BX53F光學(xué)顯微鏡 日本Olympus株式會社。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及模型的建立

將50 只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、阿司匹林組、LUFE低劑量組和LUFE高劑量組，每組10 只。阿司匹林組（10 mg/kg阿司匹林）和LUFE低（100 mg/kgLUFE）、高（400 mg/kgLUFE）劑量組分別按相應(yīng)劑量灌胃阿司匹林或LUFE（用水溶解后進(jìn)行灌胃，灌胃體積為2 mL），連續(xù)灌胃7 d，假手術(shù)組和模型組灌胃等體積生理鹽水。次日，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠后以建立頸動脈血栓模型。正中切開頸部，鈍性分離右側(cè)頸總動脈。假手術(shù)組用浸有生理鹽水的濾紙（1.0 cm×1.5 cm）包裹頸總動脈，濾紙外用無菌手術(shù)巾（1.0 cm×1.5 cm）包裹。其余各組以浸有20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）三氯化鐵（FeCl）溶液的濾紙?zhí)娲猩睇}水的濾紙。20 min后取下濾紙，更換新的無菌手術(shù)巾，并用浸有生理鹽水的紗布濕敷暴露的頸動脈。40 min后結(jié)扎與手術(shù)巾等長的血管，并剪下該段頸動脈備蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。剖胸，暴露心臟，用采血管采血，取100 μL全血用于流式細(xì)胞儀測定血小板-白細(xì)胞聚集體（platelet-leukocyte aggregates，PLA）水平。全血室溫放置1 h，2 500 r/min離心10 min，取其上清液即為血清，-20 ℃保存以備用。

1.3.2 血管組織形態(tài)學(xué)檢查

以4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）多聚甲醛溶液固定1.3.1節(jié)收集的大鼠頸動脈組織，經(jīng)HE染色后置于200 倍光學(xué)顯微鏡下觀察血管腔及血管壁結(jié)構(gòu)變化。

1.3.3 血清CRP、IL-6、IL-8、MCP-1、ICAM-1和PECAM-1質(zhì)量濃度的測定

取1.3.1節(jié)得到的血清，分別按照試劑盒說明書用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清中CRP、IL-6、IL-8、MCP-1、ICAM-1和PECAM-1質(zhì)量濃度。

1.3.4 PLA水平的測定

假手術(shù)組、模型組、阿司匹林組、LUFE高劑量組分別取50 μL大鼠全血置于1.5 mL離心管中，每管加入1 mL的紅細(xì)胞裂解液后避光反應(yīng)10 min。每管以500×離心5 min，棄去上清液，加入500 μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.2，下同）洗滌細(xì)胞，再以500×離心5 min。棄去上清液，用PBS定容至100 μL。在細(xì)胞懸液中加入藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記的CD45和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的CD61抗體各2 μL，同型對照管中加入FITC標(biāo)記的免疫球蛋白G1。避光孵育20 min后加入預(yù)冷的1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）多聚甲醛溶液。4 h內(nèi)用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測，按下式計算PLA水平。

1.3.5 血小板懸液的制備

取健康志愿者的靜脈血，用臺氏液按照1∶1等體積稀釋全血，同時加入前列腺素E1（prostaglandine 1，PGE1）（終質(zhì)量濃度為50 ng/mL），然后以200×離心15 min，收集上清液后再以1 000×離心10 min，棄去上清液。用1.5 倍體積的臺氏液重懸血小板，并加入PGE1（終質(zhì)量濃度為50 ng/mL）以及乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（終濃度為1 mmol/L），混勻后850×離心10 min，棄去上清液。用臺氏液重懸血小板，并調(diào)整血小板濃度為3×10個/mL。

1.3.6 熒光染色法檢測血小板在固化膠原上的黏附

24 孔板分為空白對照組、正常對照組以及LUFE低、中、高劑量組。將干凈的蓋玻片放入24 孔板中，空白對照組以250 μL 1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）BSA溶液包被，正常對照組以及LUFE不同劑量組以250 μL 5 μg/mL膠原包被，4 ℃靜置12 h后用PBS洗滌，每孔加入1% BSA溶液封閉1 h后吸棄多余的BSA溶液，用PBS洗滌。將1.3.5節(jié)制備的血小板懸液用臺氏液稀釋成2×10個/mL，取血小板懸液分別加入不同劑量的LUFE溶液（終質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0 mg/mL），空白對照組和正常對照組加入等體積臺氏液，在37 ℃孵育5 min。分別取250 μL上述孵育后的各組血小板懸液加到24 孔板對應(yīng)組中，37 ℃孵育1 h。PBS洗滌后用4%多聚甲醛固定15 min，隨后用PBS洗滌。每孔加入200 μL TRITC Phalloidin避光染色1 h，然后用PBS洗滌，采用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，并用Image J軟件分析計算黏附面積（以相對面積百分比表示）。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板Ca水平

