云南雞血藤水提物和醇提物的體外抗菌活性研究6

王播勇，馬運(yùn)敏，李漢偉，劉久東，普元倩，自加吉，楊 飛，熊 偉

（1. 云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南，大理 671000；2. 大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南，大理 671000；3. 大理白族自治州第一人民醫(yī)院，云南，大理 671000；4. 江蘇省儀征市林業(yè)生產(chǎn)指導(dǎo)站中心，江蘇，儀征 211400；5. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，云南，昆明 650100）

雞血藤，又名大血藤、血藤、血風(fēng)藤、三葉雞血藤等，為《中國藥典》收載的常用中藥材，來源于豆科植物密花豆Spɑtholobus suberectusDunn 的干燥藤莖[1]。雞血藤入藥時間較晩，直至清代方見記載。始載于清代趙學(xué)敏《本草綱目拾遺》，謂之：一莖長數(shù)十里，土人得之，以刀砍斷，則汁出如血。雞血藤以有3 ～8 個紅褐色偏心形半圓環(huán)、滲出樹脂物多者和半環(huán)紋多者為佳[2]。其味甘、苦，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有活血補(bǔ)血、舒筋活絡(luò)、調(diào)經(jīng)止痛的功效，常用于治療血虛萎黃、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、經(jīng)閉等癥[3]，主要分布于我國云南、廣西、廣東和福建等地。于每年秋冬兩季采收，因采收時藤條流出的汁液鮮紅如雞血，故名雞血藤[4]。據(jù)統(tǒng)計，以雞血藤為原料生產(chǎn)的中成藥如雞血藤顆粒、花紅片等達(dá)50 余種，以雞血藤為原料組成的中藥復(fù)方制劑獲得的專利多達(dá)150 余項(xiàng)[5]?，F(xiàn)市場上的雞血藤藥材多來源于野生采摘。隨著近些年用藥需求量的增大，加之利益鏈的驅(qū)使，野生資源也快瀕臨枯竭?，F(xiàn)我國廣西、廣東省份的野生資源已瀕臨枯竭，僅云南省尚有一定野生資源，但蘊(yùn)藏量已很低[6]。

我們研究組根據(jù)《中國植物志》官方網(wǎng)站（http://www.iplant.cn/）2020 年下半年開始接受原崖豆藤屬（Millettiɑ）部分物種修訂為雞血藤屬（Cɑlleryɑ Endl），正式將雞血藤屬與崖豆藤屬分為兩屬[7]?，F(xiàn)代研究表明，雞血藤含有黃酮類、三萜類、苯丙素、苷類、酚類、甾醇類、蒽醌類等成分，具有改善造血系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用，具有廣闊的開發(fā)前景[8-9]。近年來，由于抗生素的使用不合理及超劑量，導(dǎo)致臨床耐藥菌株迅速增加，抗生素的抗菌活性下降，不僅增加了養(yǎng)殖成本，而且導(dǎo)致動物產(chǎn)品中抗生素殘留，給人類的健康帶來嚴(yán)重的威脅。目前，減少耐藥菌株的出現(xiàn)和研究合成新的抗菌藥物已成為一個世界性難題，而中草藥以無毒副作用、無殘留及細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)[10]。研究表明，雞血藤對臨床常見的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌等多種致病微生物均有不同程度的抑制作用，但對雞血藤發(fā)揮抗菌作用的藥效成分及作用機(jī)制尚缺乏整體認(rèn)識[11]。云南雞血藤是一種具有潛在抗菌活性的資源植物，本研究采用滅菌的去離子水和75%乙醇對云南雞血藤中有效成分進(jìn)行了提取，并對不同提取物的體外抗菌活性進(jìn)行了試驗(yàn)，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

正品云南雞血藤于2021 年8月購自云南省大理白族自治州大理市一心堂大藥房。經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室張德全教授和張海珠教授鑒定為豆科植物密花豆（Spɑtholobus suberectusDunn）的干燥藤莖。

