紫甘薯多糖分離、組分鑒定及抗氧化代謝機(jī)理

袁 博，卜 偉，戴威威，鞠秀云，王 欣,*

（1.江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221131；2.江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 徐州 221116）

紫甘薯是甘薯（）的一種紫色品種，是重要的經(jīng)濟(jì)作物，可作為糧食、飼料和工業(yè)原料使用，具有重要的產(chǎn)業(yè)地位。研究表明，紫甘薯塊根提取物具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等作用，可用于預(yù)防心血管疾病和糖尿病，保健功能開發(fā)價(jià)值極高。

紫甘薯中含有多種重要的活性成分，如花色苷、多酚、黃酮和多糖。其中多糖是具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、降血糖等功效的一類天然生物大分子，也是食品中重要的功能因子之一。研究開發(fā)紫甘薯多糖，探究其活性機(jī)制是目前紫甘薯多糖研究領(lǐng)域熱點(diǎn)問題。Sun Jian等從紫甘薯中分離獲得一種堿溶性多糖，研究表明其具有調(diào)節(jié)腸道微生物和抗炎癥的活性。Tang Chao等從紫甘薯中分離獲得一種可以調(diào)節(jié)免疫力的多糖，研究表明其可以增強(qiáng)小鼠體內(nèi)免疫球蛋白A等免疫蛋白的表達(dá)水平。此外，紫甘薯多糖還在抗氧化、抗腫瘤、益生和護(hù)肝方面具有重要的應(yīng)用潛力。

由于氧化因子的存在，細(xì)胞內(nèi)會(huì)因氧化和抗氧化作用失衡導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累過量時(shí)會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)生物大分子，如造成蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷，最終導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生病理變化。目前，對(duì)于細(xì)胞氧化損傷的研究主要集中于測(cè)定氧化損傷過程中關(guān)鍵酶（如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalyse，CAT）和谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px））活力以及脂質(zhì)氧化產(chǎn)物（丙二醛（malonaldehyde，MDA））的含量以評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的水平。

本研究以紫甘薯為原料，通過高速逆流色譜技術(shù)分離獲得一種水溶性多糖，通過高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）分別鑒定其單糖組成和糖苷鍵構(gòu)型；利用HO構(gòu)建細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，以評(píng)估紫甘薯多糖的抗氧化特性；同時(shí)通過代謝組學(xué)闡釋紫甘薯多糖抗氧化的代謝機(jī)制，以期為紫甘薯多糖的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫甘薯（‘徐紫薯8號(hào)’）采自江蘇徐州，洗凈、切塊、低溫烘干備用。

鼠李糖（rhamnose，Rha）、葡萄糖（glucose，Glc）、甘露糖（mannose，Man）、半乳糖（galactose，Gal）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）（純度均大于98%） 上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇、氯化鈉（均為色譜純）和其余試劑（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；100T-500T ROS測(cè)定試劑盒（化學(xué)熒光法）、CAT測(cè)定試劑盒（可見光法）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測(cè)定試劑盒等均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

AB Triple 4600高分辨液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（liquid chromatography-time of flight mass chromatography，LC-TOF MS）、4500三重四極桿液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometer，LC-MS/MS） 美國(guó)AB SCIEX公司；7890A-5975C GC-MS儀 美國(guó)安捷倫科技公司；OptiChromeA-600高速逆流色譜儀 江陰逆流科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫甘薯多糖提取

稱取風(fēng)干紫甘薯塊1 kg，以料液比1∶10（/）加入蒸餾水超聲提取30 min，過濾，反復(fù)操作3 次，合并提取液。調(diào)節(jié)pH值為4，向提取液中加入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%纖維素酶（10 000 U/g），室溫水解2 h，然后加入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%酸性蛋白酶解液（≥45 U/mg）繼續(xù)水解1 h。減壓旋蒸濃縮多糖提取液至原有體積的1/3后加入一定體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液至乙醇終體積分?jǐn)?shù)為75%，靜置過夜，3 000 r/min下離心，棄去上清液得沉淀。65 ℃水浴減壓濃縮除去乙醇，加超純水溶解，冷凍干燥獲得紫甘薯粗多糖（polysaccharide from purple sweet potato，PSPP）。利用Sevag法去除PSPP中的蛋白質(zhì)：取PSPP溶于蒸餾水中（1∶10，/），按體積比4∶1加入氯仿-正丁醇混合溶液（4∶1，/），混合后，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，振蕩、靜置、分層，取上層水相溶液按體積比繼續(xù)加入氯仿-正丁醇混合溶液后萃取。反復(fù)3～4 次，直至上層溶液在250～280 nm波長(zhǎng)處無吸收峰，冷凍干燥獲得去除蛋白的PSPP。

