乳酸菌產(chǎn)苯乳酸對指狀青霉的抑菌活性及作用機(jī)理

郭宇逍，洪 陽，鄧麗莉,2，曾凱芳,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

柑橘是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值。柑橘果實在采摘、包裝、貯存和運輸?shù)恼麄€過程中都可能會受微生物侵染而發(fā)生腐爛。其中，由指狀青霉（）引起的綠霉病是柑橘采后主要病害之一，在干旱地區(qū)和亞熱帶氣候區(qū)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，約占柑橘采后損失總量的90%。目前已有的防控方法中，多菌靈和咪唑類等化學(xué)殺菌劑使用最廣泛也最有效，但化學(xué)殺菌劑會引起環(huán)境污染、損害人體健康、使病原菌產(chǎn)生抗性等一系類問題，因此，亟待尋求一種綠色安全無污染的處理方式來減少或替代化學(xué)殺菌劑的使用。

乳酸菌在食品體系中作為生物保護(hù)菌所具有的抗真菌特性能夠有效防治草莓、蘋果、圣女果等果蔬采后真菌病害，其重要機(jī)制之一是能產(chǎn)生有機(jī)酸，主要包括乳酸、乙酸、苯乳酸（phenyllactic acid，PLA），此外還包括羥基苯乳酸和吲哚-3-乳酸等。有機(jī)酸分子在較低的pH值環(huán)境下具有抑菌活性，且具有親脂性，可穿過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞發(fā)生解離并釋放出質(zhì)子和陰離子，從而破壞膜的質(zhì)子動力，抑制細(xì)胞的正常代謝活動，導(dǎo)致ATP產(chǎn)量下降。有機(jī)酸對病原菌的抑制作用還可能包括對酶活性的抑制，以及有機(jī)酸的非解離組分對病原菌細(xì)胞膜的破壞。

PLA作為乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸之一，可通過乳酸菌高效發(fā)酵的方式低成本大量獲得，且具有廣譜抑菌性，不僅能抑制腸道沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種細(xì)菌生長，對青霉、黃曲霉、黑曲霉等真菌同樣具有良好的抑制效果。前人研究表明，PLA主要作用于細(xì)胞膜。Liu Fang等分析發(fā)現(xiàn)，PLA處理改變了細(xì)胞形態(tài)，且破壞了浮游細(xì)胞細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不同程度的ATP泄漏并嚴(yán)重受損。類似的，Ning Yawei等通過流式細(xì)胞儀和透射電子顯微鏡分析，證明PLA處理能破壞蠟樣芽孢桿菌細(xì)胞膜的完整性和形態(tài)。但也有研究認(rèn)為，PLA還能夠作用于細(xì)胞壁、DNA。PLA對不同病原菌的抑制效果及抑制機(jī)理不同，且目前鮮見深入研究其抗病機(jī)制的報道。

因此，本實驗選擇本課題組前期在泡菜中分離篩選得到的兩株乳酸菌CKXP13和CWXP24作為實驗菌株，這兩株菌對柑橘綠霉病都有良好的控制效果。但有關(guān)乳酸菌CKXP13和CWXP24所產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)研究尚少，也鮮有研究其抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量及抑菌物質(zhì)作用機(jī)理的相關(guān)報道。綜上所述，本實驗旨在探究乳酸菌CKXP13和CWXP24的產(chǎn)酸能力和PLA的產(chǎn)量，并通過研究PLA對離體指狀青霉孢子的影響初步揭示PLA的抑菌機(jī)理，同時驗證PLA對柑橘綠霉病的防治效果，以期為控制柑橘采后綠霉病和抑制柑橘采后病原菌提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豐臍橙（L. Osbeck）摘自重慶市北碚區(qū)。挑選無機(jī)械傷、無病害、成熟度和大小基本一致的果實，預(yù)冷后放至4 ℃冷庫中備用。

指狀青霉（）為本實驗室保藏，于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)7 d，得到孢子懸浮液后用無菌蒸餾水調(diào)至所需濃度。CKXP13和CWXP24為本實驗室前期實驗分離保藏。色譜純PLA上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10酸度計 德國賽多利斯股份有限公司；JSM-6510LV掃描電子顯微鏡 日本JEOL公司；SYNERGYH1MG全自動酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司；LC-20A高效液相色譜 日本島津公司；DDS-307A電導(dǎo)率儀 上海INESA公司。