1.2 試劑與儀器

TSA、TSB、改良馬丁培養(yǎng)基（Oxioid 公司），胎牛血清、LB 液體、固體培養(yǎng)基（環(huán)凱生物有限公司），75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇和二甲基亞砜（DMSO）均為分析純試劑（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。實(shí)驗(yàn)用水為滅菌的去離子水。ED204型電子天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司），SB25-12DTDN 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），RE-225AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），SHB-III 型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），SW-CJ-2FD 超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），LDZX240B I立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），HZQ-F160 型全溫振蕩培養(yǎng)箱（上海朗賦實(shí)業(yè)有限公司），F(xiàn)W100 型高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司），多功能酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技中國有限公司），微量移液器（德國Eppendorf 公司）。

1.3 供試菌種及培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)所用表皮葡萄球菌（Stɑphylococcus epidermidis）、金黃色葡萄球菌（Stɑphylococcus ɑureus）、枯草芽孢桿菌（Bɑcillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichiɑ coli）、綠膿桿菌（Pseudomonɑs ɑeruginosɑ）、變形桿菌（Proteus vulgɑris）、 白假絲酵母菌（Cɑndidɑ ɑlbicɑns）和黑曲霉（Aspergillus roger）均由大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室提供。金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，大腸桿菌、綠膿桿菌和變形桿菌為革蘭氏陰性菌，白假絲酵母菌和黑曲霉為真菌。除黑曲霉需用改良馬丁培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)5 d外，其余各菌種均于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h[12]。

1.4 方法

1.4.1 雞血藤提取物的制備

取干燥的云南雞血藤20 g，粉碎，過40 目篩，分別用滅菌去離子水及不同濃度的乙醇進(jìn)行索氏提取，溶液在80℃水浴上回流提取，固液比為1:10，回流3 h。將提取物濃縮，低溫真空干燥至粉末，得到雞血藤水提物和不同濃度乙醇的雞血藤提取物，測定其凍干物的質(zhì)量，4℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩４咕钚泽w外實(shí)驗(yàn)時用10%DMSO 溶液使其溶解并用滅菌蒸餾水稀釋至一定體積。

1.4.2 菌懸液的制備

將上述供試菌種用適宜的斜面活化后，用滅菌的去離子水制成含菌數(shù)約為1×105CFU/mL 菌懸液，待用。

1.4.3 體外抗菌活性試驗(yàn)

1.4.3.1 云南雞血藤水提取物及乙醇提取物抑菌直徑的測定

抑菌直徑的測定采用瓊脂擴(kuò)散法[13-14]。用無菌棉簽蘸取1×105CFU/mL 的試驗(yàn)菌懸液，在營養(yǎng)瓊脂平板表面均勻涂抹3 次，然后繞平板邊緣涂抹一周，蓋好平皿，室溫干燥5 min，濾紙片(直徑6.0 mm)平放于無菌平皿內(nèi)，每片滴加不同濃度乙醇提取液及水提取物20 μL，室溫自然晾干，用無菌鑷子取樣片輕輕貼放于平板表面，每個平板貼3 片實(shí)驗(yàn)樣片，1 片10%DMSO 為對照片。各實(shí)驗(yàn)菌株在相應(yīng)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，測量抑菌直徑。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.3.2 云南雞血藤水提取物及乙醇提取物MIC及MBC 的測定

我們實(shí)驗(yàn)中最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC) 及最小殺菌濃度(minimal bactericidal concentration, MBC)的測定采用微量肉湯稀釋法[15-16]。MIC 即藥物與一定濃度的菌液作用后，能夠抑制可見菌生長的最低濃度。MBC 即在MIC 基礎(chǔ)上，從每管吸取10 μL 溶液，點(diǎn)于固體培養(yǎng)基上，繼續(xù)按MIC 培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，以殺滅99.9%細(xì)菌數(shù)量的最低濃度為最小殺菌濃度。采用二倍稀釋法將藥液用無菌生理鹽水稀釋系列濃度（0.064 ～65.8 mg/mL)，在96 孔板上每孔加100 μL不同濃度的藥液和100 μL 菌液，使最終菌液濃度為1×105CFU/mL，以無菌生理鹽水加菌液做為陽性對照。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.4 云南雞血藤提取物熱穩(wěn)定性的測定