1.3.2 紫甘薯多糖的分離純化

配制甲醇-甲基叔丁基醚-水混合溶液（3∶1∶2，/），靜置過夜，下層為流動(dòng)相，上層為固定相。使用高壓泵將上層相以1 mL/min的速率泵入高速逆流色譜儀中，當(dāng)出口出現(xiàn)液體后，開啟高速逆流色譜儀，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，轉(zhuǎn)向?yàn)檎?，柱?0 ℃。利用高壓泵將下層相泵入高速逆流色譜儀中（1 mL/min）中，穩(wěn)定60 min。取1 g凍干PSPP，使用5 mL下層相溶劑溶解，使用針泵注入PSPP溶液，開啟自動(dòng)接收器，使用示差檢測(cè)器進(jìn)行監(jiān)測(cè)。取吸收峰對(duì)應(yīng)的接受試管樣品，冷凍干燥，分別獲得純化多糖PSPP01、PSPP02、PSPP03和PSPP04。采用DPPH自由基清除能力測(cè)定試劑盒測(cè)定DPPH自由基清除率，篩選抗氧化活性最大的多糖，結(jié)果顯示只有PSPP03具有較明顯的DPPH自由基清除活性，故以PSPP03進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 PSPP03分子質(zhì)量測(cè)定及傅里葉變換紅外光譜分析

利用高效液相凝膠色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法進(jìn)行分子質(zhì)量分析，色譜柱為OHpak SB-804HQ柱（8.0 mm×300 mm，10 μm），流動(dòng)相為0.1 mol/L NaSO，流速為0.5 mL/min，柱溫35 ℃，采用示差檢測(cè)器檢測(cè)。以分子質(zhì)量為4 300、20 000、44 100、63 000 Da和123 500 Da的葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品，以保留時(shí)間和葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)進(jìn)行擬合，得到線性回歸方程，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算PSPP03的分子質(zhì)量。

采用傅里葉變換紅外光譜對(duì)多糖結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行表征：取約10 mg樣品按質(zhì)量比1∶200加入溴化鉀，充分研磨后，放入壓片機(jī)壓片。使用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行分析，掃描范圍500～4 000 cm（步長(zhǎng)為1 cm）。

1.3.4 PSPP03單糖組成分析

PSPP03單糖組成分析參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行。取500 mg PSPP03加入安瓿瓶中，加入5 mL鹽酸-甲醇溶液（2 mol/L），在氮?dú)獗Ｗo(hù)下置于80 ℃金屬浴中水解15 h，氮?dú)獯蹈?，加? mL三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液（2 mol/L），升溫至120 ℃，繼續(xù)水解2 h。冷卻，過濾除去不溶物，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮除去TFA，加水洗滌，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，反復(fù)3 次，向最后一次濃縮產(chǎn)物加入2 mL蒸餾水，溶解即得完全水解產(chǎn)物PSPP03-B，待用。

使用HPLC分析單糖組成，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)0.05%甲酸-水溶液，流速0.5 mL/min，色譜柱為Repromer Ca（250 mm×8 mm，9 μm），柱溫40 ℃，使用示差檢測(cè)器進(jìn)行監(jiān)測(cè)。采用相同的方法分析Man、GlcA、Rha、Glc、Gal、Ara標(biāo)準(zhǔn)品。

使用0.5 mol/L的TFA溶液對(duì)PSPP03進(jìn)行不完全水解（料液比為1∶20），用超純水透析（截留分子質(zhì)量50 000 Da），透析后取透析袋內(nèi)樣品（PSPP03-B）用2 mol/L的TFA溶液進(jìn)行水解（料液比為1∶20），按照上述方法測(cè)定單糖組成，以確定主鏈單糖和側(cè)鏈單糖組成。