1.3 方法

1.3.1活化、發(fā)酵及產(chǎn)酸能力的測定

乳酸菌活化/乳酸菌懸浮液制備：從-40 ℃冰箱中取出已篩選鑒定的兩株乳酸菌CKXP13和CWXP24，按1%（以體系體積計，下同）的接種量加入20 mL MRS肉湯中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，活化2 次后待用。

乳酸菌無菌發(fā)酵液制備：以1%的接種量接種乳酸菌培養(yǎng)液于MRS肉湯中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。每株菌的培養(yǎng)液于4 ℃條件下5 000 r/min離心15 min，上清液用0.22 μm孔徑水系濾頭過濾除菌，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

產(chǎn)酸能力的測定參照Ma Jiahong等的方法并作一定的修改，同時測定生長曲線。取活化后的兩株乳酸菌培養(yǎng)液各1 mL加入至100 mL MRS肉湯中，37 ℃靜置培養(yǎng)72 h，每6 h測定pH值與OD各一次，重復(fù)3 次。

1.3.2 高效液相色譜法測定無菌發(fā)酵液中PLA質(zhì)量濃度

液相色譜條件：選用LC-20A高效液相色譜儀、液相色譜C柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），Prominence SPD-M20A二極管陣列檢測器。流動相A：體積分?jǐn)?shù)0.05%三氟乙酸-水溶液，流動相B：體積分?jǐn)?shù)0.05%三氟乙酸-甲醇溶液。流速1 mL/min、柱溫30 ℃、檢測波長210 nm、進(jìn)樣量10 μL。

梯度洗脫程序：0～20 min由10% B線性變化至100% B，20～23 min保持100% B，23～25 min由100% B線性變化至10% B，25～40 min保持10% B。

1.3.3孢子存活率的測定

在無菌蒸餾水中加入PLA，使其終質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、10.0 mg/mL，再加入不同濃度的孢子懸浮液，使其終濃度為1×10個/mL，25 ℃環(huán)境下靜置16 h，取50 μL混合液于PDA培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)2 d，記錄培養(yǎng)基上的菌落總數(shù)。以無菌蒸餾水替代PLA作為對照，重復(fù)3 次。按式（1）計算孢子存活率。

1.3.4菌落直徑的測定

在PDA培養(yǎng)基中加入適量PLA，使其終質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、10.0 mg/mL，再接種5 μL孢子懸浮液（1×10個/mL），25 ℃環(huán)境下培養(yǎng)8 d，每天觀察并測量菌落直徑。以無菌蒸餾水替代PLA為對照，重復(fù)3 次。

1.3.5菌絲表面形態(tài)的觀察

菌絲表面形態(tài)的觀察參照Tao Nengguo等的方法并稍作調(diào)整，將孢子懸浮液（1×10個/mL）接種于PDB液體培養(yǎng)基中，25 ℃、160 r/min培養(yǎng)48 h，5 000 r/min離心15 min，無菌蒸餾水洗3 次，收集菌絲體，用不同質(zhì)量濃度的PLA溶液（2.5、5.0、10.0 mg/mL）處理48 h，以無菌蒸餾水代替PLA作為對照。處理結(jié)束后，收集菌絲體，置于體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液（含0.1 mol/L磷酸緩沖液，pH 6.8）中，存放于4 ℃冰箱中過夜固定。固定結(jié)束后除去固定液，用磷酸緩沖液（0.1 mol/L、pH 6.8）清洗3 次，再用乙醇梯度脫水，分別用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、90%、95%乙醇溶液脫水處理一次，每次10 min；用無水乙醇脫水處理3 次，每次10 min。脫水處理之后，依次加入體積分?jǐn)?shù)50%、70%、90%、95%叔丁醇溶液進(jìn)行置換處理一次，每次10 min；用無水叔丁醇置換處理兩次，每次10 min。最后，將樣品放入恒溫干燥箱65 ℃過夜干燥，挑取樣品組織塊粘到金屬臺上，進(jìn)行噴金、鍍膜后在掃描電子顯微鏡（放大倍數(shù)5 000 倍、80 kV）下觀察并拍照。