將不同稀釋度的云南雞血藤提取物置于20、40、60、80、100℃水浴和121℃濕熱條件下處理10 min 后，分別測定其抑菌活性。

1.4.5 云南雞血藤提取物紫外光穩(wěn)定性的測定

將不同稀釋度的云南雞血藤提取物在紫外燈下處理10、20、30、40、50、60 min 后，分別測定其抑菌活性。

1.4.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用IBM SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩個獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)定義為0.05。

2 結(jié)果

2.1 云南雞血藤各提取物的得率

為選擇一種較好的提取溶劑，本研究分別用55%、75%、95%乙醇和滅菌去離子水對云南雞血藤進(jìn)行提取來做抑菌效果的實(shí)驗(yàn)。20 g 雞血藤生藥經(jīng)不同濃度的抑菌和水提取、濃縮、干燥和測定，得到的雞血藤各提取物凍干物的質(zhì)量和不同提取方法的得率（如表1）。結(jié)果表明，雞血藤活性成分的提取率，乙醇高于水，同時發(fā)現(xiàn)75%的乙醇濃度的提取效果明顯好于55% 和95%乙醇的提取液，因此本文以后均采用75%的乙醇來進(jìn)行提取。

表1 云南雞血藤提取物的質(zhì)量及不同提取方法的得率Table 1 The quality of the extracts of Spɑtholobus suberectus Dunn and the yield of different extraction methods

2.2 云南雞血藤水提物及75%乙醇提取物的抑菌直徑

研究結(jié)果表明，云南雞血藤75%乙醇提取物對同一種細(xì)菌的抑菌直徑比水提物的抑菌直徑更大。10%DMSO無抑菌活性。云南雞血藤水提物和75%乙醇提取物對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢桿菌)比對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、綠膿桿菌和變形桿菌) 都更加敏感，對真菌(白假絲酵母菌和黑曲霉)則不敏感（圖1）。由此可見，云南雞血藤75%乙醇提取物比水提物的抑菌活性更強(qiáng)，抑菌活性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 云南雞血藤提取物的抑菌直徑對比Fig.1 Comparison of inhibition zones of water extracts and ethanol extracts from Spɑtholobus suberectus Dunn

2.3 云南雞血藤水提物及75%乙醇提取物的MIC 和MBC

研究結(jié)果表明，雞血藤乙醇提取物對革蘭氏陽性菌及陰性菌抗菌活性較強(qiáng)，而對真菌在65.8 mg/mL范圍內(nèi)沒有抗菌作用，水提取物對革蘭氏陽性菌的抗菌活性較強(qiáng)，而對革蘭氏陰性菌及真菌在65.8 mg/mL范圍內(nèi)幾乎沒有抗菌作用。結(jié)果還顯示，雞血藤75%乙醇提取物比水提物的MIC及MBC?。ńY(jié)果如表2）。

表2 云南雞血藤水提物及75%乙醇提取物的MIC 和MBC結(jié)果(mg/mL)Table 2 MICs and MBCs of water extracts and ethanol extracts from Spɑtholobus suberectus Dunn(mg/mL)

2.4 熱處理對云南雞血藤提取物抗菌效力的影響

提取物的熱穩(wěn)定性良好，經(jīng)20、40、60、80、100、121℃處理15 min 后，75%乙醇提取物經(jīng)121℃處理后抗金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌效力降低了1 倍，分別由2.06 mg/mL 變?yōu)?.12 mg/mL，由1.03 mg/mL 變?yōu)?.06 mg/mL，其余仍保持其原有的抗菌效力。而水提取物經(jīng)121℃處理后抗表皮葡萄球菌的MIC 由4.12 mg/mL 變?yōu)?.24 mg/mL，其余都保持不變。由此可見，雞血藤乙醇提取物及水提取物對100℃以下溫度不敏感，經(jīng)121℃高溫處理，僅對個別菌種的抗菌活性產(chǎn)生微弱影響。