1.3.5 PSPP03甲基化組成分析

取500 mg PSPP03于反應(yīng)瓶中，加入2 mL干燥的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液，溶解后加入20 mg干燥的NaOH，超聲1 h使NaOH完全溶解，冰浴30 min，加入1 mL干燥的碘甲烷，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，超聲處理反應(yīng)液1 h。加入蒸餾水終止甲基化反應(yīng)。加入1 mol/L乙酸溶液中和反應(yīng)。用超純水對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行透析（截留分子質(zhì)量50 000 Da）至袋內(nèi)顏色透明，冷凍干燥。將甲基化的多糖樣品溶于體積分?jǐn)?shù)90%甲酸溶液，密封后110 ℃解聚反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后減壓蒸干，分別加入3 mL甲醇重復(fù)蒸干5 次。轉(zhuǎn)移樣品于含有2 mol/L TFA溶液的安瓿管中，封管后110 ℃水解反應(yīng)2 h，隨后減壓蒸干。再加入3 mL蒸餾水充分溶解樣品，隨后加入30 mg NaBH還原乙?；笾频眉谆囊宜嵫苌?，使用氯仿萃取，回收氯仿層物質(zhì)，減壓濃縮后進(jìn)行GC-MS分析。

GC條件：毛細(xì)管柱為HP-5（30 m×0.32 mm，0.25 μm），進(jìn)樣口溫度250 ℃，程序升溫，起始溫度為80 ℃，以10 ℃/min升至260 ℃，保持10 min。

MS條件：電子電離離子源，離子源溫度280 ℃，氦氣流速1 mL/min。

1.3.6 多糖中花青素鑒定及活性檢測(cè)

取適量PSPP03，按質(zhì)量體積比1∶2加入水溶解，超聲輔助溶解，過濾，清液轉(zhuǎn)移至DEAE-52大孔樹脂柱內(nèi)，使用體積分?jǐn)?shù)20%～60%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，分別收集有色段（花青素）和無色段洗脫液。將用斐林試劑檢測(cè)出含有多糖的無色段洗脫液合并，冷凍干燥獲得去除花青素的多糖PSPP03-E。有色段濃縮后，使用氮?dú)獯蹈蓛x進(jìn)行處理，獲得有色段物質(zhì)PSPP03-P，PSPP03-P使用體積分?jǐn)?shù)0.5%甲酸-甲醇溶液溶解后，利用LC-MS/MS進(jìn)行分析。利用矢車菊素-3葡萄糖為內(nèi)標(biāo)（標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：＝417 726-108 870，＝0.999 7）進(jìn)行定量計(jì)算。

質(zhì)譜條件：正離子模式全掃描和自動(dòng)二級(jí)離子掃描，掃描范圍為100～1 200/，載氣為干燥氮?dú)?，離子源溫度550 ℃，霧化氣壓力55 psi，渦輪增壓氣壓力55 psi，氣簾氣壓力25 psi，全掃描分析。

液相色譜條件：選用ACQUITY UPLC HSS T3 C色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)5%甲酸-水溶液，B為體積分?jǐn)?shù)5%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脫為0～8 min 97% A，8～30 min 92% A，30～35 min 80% A，35～40 min 75% A，隨后流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)升至97%，穩(wěn)定5 min。

為探究PSPP03結(jié)構(gòu)對(duì)抗氧化能力的影響，采用DPPH自由基清除能力測(cè)定試劑盒分析PSPP03-E和PSPP03-P的抗氧化活性。

1.3.7 細(xì)胞培養(yǎng)、造模和給藥處理

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基+10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，后同）胎牛血清+1%鏈霉素-青霉素溶液），取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，接種至6 孔板中，24 h細(xì)胞貼壁情況良好、覆蓋率為80%時(shí)給藥。

實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組（CK）為正常培養(yǎng)細(xì)胞；造模組（HO處理組）為體積分?jǐn)?shù)30% HO溶液孵育6 h；給藥組（HO+PSPP03）為不同質(zhì)量濃度（25 μg/mL和100 μg/mL，根據(jù)DPPH自由基清除率所選擇）PSPP03預(yù)處理24 h，再用HO孵育6 h。

1.3.8 細(xì)胞活力測(cè)定

采用噻唑藍(lán)（thiazolyl blue，MTT）法測(cè)定細(xì)胞活力，取1.3.7節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞，每孔加入5 g/L MTT處理4 h，棄掉上清液，加入DMSO重懸，振蕩10 min溶解沉淀，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。細(xì)胞存活率按下式計(jì)算，設(shè)置6 個(gè)平行。