將1.3.5節(jié)制備的血小板懸液分為4 組：正常對照組、膠原組以及LUFE低劑量（0.5 mg/mL）和高劑量（2.0 mg/mL）組。LUFE低、高劑量組在3×10個/mL的血小板懸液中分別加入終質(zhì)量濃度為0.5、2.0 mg/mL的LUFE溶液，其余2 組的血小板懸液中分別加入等體積的臺氏液，37 ℃孵育5 min。隨后在膠原組和LUFE不同劑量組的血小板懸液中加入終質(zhì)量濃度2 μg/mL的膠原溶液，正常對照組的血小板懸液中加入等體積的臺氏液，在37 ℃孵育5 min。在各組血小板懸液中分別加入Fluo-4 AM染料（終濃度為5 μmol/L），37 ℃避光孵育30 min。在避光條件下，以臺氏液洗滌多余的染料，300×離心5 min。用500 μL臺氏液重懸，用流式細(xì)胞儀測定熒光強(qiáng)度，以表征血小板內(nèi)Ca水平。

1.3.8 Western blot檢測LAT和PLCγ磷酸化水平

將1.3.5節(jié)制備的血小板懸液分為5 組：正常對照組、膠原組和LUFE低、中、高劑量組。LUFE低、中、高劑量組在血小板懸液（3×10個/mL）中分別加入終質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0 mg/mL的LUFE溶液，正常對照組和膠原組的血小板懸液中加入等體積臺氏液，在37 ℃孵育5 min。除正常對照組以外的其余4 組分別加入終質(zhì)量濃度2 μg/mL膠原溶液37 ℃孵育5 min。各組血小板懸液中分別加入蛋白裂解液并在冰浴中裂解30 min，然后12 000 r/min離心15 min，取上清液即為血小板蛋白樣品。用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取20 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉(zhuǎn)模至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。然后將PVDF膜用5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）脫脂奶粉封閉2 h，分別加入相應(yīng)的一抗，在4 ℃孵育12 h。用TBST洗滌3 次后加入二抗，在室溫孵育2 h，洗滌3 次，然后用凝膠成像儀進(jìn)行分析，用磷酸化蛋白條帶灰度占蛋白條帶灰度的比例表征磷酸化水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用檢驗進(jìn)行顯著性分析，＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 LUFE對動脈血栓大鼠血管組織形態(tài)學(xué)的影響

如圖1所示，假手術(shù)組頸動脈內(nèi)膜光滑完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞排列連續(xù)，無血管內(nèi)皮細(xì)胞剝脫，管腔內(nèi)未見血栓形成和炎癥細(xì)胞浸潤。模型組血管內(nèi)膜氧化損傷，內(nèi)膜上未見血管內(nèi)皮細(xì)胞，管腔內(nèi)可見較多的炎癥細(xì)胞和混合血栓的形成。與模型組相比，阿司匹林組和LUFE高劑量組血管內(nèi)膜的損傷程度減輕，血栓形成比較稀疏，血小板聚集程度明顯減少，偶見少量的炎性細(xì)胞。

圖1 LUFE對頸動脈血栓大鼠血管形態(tài)的影響（200×）Fig. 1 Effect of LUFE on carotid arterial tissue morphology in rats (200 ×)

2.2 LUFE對動脈血栓大鼠血清IL-8、IL-6和CRP質(zhì)量濃度的影響

由巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等分泌的IL-8具有趨化中性粒細(xì)胞的作用，還可以激活中性粒細(xì)胞分泌一些生物活性物質(zhì)，促進(jìn)局部的炎癥反應(yīng)。IL-6作為促炎因子，可以誘導(dǎo)高凝狀態(tài)，促進(jìn)內(nèi)皮素的生成，引起血管壁的損傷，從而促進(jìn)血栓形成。CRP作為炎癥、感染和組織損傷的非特異性標(biāo)志物，與急性期反應(yīng)相關(guān)，可以促進(jìn)血小板活化和血栓形成。如表1所示，模型組大鼠的IL-8、IL-6和CRP質(zhì)量濃度顯著或極顯著高于假手術(shù)組（＜0.05、＜0.01），提示FeCl作用于血管壁后引起局部組織的炎癥反應(yīng)。與模型組相比，阿司匹林組IL-8、CRP質(zhì)量濃度極顯著下降（＜0.01），而LUFE高劑量組IL-8、IL-6和CRP質(zhì)量濃度顯著或極顯著下降（＜0.05、＜0.01），說明阿司匹林和高劑量的LUFE可以抑制炎癥因子的產(chǎn)生或釋放。