1.3.6菌絲胞外電導(dǎo)率的測定

菌絲胞外電導(dǎo)率的測定參照Wang Wenjun等的方法并稍作調(diào)整，將10 mL含有孢子懸浮液（1×10個/mL）的PDB培養(yǎng)基置于25 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后5 000 r/min離心15 min收集菌絲體，無菌蒸餾水洗3 次，重懸于無菌蒸餾水中。取適量PLA溶液加入菌絲懸浮液中，使懸浮液中PLA終質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、10.0 mg/mL。在處理0、3、6、9、12、24、48 h時測定胞外電導(dǎo)率，每組處理重復(fù)3 次，以無菌蒸餾水替代PLA作為對照。

1.3.7 柑橘果實綠霉病干預(yù)實驗

柑橘果實綠霉病干預(yù)實驗參照Ma Jiahong等的方法并稍作調(diào)整，柑橘果實先用體積分?jǐn)?shù)2%的次氯酸鈉溶液浸泡2 min，用清水沖洗后于室溫下自然晾干。所有果實隨機(jī)分為3 組，打孔接種前用乙醇擦拭消毒。用無菌打孔器在果實赤道部位對稱打兩個孔（直徑3 mm、深3 mm），每個孔接種10 μL孢子懸浮液（1×10個/mL）。待果實吸收孢子懸浮液后，每個孔接種20 μL不同質(zhì)量濃度PLA溶液（10、20 mg/mL）并置于室溫條件下。無菌蒸餾水替代PLA作為對照，每組處理10 個果實，每個處理重復(fù)3 次。待處理液充分吸收后，將果實單果包裝，貯藏于25 ℃、相對濕度95%的環(huán)境中。每天統(tǒng)計果實發(fā)病情況，發(fā)病率和病斑直徑分別按式（2）和式（3）計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

運用Excel 2016軟件統(tǒng)計分析所有得到的數(shù)據(jù)，應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件、Adobe Photoshop CS6軟件繪制圖表；運用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用Duncan’s多重比較進(jìn)行差異顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 L. plantarum產(chǎn)酸能力分析結(jié)果

如圖1所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，兩株乳酸菌數(shù)量均逐漸增加，有機(jī)酸產(chǎn)物不斷積累，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值不斷降低，并在72 h培養(yǎng)結(jié)束時均穩(wěn)定在4左右。生長曲線結(jié)果表明，兩株在培養(yǎng)6 h后均進(jìn)入生長對數(shù)期，相應(yīng)地，培養(yǎng)基pH值急劇下降，CKXP13在培養(yǎng)36 h后達(dá)到穩(wěn)定期，CWXP24在培養(yǎng)42 h后達(dá)到穩(wěn)定期，菌株達(dá)到穩(wěn)定期后，pH值變化逐漸平緩，并最終趨于穩(wěn)定。兩株均具備較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，且有機(jī)酸產(chǎn)量與兩株的生長趨勢一致。

圖1 兩株乳酸菌發(fā)酵液pH值變化及生長曲線Fig. 1 pH change of cultured broth and growth curves of two strains of L. plantarum

2.2 L. plantarum無菌發(fā)酵液中PLA質(zhì)量濃度

如表1所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜結(jié)果得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為＝25 720+37 660，＝0.998 1，再計算出無菌發(fā)酵液中的PLA質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，兩株的無菌發(fā)酵液中均有PLA產(chǎn)生，且CWXP24顯示出較高的PLA合成能力，產(chǎn)量可達(dá)91.9 mg/L，CKXP13的PLA合成能力相對較弱，為42.4 mg/L。

表1 兩株L. plantarum無菌發(fā)酵液中PLA的產(chǎn)量Table 1 Concentration of PLA in cell-free culture supernatants of two strains of L. plantarum

2.3 PLA對P. digitatum的體外抑菌機(jī)理

2.3.1 PLA對孢子存活率的影響

如圖2所示，PLA在2.5～10.0 mg/mL范圍內(nèi)均表現(xiàn)出對孢子較強(qiáng)的致死能力，且隨著質(zhì)量濃度的增大，對的致死能力也不斷增強(qiáng)。2.5 mg/mL及5.0 mg/mL PLA處理組的孢子存活率分別為對照組的43.6%和18.9%，當(dāng)PLA質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL時，平板上已無孢子萌發(fā)，孢子存活率幾乎降低至0。

圖2 PLA對P. digitatum孢子存活率的影響Fig. 2 Effects of PLA on spore viability of P. digitatum in vitro