1.3.9 ROS及抗氧化酶活力測(cè)定

按1.3.7節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞，使用ROS測(cè)定試劑盒（化學(xué)熒光法）測(cè)定ROS水平。同理，MDA、SOD、CAT、GSH-Px和還原型/氧化型谷胱甘肽（reduced glutathione/oxidized glutathione，GSH/GSSG）等水平均采用相應(yīng)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.3.10 代謝組學(xué)分析

取1.3.7節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞并離心，沉淀中加入適量甲醇-丙酮（1∶1，/）混合溶液，超聲提取30 min，12 000 r/min冷凍離心15 min，取上清液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，使用0.5 mL甲醇溶解殘余物，過0.22 μm濾膜，進(jìn)LC-MS/MS分析。

色譜條件：選用ACQUITY UPLC HSS T3 C色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-水溶液，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%乙腈-水溶液。梯度洗脫：0～5 min，5% B；5～10 min，5%～90% B；10～15 min，90% B；11 min，5% B。流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫35 ℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離離子源，正離子模式，碰撞能量（40±15）eV，電壓5 500 V，離子源溫度600 ℃，霧化氣壓力55 psi，渦輪增壓氣壓力55 psi，氣簾氣壓力25 psi，全掃描分析，質(zhì)量掃描范圍55～1 000 Da，一級(jí)質(zhì)譜采集頻率為0.25 s，二級(jí)質(zhì)譜采集頻率0.1 s。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用GraphPrism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素分析法進(jìn)行顯著性分析，以＜0.05表示差異顯著。

代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采用Peakview軟件對(duì)采集的譜圖進(jìn)行峰提取，利用Markview軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。得到的數(shù)據(jù)集導(dǎo)入SIMCA 13.0軟件進(jìn)行主成分分析和正交偏最小二乘判別分析，獲得差異代謝物。根據(jù)差異代謝物的碎片信息，在人類代謝組數(shù)據(jù)庫（The Human Metabolome Database，HMDB）中進(jìn)行比對(duì)，最終鑒定出差異代謝物。將差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0軟件檢索出富集代謝通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫甘薯多糖分離純化及鑒定結(jié)果

圖1A為PSPP高速逆流色譜分離圖，可以看出，PSPP在高速逆流色譜上共有4 個(gè)明顯分離的峰。每個(gè)色譜峰分離度較好，表明可以利用高速逆流色譜對(duì)紫甘薯多糖進(jìn)行一步分離、純化。通過收集各色譜峰樣品，對(duì)各色譜峰樣品進(jìn)行抗氧化活性測(cè)試，如圖1B所示，PSPP03抗氧化活性最好，DPPH自由基清除率達(dá)到（92.27±5.03）%，接近PSPP的DPPH自由基清除率（（95.05±6.77）%）。同質(zhì)量濃度下，PSPP03 DPPH自由基清除率顯著高于VC（＜0.05），其他3 個(gè)多糖DPPH自由基清除率都不足10%，因此選取PSPP03作為后續(xù)研究的多糖樣本。

圖1 紫甘薯多糖分離純化及鑒定結(jié)果Fig. 1 Isolation and identification of polysaccharides from purple sweet potato

2.2 PSPP03分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

使用不同分子質(zhì)量的葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用HPGPC得到線性回歸方程為lg=1.257 1-4.092 7（＝0.997 2）。將PSPP03在HPGPC中的保留時(shí)間代入線性回歸方程，計(jì)算得到分子質(zhì)量為29.1 kDa。通過圖1C可知，PSPP03在HPGPC上吸收峰相對(duì)狹窄且對(duì)稱，說明PSPP03分子質(zhì)量分布相對(duì)均一，為均一組分。

2.3 PSPP03傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

PSPP03的傅里葉變換紅外光譜如圖1D所示，3 435 cm處是—OH的伸縮振動(dòng)峰，1 615 cm處吸收峰可能歸屬于糖醛酸中C＝O基團(tuán)，1 413 cm處吸收峰則可能是由多糖中甲基的彎曲振動(dòng)所引起，同時(shí)1 040 cm處吸收峰由C—O—C的伸縮振動(dòng)引起，提示PSPP03組分中存在吡喃糖環(huán)。綜上，PSPP03在紅外譜圖中存在多糖的特征吸收峰，且可能為酸性多糖。