表1 LUFE對IL-8、IL-6和CRP質(zhì)量濃度的影響Table 1 Effect of LUFE on serum levels of IL-8, IL-6 and CRP

2.3 LUFE對動脈血栓大鼠血清MCP-1、ICAM-1和PECAM-1質(zhì)量濃度的影響

MCP-1主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞表達(dá)，具有趨化激活單核細(xì)胞的作用，在炎癥過程中起重要作用。ICAM-1為跨膜糖蛋白，存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞和外周白細(xì)胞，參與白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附及白細(xì)胞向血管外遷移。PECAM-1是一種在血小板、單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞中表達(dá)的黏附分子，在內(nèi)皮細(xì)胞損傷時促進(jìn)血小板與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及白細(xì)胞的遷移。如表2所示，模型組大鼠MCP-1、PECAM-1質(zhì)量濃度極顯著高于假手術(shù)組（＜0.01）。與模型組相比，經(jīng)阿司匹林或LUFE干預(yù)的大鼠MCP-1、ICAM-1和PECAM-1質(zhì)量濃度極顯著下降（＜0.01），提示阿司匹林和LUFE能一定程度地減弱炎癥細(xì)胞的趨化和細(xì)胞間的黏附反應(yīng)。

表2 LUFE對MCP-1、ICAM-1和PECAM-1質(zhì)量濃度的影響Table 2 Effect of LUFE on serum levels of MCP-1, ICAM-1 and PECAM-1

2.4 LUFE對動脈血栓大鼠PLA水平的影響

血小板表達(dá)的黏附分子與活化的中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞相互作用，形成PLA，其水平是反映體內(nèi)炎癥-血栓狀態(tài)的敏感指標(biāo)之一。如圖2所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠PLA水平顯著升高（＜0.05），提示血栓性形成過程中伴有炎癥。與模型組相比，LUFE高劑量大鼠的PLA水平顯著降低（＜0.05），提示LUFE具有抑制血栓形成過程中的炎癥反應(yīng)。

圖2 LUFE對PLA水平的影響Fig. 2 Effect of LUFE on serum levels of PLA

2.5 LUFE對血小板在固化膠原上黏附的影響

如圖3所示，空白對照組中見到少量的血小板黏附在BSA表面，其黏附面積為（0.77±0.44）%，說明血小板在BSA表面黏附很少。正常對照組血小板在膠原上的黏附面積為（16.97±2.52）%，與空白對照組相比極顯著增多（＜0.01）。LUFE低、中、高劑量組血小板在膠原上的黏附面積分別為（13.79±1.08）%、（9.22±1.77）%、（7.08±1.56）%，與正常對照組相比顯著或極顯著降低（＜0.05、＜0.01），提示LUFE能抑制血小板在膠原上的黏附。

圖3 LUFE對血小板在膠原上黏附的影響Fig. 3 Effect of LUFE on platelet adhesion to collagen

2.6 LUFE對血小板Ca2+水平的影響

鈣離子熒光探針Fluo-4 AM常用于檢測細(xì)胞內(nèi)的Ca水平。細(xì)胞內(nèi)的酯酶催化Fluo-4 AM裂解后結(jié)合Ca產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。因此，本實(shí)驗選用Fluo-4 AM染料檢測血小板內(nèi)Ca水平。如圖4所示，膠原組熒光強(qiáng)度為54.26±4.24，與正常對照組（19.76±1.63）相比，熒光強(qiáng)度極顯著升高（＜0.01）；LUFE低、高劑量組血小板熒光強(qiáng)度分別為52.11±2.34和37.45±3.54，與膠原組相比明顯降低。結(jié)果說明LUFE能夠抑制膠原引起的血小板內(nèi)Ca水平的升高。