2.3.2 PLA對菌絲生長的影響

如圖3所示，在菌絲的整個生長過程中，不同質(zhì)量濃度PLA均表現(xiàn)出對菌落生長較強(qiáng)的抑制能力，且隨著質(zhì)量濃度的增大，其對菌落生長的抑制能力也不斷增強(qiáng)。當(dāng)PLA質(zhì)量濃度達(dá)到10.0 mg/mL時，菌絲生長完全被抑制。2.5 mg/mL及5.0 mg/mL處理組的菌落直徑在培養(yǎng)8 d后分別為對照組的66.2%和28.5%。

圖3 PLA對P. digitatum菌絲生長的影響Fig. 3 Effect of PLA on mycelial growth of P. digitatum in vitro

2.3.3 PLA對菌絲形態(tài)的影響

如圖4A所示，對照組的菌絲分布均勻，生長正常，菌絲表面平整光滑。2.5 mg/mL PLA處理組菌絲結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，菌絲整體分布不均勻，表面變得粗糙，出現(xiàn)褶皺（圖4B）。高質(zhì)量濃度的PLA處理組形態(tài)變化更加明顯，菌絲整體分布更加不規(guī)則，并相互纏繞、扭曲，表面褶皺更加明顯，出現(xiàn)塌陷和樹瘤狀凸起的情況（圖4C、D）。由此推測PLA可對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)造成破壞，從而使內(nèi)容物泄漏。

圖4 不同質(zhì)量濃度PLA處理對P. digitatum菌絲形態(tài)的影響（×5 000）Fig. 4 Effect of PLA on mycelial morphology of P. digitatum (× 5 000)

2.3.4 PLA對菌絲胞外電導(dǎo)率的影響

如圖5所示，隨著處理時間的延長，所有組別的電導(dǎo)率均逐漸升高。10.0 mg/mL PLA處理3 h時，其電導(dǎo)率急劇上升，達(dá)到71.0 μS/cm，明顯高于對照組（27.0 μS/cm）和其他處理組。2.5 mg/mL PLA處理組在前6 h與對照組差異不明顯，5.0、10 mg/ mL PLA處理48 h時，其電導(dǎo)率分別達(dá)到74.3、154.0 μS/cm，均明顯高于對照組（57.3 μS/cm）。電導(dǎo)率分析結(jié)果進(jìn)一步證明PLA處理可破壞菌絲細(xì)胞膜的通透性，細(xì)胞內(nèi)容物向外釋放，導(dǎo)致胞外電導(dǎo)率升高。

圖5 PLA對P. digitatum菌絲胞外電導(dǎo)率的影響Fig. 5 Extracellular conductivity of P. digitatum mycelia treated with PLA

2.4 PLA對柑橘果實綠霉病的控制效果

如圖6所示，10 mg/mL和20 mg/mL PLA處理均可有效控制對柑橘果實的侵染，接種后5 d內(nèi)能夠不同程度地抑制柑橘果實綠霉病的發(fā)生。接種后5 d，20 mg/mL PLA處理顯著抑制了柑橘果實病斑直徑增長，且兩處理組均有效控制了柑橘果實發(fā)病初期的發(fā)病率。相對于對照組，20 mg/mL PLA處理組接種后第3天病斑直徑與發(fā)病率分別顯著降低了90.4%與78.0%；接種后第5天病斑直徑顯著降低了33.3%。10 mg/mL PLA處理組接種后第3天病斑直徑與發(fā)病率分別顯著降低了57.8%與49.9%；接種后第5天病斑直徑降低了15.2%。

圖6 PLA對柑橘采后綠霉病病斑直徑和發(fā)病率的影響Fig. 6 Effect of PLA on lesion diameter and disease incidence of citrus fruit infected by P. digitatum

3 討 論

PLA作為具有抑菌活性的天然物質(zhì)，可利用乳酸菌以高效發(fā)酵的方式進(jìn)行低成本的自然生產(chǎn)，在果蔬采后貯藏領(lǐng)域顯示出極大的應(yīng)用潛力。本研究證明了CKXP13和CWXP24均能產(chǎn)PLA，且PLA能有效抑制指狀青霉生長，控制柑橘果實綠霉病。