2.4 PSPP03單糖組成

利用HPLC分析PSPP03完全水解產(chǎn)物和不完全水解的產(chǎn)物PSPP03-B，結(jié)果如圖2所示，PSPP03主要是由-Ara、-Man、-Rha、-GlcA和-Glc組成，物質(zhì)的量比為16.2∶25.3∶7.1∶8.6∶10.8。PSPP03不完全水解后單糖主要為-Ara、-Man、-Rha和-Glc，物質(zhì)的量比為10.6∶24.76∶6.6∶6.2，表明PSPP03主鏈主要是由這4 種單糖組成，側(cè)鏈主要以-GlcA和部分-Ara和-Glc組成。

圖2 PSPP03單糖組成HPLC色譜圖Fig. 2 HPLC chromatogram showing monosaccharide composition of PSPP03

2.5 PSPP03甲基化分析結(jié)果

甲基化分析是一種檢測(cè)多糖主鏈中糖苷鍵類型的有效方法。利用GC-MS對(duì)PSPP03甲基化產(chǎn)物進(jìn)行分析，通過比對(duì)保留時(shí)間和質(zhì)譜碎片信息，如表1所示，PSPP03結(jié)構(gòu)中主要有7 種連接類型，包括→4)-Ara-(→1、→3)-Man-(1→、→3,4)-Man-(1→、→3,6)-Man-(1→、→3)-Glc-(1→、Glc-(1→和→4)-Rha-(1→，通過計(jì)算，上述7 種連接類型的物質(zhì)的量比為21.34∶16.24∶2.65∶15.61∶15.61∶10.08∶11.75。根據(jù)單糖組成、物質(zhì)的量比和甲基化物質(zhì)的量比的結(jié)果，推測(cè)Glc-(1→可能是GlcA完全甲基化后被還原的產(chǎn)物。因此，結(jié)合單糖組成分析，PSPP03的主鏈主要連接類型可能有→4)-Ara-(→1、→3)--Man-(1→、→3,4)--Man-(1→、→3,6)--Man-(1→、→3)--Glc-(1→和→4)--Rha-(1→，而側(cè)鏈的連接形式可能主要為-Glc-(1→以及→4)--Ara-(→1和→3)--Glc-(1→。

表1 PSPP03甲基化組成分析結(jié)果Table 1 Methylation results of PSPP03

2.6 PSPP03中花青素分析結(jié)果

根據(jù)多糖和花青素結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，花青素結(jié)構(gòu)中的羥基易與多糖中羥基通過氫鍵進(jìn)行結(jié)合。利用LC-MS/MS對(duì)PSPP03中花青素組分進(jìn)行鑒定，結(jié)果如表2所示。PSPP03共鑒定出4 個(gè)花青素組分，分別為矢車菊素-3-槐糖苷-5-葡萄糖、芍藥素-3-槐糖苷-5-葡萄糖、矢車菊素-3-羥基苯甲?；碧擒?5-葡萄糖和矢車菊素-3-(6’’’-咖啡?；碧擒?-5-葡萄糖。通過內(nèi)標(biāo)定量計(jì)算后，4 種花青素在PSPP03中的含量分別為14.68、12.62、2.85 μg/100 mg和6.82 μg/100 mg。結(jié)果表明，PSPP03結(jié)構(gòu)中存在一定含量的花青素，其主要成分為矢車菊素-3-槐糖苷-5-葡萄糖和芍藥素-3-槐糖苷-5-葡萄糖。

表2 PSPP03中花青素鑒定及含量Table 2 Identification and concentrations of anthocyanins in PSPP03

2.7 PSPP03對(duì)HepG2細(xì)胞抗氧化酶活力及非酶抗氧化物質(zhì)的影響

對(duì)不同質(zhì)量濃度PSPP03的DPPH自由基清除率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3A所示。DPPH自由基清除率隨著PSPP03質(zhì)量濃度增加而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到了（94.05±18.12）%，PSPP03質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率為（55.62±8.03）%，半抑制質(zhì)量濃度為22.19 μg/mL。因此后續(xù)細(xì)胞氧化損傷測(cè)試選擇用PSPP03的25 μg/mL和100 μg/mL兩個(gè)質(zhì)量濃度。

圖3B為不同處理組（CK、HO組、HO+25 μg/mL PSPP03和HO+100 μg/mL PSPP03）HepG2細(xì)胞的存活率?？梢钥闯?，PSPP03可以極顯著提高細(xì)胞的HO耐受性，提高細(xì)胞存活率。當(dāng)使用25 μg/mL PSPP03孵育細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率為（68.73±8.14）%，而HO處理組細(xì)胞存活率僅為（27.84±6.97）%。當(dāng)PSPP03質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率為（94.17±4.50）%，與CK組并無顯著差異。結(jié)果表明，PSPP03可以有效提高細(xì)胞在HO氧化作用下的細(xì)胞存活率，提示PSPP03具有良好的細(xì)胞抗氧化活性。