2.5 云南雞血藤提取物紫外光穩(wěn)定性的測定

將雞血藤水提物和75%乙醇提取物分別在紫外燈下處理10、20、30、40、50、60 min 后測定其抑菌活性。結(jié)果表明，隨紫外處理時間的變化，提取物的抑菌活性保持不變，由此可見，該提取物對紫外光具有極高的穩(wěn)定性。

3 討論

中草藥是我國寶貴的天然資源，歷經(jīng)了幾千年的使用和實(shí)踐檢驗(yàn)，其療效確切，安全可靠。在治療感染性疾病方面，因其成分復(fù)雜、作用靶點(diǎn)多、抗菌譜廣，細(xì)菌較少對其產(chǎn)生耐藥，能延緩甚至逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生[17]。我們應(yīng)當(dāng)以此為契機(jī)，從中藥材中尋找有效、低毒的抗菌藥物，對解決細(xì)菌耐藥性問題有非常大的潛力。雞血藤基原自古以來較為復(fù)雜。根據(jù)考證，雞血藤之名始見于《本草綱目拾遺》“雞血藤”膠項(xiàng)下，結(jié)合《順寧府志》、《順寧雜著》、《順寧藥單》等記錄及產(chǎn)地標(biāo)本研究，認(rèn)為云南鳳慶雞血藤膏基原為木蘭科植物滇南五味子Kɑdsurɑ interior A.C.Smith、異 型 南 五 味 子Kɑdsurɑ heteroclite（Roxb.）Crɑib和 黃 龍 藤Schisɑndrɑ propinquɑ（Wɑll.）Bɑill.vɑr.intermediɑ AC.Smith，祿勸雞血藤膏基原為豆科植物巴豆藤Crɑspedolobium schochii Hɑrms，這幾種莖藤熬膏用，不做藥材使用。而密花豆則是根據(jù)“剖斷流汁，色赤若血”、“砍斷則汁如血”的文獻(xiàn)記載和野外調(diào)查，結(jié)合現(xiàn)代中藥業(yè)老師傅的辨認(rèn)經(jīng)驗(yàn)，將其作為正品雞血藤基原植物，并于1977 年版《中國藥典》開始記載[18]。正品雞血藤結(jié)實(shí)率低，種子未成熟果實(shí)已脫落，種子萌發(fā)率也不高，導(dǎo)致其自然繁殖率很低。雖然目前已經(jīng)通過扦插繁育技術(shù)開展了雞血藤人工種植，也頒布實(shí)施了一些地方標(biāo)準(zhǔn)和發(fā)明專利，如《雞血藤規(guī)范化生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》等[19]，但因其生長周期比較長，雞血藤大面積規(guī)?；斯しN植還沒有形成。