PLA主要由化學(xué)合成法和生物合成法兩種方法制備。相比于化學(xué)合成法，生物合成法成本低、操作簡單、條件溫和、對環(huán)境友好，因而受到廣泛關(guān)注。其中乳酸菌中已有多個菌屬被發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)PLA，但大多乳酸菌的PLA合成量較低。本實驗中兩株均能分泌產(chǎn)生PLA，其中CWXP24在沒有任何優(yōu)化培養(yǎng)的條件下產(chǎn)量高達(dá)91.9 mg/L，但CKXP13產(chǎn)量較低，僅為42.4 mg/L，以往研究也表明，同一菌種不同菌株間的PLA產(chǎn)量可能存在顯著差異。

本實驗發(fā)現(xiàn)PLA質(zhì)量濃度對孢子的致死效果和對菌絲生長的抑制效果呈正相關(guān)，類似地，Guimar?es等發(fā)現(xiàn)，PLA質(zhì)量濃度在0.1～8.0 mg/mL范圍內(nèi)，的菌落直徑隨PLA質(zhì)量濃度升高而減小，當(dāng)PLA質(zhì)量濃度升至8 mg/mL時，菌落直徑減小為對照的50%。本實驗還對PLA可能的抑菌機(jī)理進(jìn)行了初步研究，證明PLA處理對菌絲表面結(jié)構(gòu)造成了嚴(yán)重破壞，使其發(fā)生明顯改變，這一結(jié)果與前人研究PLA處理對李斯特菌的影響所得結(jié)論相似，未使用PLA處理的李斯特菌細(xì)胞分布均勻、表面平滑，0.625 mg/mL的PLA處理后細(xì)胞外表面呈不規(guī)則褶皺，PLA質(zhì)量濃度增至1.25 mg/mL時細(xì)胞膜上出現(xiàn)孔洞或局部破裂，部分胞內(nèi)物質(zhì)從細(xì)胞膜滲出，形成聚集和黏附，當(dāng)PLA處理質(zhì)量濃度持續(xù)升高至2.5 mg/mL，細(xì)胞損傷更為嚴(yán)重，大部分細(xì)胞表面坍塌甚至破碎成細(xì)胞碎片，進(jìn)一步說明菌絲的這些變化可能是由于細(xì)胞通透性的增加，進(jìn)而導(dǎo)致小分子物質(zhì)和離子的泄漏、細(xì)胞代謝下降，最終抑制病原菌的生長。本實驗也發(fā)現(xiàn)PLA處理質(zhì)量濃度越高，菌絲的胞外電導(dǎo)率增加幅度越明顯，證明PLA能夠增加菌絲細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)容物發(fā)生泄漏，這可能是PLA抑菌機(jī)理的重要組成部分。細(xì)胞膜作為病原菌細(xì)胞能量運輸及物質(zhì)傳遞的屏障，既能夠保證細(xì)胞本身代謝穩(wěn)定，又能起到調(diào)控物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)外進(jìn)出與交換的作用。PLA本身為兩親性小分子，且?guī)в姓姾?，PLA的化學(xué)結(jié)構(gòu)決定了其更容易吸附在細(xì)胞膜表面，與細(xì)胞膜發(fā)生作用，所以細(xì)胞膜一般作為PLA與病原菌作用的第一個靶點。但袁景環(huán)等發(fā)現(xiàn)，PLA處理的金黃色葡萄球菌和熒光假單胞菌培養(yǎng)液OD值和菌落總數(shù)均下降，說明PLA除了具有殺菌作用，還具有溶菌作用，通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察還發(fā)現(xiàn)PLA處理后的菌體嚴(yán)重變形、固縮或破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，推測PLA對這兩種細(xì)菌的作用位點之一為細(xì)胞壁。這與Dieuleveux等報道的PLA對單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌機(jī)理類似，但也可能存在其他作用靶位，因此未來還需對PLA的抑菌機(jī)制進(jìn)一步研究。此外，本實驗對PLA控制柑橘果實采后綠霉病的效果進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)20 mg/mL乳酸處理可顯著減小柑橘果實的病斑直徑，且有效控制了柑橘果實的初期發(fā)病率，這一結(jié)果表明PLA對柑橘果實采后綠霉病具有一定的抑制作用。

綜上所述，本實驗所選用兩株乳酸菌均能產(chǎn)PLA，可為產(chǎn)PLA的乳酸菌的開發(fā)和利用提供理論參考，且PLA作為一種新型綠色保鮮劑，應(yīng)用于柑橘果實采后保鮮具有一定的經(jīng)濟(jì)價值。