細(xì)胞內(nèi)ROS、GSH和MDA水平反映了細(xì)胞內(nèi)氧化程度，SOD、GSH-Px等酶活力反映細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力。圖3C～F為PSPP03對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力及非酶抗氧化物質(zhì)（如GSH等）含量的影響。

從圖3C可以看出，HO處理后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平激增至CK組的4 倍（＜0.01）。當(dāng)加入PSPP03進(jìn)行細(xì)胞孵育后，細(xì)胞內(nèi)的ROS含量極顯著低于HO處理組，且與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，當(dāng)質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)，ROS相對(duì)水平是HO處理組的39.11%（＜0.01），質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，ROS相對(duì)水平是HO處理組的24.59%（＜0.01），接近CK組，說明PSPP03可以降低或者清除因HO引起的細(xì)胞內(nèi)ROS積累。

圖3D為PSPP03對(duì)細(xì)胞內(nèi)CAT和SOD相對(duì)活力的影響，HO處理后，SOD和CAT的活性被抑制，相對(duì)活力僅分別為CK組的35.42%和38.89%（＜0.01）。與HO處理組相比，當(dāng)加入PSPP03后，質(zhì)量濃度為25 μg/mL和100 μg/mL時(shí)CAT相對(duì)活力分別增加了1.28 倍和1.71 倍（＜0.01），SOD活力分別增加了1.65 倍和2.00 倍（＜0.01）。CAT在細(xì)胞內(nèi)的主要作用是通過分解HO減輕細(xì)胞氧化損傷。SOD在人體內(nèi)起氧化平衡作用，主要是通過清除細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子自由基來保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。

圖3E為PSPP03對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSH-Px相對(duì)活力和GSH相對(duì)含量的影響，經(jīng)HO處理后，細(xì)胞內(nèi)GSH-Px相對(duì)活力極顯著下降（＜0.01），活力下降至CK組的16.44%，GSH含量也下降到CK組的30.76%。加入PSPP03后，GSH-Px相對(duì)活力極顯著提高（＜0.01），質(zhì)量濃度為25 μg/mL和100 μg/mL時(shí)分別提高了3 倍和7 倍。表明PSPP03可以通過提高細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活性催化細(xì)胞內(nèi)過氧化物分解，減輕細(xì)胞所受過氧化物的損傷。GSH是細(xì)胞中重要的非酶類抗氧化物質(zhì)之一，其主要作用是維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定和抗氧化。本研究中，GSH相對(duì)含量在PSPP03作用后較HO處理組有所增加。GSH在細(xì)胞內(nèi)主要通過淬滅自由基和清除過氧化物來減輕細(xì)胞氧化程度，其含量反映細(xì)胞氧化程度。GSH轉(zhuǎn)化過氧化物過程需要GSH-Px的催化，本研究中HO處理會(huì)降低GSH-Px的活性，因此會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)GSH無法轉(zhuǎn)變?yōu)镚SSG，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)過氧化物積累。加入PSPP03后，一方面提高了GSH-Px活力，促進(jìn)了GSH的催化形成；另一方面，PSPP03可能通過觸發(fā)GSH合成代謝通路，從而促進(jìn)GSH的轉(zhuǎn)化或生成。

MDA是細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)分解的最終產(chǎn)物，MDA的積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝受阻，造成細(xì)胞功能障礙，甚至死亡。GSSG是GSH的氧化產(chǎn)物，GSSG與MDA的含量都能夠反映細(xì)胞的氧化損傷程度。PSPP03對(duì)細(xì)胞內(nèi)MDA相對(duì)含量的影響如圖3F所示，HO作用后，細(xì)胞內(nèi)MDA相對(duì)含量是CK組的2.32 倍（＜0.01）；當(dāng)PSPP03作用后，MDA含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)，且下降程度與PSPP03質(zhì)量濃度成正比，25 μg/mL和100 μg/mL時(shí)，MDA相對(duì)含量分別下降到HO處理組的54.67%和41.06%（＜0.01）。GSSG相對(duì)含量變化趨勢(shì)與MDA相似，HO處理會(huì)促使細(xì)胞內(nèi)GSSG含量激增，上升到CK組的6.21 倍（＜0.01）。當(dāng)PSPP03處理后，GSSG相對(duì)含量在25 μg/mL和100 μg/mL PSPP03作用下分別下降到HO處理組的32.64%和20.00%（＜0.01）。結(jié)果提示，PSPP03可以有效減少HO作用下細(xì)胞內(nèi)MDA和GSSG的積累，降低細(xì)胞的氧化損傷。