抗生素通常是細(xì)菌感染的主要治療手段，很大程度上降低了世界范圍內(nèi)細(xì)菌感染的死亡率[20]。但在長期應(yīng)用中產(chǎn)生了多種抗生素耐藥性反應(yīng)，從而導(dǎo)致其有效性降低[21]。此外，抗生素治療可能導(dǎo)致毒性、過敏反應(yīng)，甚至長期治療后出現(xiàn)雙重感染[22]，而天然產(chǎn)物是化學(xué)多樣性的主要來源，能夠提供各種有效的、不耐藥的或弱耐藥的抗菌藥物[23]，從而為對抗細(xì)菌感染的研究提供了新的思路。雞血藤化學(xué)成分復(fù)雜，臨床應(yīng)用廣泛。現(xiàn)代藥理研究表明，雞血藤具有影響造血系統(tǒng)、抗血小板聚集、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，抗心肌缺血及腦缺血、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)酪氨酸酶等方面作用[3]。目前，國內(nèi)外有少量關(guān)于雞血藤提取物抗菌和抗病毒活性的研究報道。Park 等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，雞血藤中的黃酮類化合物7-羥基-6-甲氧基二氫黃酮和芒柄花素對變形鏈球菌和金黃色葡萄球菌的分選酶A（Srt A）有抑制作用，IC50值分別為46.1 μM 和41.8 μM，但不影響細(xì)胞活力。Cho 等[25]從雞血藤中分離出20種黃酮類化合物，細(xì)胞聚集活性的抑制實(shí)驗(yàn)同樣表明，7-羥基-6-甲氧基二氫黃酮和芒柄花素這兩種化合物能夠抑制SrtA，具有治療金黃色葡萄球菌感染的潛力。雞血藤水提物在犬腎細(xì)胞MDCK 中對流感病毒A1 具有抑制增殖作用，對流感病毒在雞胚中的增殖也有抑制作用，每日灌注雞血藤水提物還能降低病毒感染小鼠的死亡率、肺指數(shù)，改善肺病理切片壞死和浸潤的癥狀[26]。雞血藤醇提物具有抗甲型流感病毒、乙型肝炎病毒和單純皰疹病毒I 型活性，且抗單純皰疹病毒I 型效果顯著[27-28]。此外，雞血藤乙醇提取物還能抑制HCV 病毒的復(fù)制[29]。另有實(shí)驗(yàn)表明，雞血藤水提液對薩奇病毒B3、B5、埃可病毒Echo 9、Echo 29、脊髓灰質(zhì)炎病毒（Polio virus I,PVI）5 種腸道病毒屬均呈現(xiàn)出不同程度的抑制或者殺傷作用，作用機(jī)制與抑制病毒生物合成及成熟釋放，吸附在細(xì)胞表面或者進(jìn)入細(xì)胞阻止病毒吸附進(jìn)入相關(guān)[30]。

通過雞血藤水提物和醇提物抗菌活性的對比研究，結(jié)果顯示，雞血藤兩種提取物對3 種革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢桿菌)均比對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、綠膿桿菌和變形桿菌)及真菌(白假絲酵母菌和黑曲霉)的抗菌活性強(qiáng)，在65.8 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)對真菌的MIC、MBC 未檢出。在水提物和醇提物的抑菌活性體外研究中，雞血藤乙醇提取物顯示出良好的抗菌活性，尤其對革蘭氏陽性菌更敏感，而75%乙醇提取物比相應(yīng)的水提取物的抗菌活性更強(qiáng)。這說明雞血藤的抑菌活性為一些極性較強(qiáng)的化合物，這與其它研究報道的雞血藤抗菌活性的發(fā)揮的物質(zhì)基礎(chǔ)為黃酮類和多酚類相一致[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，雞血藤75%乙醇提取物比水提取物的抗菌活性強(qiáng)，這是因?yàn)殡u血藤中主要的活性物質(zhì)為多酚類黃酮化合物，極性較強(qiáng)，需要用極性適合的溶劑來提取，抗菌活性高的活性成分更易溶于乙醇中。通過本研究可以得出，提取物對100℃以下溫度不敏感，經(jīng)12l℃高溫處理，僅對個別菌種的抗菌活性產(chǎn)生微弱影響，隨紫外光處理時間的變化，提取物的抑菌活性基本保持不變，由此可見，該提取物對熱及紫外具有很高的穩(wěn)定性。因此根據(jù)雞血藤乙醇提取物的抗菌特性，可以選擇75%乙醇的雞血藤提取物作為臨床感染性疾病的選擇性用藥，同時本研究也為雞血藤資源的綜合開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。近年來，研究人員不斷在雞血藤分離中出新的化合物成分，但大部分藥理研究仍停留在雞血藤醇提物或水提物研究層面，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理機(jī)制亟待深入研究[31]。同時，作為活血化瘀的經(jīng)典藥物，雞血藤復(fù)方應(yīng)用廣泛，可結(jié)合中醫(yī)藥辨證論治，進(jìn)一步研究復(fù)方藥理作用以發(fā)掘雞血藤更多的價值[32]?？傊狙芯拷Y(jié)果雖然顯示雞血藤水提物和醇提物對動物主要致病菌有不同程度的抑菌效果，但其在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)的抗菌活性尚需進(jìn)一步研究。