圖4 LUFE對血小板內(nèi)Ca2＋水平的影響Fig. 4 Effect of LUFE on Ca2+ levels in platelets

2.7 LUFE對血小板LAT、PLCγ蛋白磷酸化水平的影響

如圖5所示，與正常對照組比較，膠原組血小板LAT、PLCγ的磷酸化水平極顯著升高（＜0.01）；與膠原組相比，LUFE低劑量組血小板PLCγ磷酸化水平顯著下降（＜0.05），中、高劑量組血小板LAT、PLCγ磷酸化水平顯著或極顯著降低（＜0.05、＜0.01），提示LUFE不同程度抑制膠原誘導(dǎo)的LAT、PLCγ的活化。

圖5 LUFE對血小板LAT、PLCγ磷酸化水平的影響Fig. 5 Effect of LUFE on the phosphorylation levels of LAT and PLCγ in platelets

3 討 論

血栓形成是引發(fā)心血管疾病的重要因素之一。文獻(xiàn)報道，血栓形成與炎癥密切相關(guān)，而在此過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板和炎癥細(xì)胞之間的相互作用影響其病理進(jìn)程。研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞合成的一氧化氮、前列環(huán)素等血管活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)血管張力和血小板反應(yīng)性，從而防止血栓形成。血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌或表達(dá)的細(xì)胞因子影響血小板的活化及炎癥細(xì)胞在內(nèi)皮上的黏附、滾動及遷移，進(jìn)而影響血栓-炎癥過程。因此，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞在一定程度上可以控制血栓的形成以及炎癥反應(yīng)，這對心血管疾病的防治具有重要意義。

本實(shí)驗以FeCl誘導(dǎo)大鼠頸動脈血栓模型，觀察了LUFE對血管內(nèi)膜損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，LUFE能減輕血栓形成過程中血管內(nèi)膜的損傷，并降低血清IL-8、IL-6、CRP、MCP-1、ICAM-1和PECAM-1質(zhì)量濃度。這表明LUFE可能通過降低炎癥因子、趨化因子及細(xì)胞黏附分子水平，抑制局部的炎癥反應(yīng)從而保護(hù)血管內(nèi)膜。

血小板的激活在血栓形成過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。當(dāng)血管內(nèi)膜損傷引起膠原暴露時血小板被活化并黏附于膠原上。另外，活化的血小板通過表達(dá)特定細(xì)胞因子，如P選擇素、趨化因子配體5（chemokine ligand 5，CCL5）和CD40L等，影響細(xì)胞間的黏附及白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上的滾動和遷移等過程。在這個過程中白細(xì)胞膜上的P選擇素糖蛋白配體1、CCR5和CD40與血小板上的相應(yīng)配體結(jié)合，形成PLA，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗結(jié)果顯示，LUFF干預(yù)后動脈血栓大鼠PLA水平降低，說明LUFE可能通過抑制血小板或白細(xì)胞的活化，從而抑制兩者的結(jié)合進(jìn)而減輕血管內(nèi)膜的炎性損傷。前期研究表明，大鼠頸動脈血栓模型中LUFE降低血小板膜CD62P的表達(dá)，這與本研究結(jié)果相符。

另外，本研究采用體外模擬的方法，觀察了血小板黏附膠原過程中LUFE的干預(yù)作用，并檢測了血小板Ca水平的變化。結(jié)果顯示，LUFE能顯著抑制血小板與膠原的黏附，并降低血小板內(nèi)Ca水平，提示LUFE能一定程度地抑制血小板的活化。為了闡明其作用機(jī)制，觀察了LUFE對膠原誘導(dǎo)的血小板膜糖蛋白VI（glycoprotein VI，GPVI）信號通路的調(diào)控作用。當(dāng)膠原作用于血小板膜GPVI受體復(fù)合物時，通過Src家族激酶的作用，激活Fc受體γ的免疫受體酪氨酸激活基序，繼而活化酪氨酸激酶。后者進(jìn)一步激活包括LAT在內(nèi)的下游信號，引起PLCγ的活化，促進(jìn)甘油二酯和三磷酸肌醇的生成。三磷酸肌醇作為第二信使促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)存儲Ca的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離Ca濃度升高，從而促進(jìn)血小板的活化。本研究結(jié)果顯示，LUFE干預(yù)能下調(diào)GPVI信號通路中的LAT和PLCγ蛋白的磷酸化水平，提示LUFE可能通過調(diào)控GPVI信號通路相關(guān)蛋白的激活而影響細(xì)胞內(nèi)Ca水平，進(jìn)而抑制血小板的活化。

綜上所述，LUFE抑制血栓形成過程中血管內(nèi)膜的損傷，其機(jī)制可能與LUFE的抗炎作用以及抗血小板活化有關(guān)。