對(duì)去除花青素后的多糖（PSPP03-E）進(jìn)行抗氧化活性分析，結(jié)果如圖4所示，去除花青素后，PSPP03-E抗氧化活性較未處理PSPP03下降了9.48%（＜0.05），活性下降幅度較小。對(duì)洗脫掉的花青素（PSPP03-P）進(jìn)行DPPH自由基清除活性測(cè)定，結(jié)果表明，PSPP03-P活性與未處理PSPP03相比DPPH自由基清除率下降了26.50%（＜0.01）。通過比較可知，PSPP03的抗氧化活性主要來源于多糖部分，結(jié)合的花青素對(duì)抗氧化活性影響相對(duì)較小。

研究表明，多糖的結(jié)構(gòu)與抗氧化活性有直接關(guān)系。吡喃型結(jié)構(gòu)一般被認(rèn)為是多糖抗氧化的重要結(jié)構(gòu)因素，根據(jù)表1質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)比數(shù)據(jù)庫可知本研究中獲得多糖中Man、Rha、Glc構(gòu)型均為吡喃型。同時(shí)PSPP03中存在一定量的花青素（表2），研究表明花青素具有較強(qiáng)的抗氧化性。本研究中，洗脫后的花青素抗氧化活性仍超過60%，說明花青素的存在對(duì)PSPP03抗氧化性也有一定的貢獻(xiàn)。

多糖可以通過清除DPPH自由基和ROS以及提高抗氧化酶活性達(dá)到抗氧化的目的。如Fang Zhiyu等發(fā)現(xiàn)南瓜多糖可以通過清除ROS和提高CAT活性達(dá)到抗氧化的目的。此外，多糖還可以降低細(xì)胞非酶系氧化物質(zhì)，如MDA、GSSG等水平，從而減輕氧化損傷程度。如朱慧民等發(fā)現(xiàn)紅豆沙多糖能夠通過降低MDA含量從而減輕心肌缺血-再灌注損傷小鼠模型中心肌細(xì)胞的氧化損傷。本研究中，從紫甘薯中分離獲得的多糖PSPP03可以有效地提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系活性，同時(shí)能夠影響非酶系抗氧化物質(zhì)的水平，減輕HO對(duì)細(xì)胞的損傷。

圖3 基于細(xì)胞氧化損傷模型的PSPP03抗氧化活性Fig. 3 Antioxidant activity of PSPP03 in cell model of oxidative damage

圖4 PSPP03洗脫花青素前后的抗氧化能力Fig. 4 Antioxidant capacity of PSPP03 before and after removal of anthocyanins

2.8 PSPP03抗氧化代謝機(jī)理

對(duì)模型細(xì)胞代謝物進(jìn)行提取、分析，經(jīng)過軟件歸一化和轉(zhuǎn)化后，導(dǎo)入軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖5A所示。4 組細(xì)胞代謝物樣本在組內(nèi)聚集，而組間有明顯的距離，表明該模型建立良好，能很好地預(yù)測(cè)結(jié)果。根據(jù)圖5A進(jìn)行分析，PSPP03兩個(gè)給藥組和HO處理組對(duì)主成分1影響顯著，且從距離判斷，給藥組對(duì)主成分1的影響要強(qiáng)于HO處理組。

圖5 基于代謝組分析PSPP03對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷細(xì)胞代謝譜的變化Fig. 5 Metabolomics analysis of changes in metabolic profile of cells induced by PSPP03 and H2O2

根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，對(duì)4 組樣品中的代謝物進(jìn)行鑒定，結(jié)果如表3所示，根據(jù)顯著性共鑒定出23 個(gè)具有顯著性差異（＜0.05且VIP＞1.5）的差異代謝物，其中17 個(gè)差異代謝物上調(diào)，6 個(gè)差異代謝物下調(diào)。根據(jù)鑒定的化合物種類，PSPP03處理引起的細(xì)胞內(nèi)差異代謝物質(zhì)主要分為2 類：一類為碳水化合物；另一類為氨基酸。利用MetaboAnalyst軟件進(jìn)行代謝通路富集分析，發(fā)現(xiàn)PSPP03主要可以影響細(xì)胞的糖代謝（三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝和糖異生）和氨基酸代謝途徑。圖5B為PSPP03作用下氧化損傷細(xì)胞內(nèi)23 種差異代謝物的聚類熱圖，可以明顯看出高質(zhì)量濃度PSPP03給藥組可以顯著提高部分代謝物的相對(duì)含量，如檸檬酸和絲氨酸。檸檬酸是三羧酸循環(huán)中重要的中間產(chǎn)物，通過代謝通路的影響分析，三羧酸循環(huán)在PSPP03給藥后受到顯著影響（圖5C、D）。三羧酸循環(huán)可以影響氨基酸代謝，如精氨酸合成以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等。此外，PSPP03還對(duì)絲氨酸的合成與代謝起到促進(jìn)作用，絲氨酸在細(xì)胞內(nèi)可以通過谷氨酸半胱氨酸連接酶的作用轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽，對(duì)抗氧化具有重要的作用。同時(shí)，差異代謝物中，還存在3 個(gè)嘌呤代謝相關(guān)的化合物——肌苷一磷酸、鳥嘌呤核苷5’-磷酸和腺苷。這3 種代謝物與細(xì)胞內(nèi)ATP能量代謝具有一定的關(guān)聯(lián)，提示PSPP03對(duì)細(xì)胞中的三羧酸循環(huán)也可能具有一定的影響。

表3 基于LC-MS鑒定PSPP03給藥組和H2O2處理組差異代謝物Table 3 Identified differential metabolites between PSPP03- and H2O2-treated cells

為驗(yàn)證代謝組結(jié)果，挑取6 種差異代謝物利用LC-MS/MS進(jìn)行精確定量，結(jié)果如表4所示。經(jīng)過PSPP03給藥后，25 μg/mL給藥組中各指標(biāo)丙酮酸、檸檬酸、絲氨酸和脯氨酸物質(zhì)的量分別是HO處理組的1.38、1.33、2.03、1.67 倍，100 μg/mL給藥組中各指標(biāo)物質(zhì)的量分別是HO處理組的1.49、1.39、3.55、1.84 倍。而腺苷和GSSG在25 μg/mL PSPP03給藥條件下分別下降到HO處理組的58.45%和49.92%，100 μg/mL PSPP03條件下分別下降到HO處理組的22.48%和21.14%。

表4 基于LC-MS/MS對(duì)部分差異代謝物進(jìn)行定量分析Table 4 Quantitative analysis of differential metabolites by LC-MS/MS mmol

3 結(jié) 論

本研究從紫甘薯中分離獲得4 個(gè)純多糖，DPPH自由基清除能力分析結(jié)果表明PSPP03具有顯著的抗氧化潛力。

利用HPLC技術(shù)對(duì)PSPP03的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析，其主要由-Ara、-Man、-Rha、-GlcA和-Glc組成，物質(zhì)的量比為16.2∶25.3∶7.1∶8.6∶10.8。甲基化分析結(jié)果表明其主鏈連接主要構(gòu)型為→4)--Ara-(→1、→3)--Man-(1→、→3,4)--Man-(1→、→3,6)--Man-(1→、→3)--Glc-(1→和→4)--Rha-(1→，而側(cè)鏈的連接形式可能主要為-Glc-(1→以及→4)--Ara-(→1和→3)--Glc-(1→。PSPP03中含有一定量的花青素，主要成分為芍藥素-3-槐糖苷-5-葡萄糖苷和矢車菊素-3-槐糖苷-5-葡萄糖苷，其可能主要以氫鍵形式結(jié)合。通過分析比較抗氧化性可知，PSPP03的抗氧化活性主要來源于多糖部分。

利用HO誘導(dǎo)建立氧化損傷細(xì)胞模型，探究了PSPP03細(xì)胞抗氧化能力。結(jié)果表明PSPP03可以顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，減輕氧化損傷程度；同時(shí)顯著提高SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活力和GSH水平；顯著降低GSSG和MDA等有害物質(zhì)含量。

代謝組學(xué)分析結(jié)果表明，PSPP03細(xì)胞內(nèi)抗氧化代謝機(jī)制有可能是通過促進(jìn)相關(guān)氨基酸代謝和三羧酸循環(huán)從而減輕細(xì)胞的氧化損傷。