X射線致染色體結(jié)構(gòu)畸變玻片標(biāo)本制備的探索

宋國(guó)英，董 慧，朱美霖，賀 穎，唐 正，李 沛△

(1鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心， 鄭州 450001；2鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳與細(xì)胞生物學(xué)系； 3鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院； △通訊作者)

實(shí)驗(yàn)教學(xué)是高校教學(xué)的重要組成部分，在培養(yǎng)學(xué)生分析和解決問(wèn)題能力、培訓(xùn)嚴(yán)密的思維方法和探索科學(xué)研究等方面具有不可替代的作用[1]。醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)是高等醫(yī)學(xué)院校的一門必修課，染色體結(jié)構(gòu)畸變是遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的重要實(shí)驗(yàn)之一，國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)院?！夺t(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》收錄有染色體畸變觀察章節(jié)。該實(shí)驗(yàn)包括染色體數(shù)目畸變和結(jié)構(gòu)畸變觀察。數(shù)目畸變有45XO、47XXY標(biāo)本觀察；染色體結(jié)構(gòu)畸變包括缺失、重復(fù)、倒位、易位、插入、等臂染色體、微小體、染色單體斷裂、缺失、環(huán)狀染色體、雙著絲粒染色體等。醫(yī)學(xué)研究表明，染色體畸變是人類發(fā)生遺傳病和出生缺陷的主要因素[2]。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，現(xiàn)有的資料多見(jiàn)于臨床上開(kāi)展的染色體畸變檢測(cè)類型，如平衡移位、插入、數(shù)目異常等分析，尚未見(jiàn)教學(xué)用關(guān)于雙著絲粒、微小體、斷片、環(huán)狀染色體等染色體結(jié)構(gòu)畸變玻片標(biāo)本制備的報(bào)道，分析原因可能與標(biāo)本制作技術(shù)有關(guān)，致使染色體結(jié)構(gòu)畸變玻片標(biāo)本稀缺。本中心購(gòu)買有數(shù)目畸變標(biāo)本，學(xué)生可以鏡下直接觀察，但染色體結(jié)構(gòu)畸變玻片標(biāo)本尚未見(jiàn)銷售。因而該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)僅以示教及模式圖形式進(jìn)行，這使得染色體結(jié)構(gòu)畸變觀察實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果不理想。為滿足實(shí)驗(yàn)教學(xué)的需求，作者開(kāi)展本課題研究，探索誘導(dǎo)染色體結(jié)構(gòu)畸變所需的X射線輻照最佳劑量，為常規(guī)制備染色體結(jié)構(gòu)畸變玻片標(biāo)本提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器和試劑包括6mvX射線(醫(yī)科達(dá)牌直線加速器)，MIR-162型CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)，湘儀TDZ5-WS 型離心機(jī)，1640培養(yǎng)基(購(gòu)自暉達(dá))以及固定液、低滲液和 Giemsa染液(本實(shí)驗(yàn)室自配)。

1.2 方法

標(biāo)本采集健康男性自愿獻(xiàn)血者2例。獻(xiàn)血者不吸煙，無(wú)有毒、有害化學(xué)物質(zhì)和射線接觸史(近6個(gè)月內(nèi))，無(wú)菌條件下肝素鋰抗凝管采血4管，每管約2 ml，置直線加速器內(nèi)照射。照射條件下：在直線加速器內(nèi)距離100 cm 進(jìn)行X射線照射，照射野10×10 cm,照射劑量分別為1 Gy、2 Gy、3 Gy、4 Gy，照射量率為6 Gy/min。照射結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)人員將各劑量組0.6 ml全血接種在5 ml含血清1640混合培養(yǎng)基中，置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)56-64 h[3]，收獲細(xì)胞前3 h加入濃度為10 μg/ml 的秋水仙素5滴，使終濃度達(dá)0.08-0.1 μg/ml。

1.3 標(biāo)本制備

標(biāo)本按照參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行制備[4]。

1.3.1 收集細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)人員將培養(yǎng)細(xì)胞全部轉(zhuǎn)入15 ml塑料離心管中，以1 000 rpm 離心8-10 min， 棄上清液,向刻度離心管中加入預(yù)溫37 ℃的低滲液 7 ml，用一次性塑料滴管混勻，置37 ℃恒溫水浴中低滲 30-35 min。

1.3.2 固定 低滲后，實(shí)驗(yàn)人員加入1 ml 固定液(甲醇∶冰乙酸=2∶1)預(yù)固定，1 000 rpm離心8-10 min，棄上清液，加入7 ml 固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)混勻進(jìn)行第一次固定，固定時(shí)間20 min，1 000 rpm離心8-10 min，棄上清液。第二次和第三次固定同第一次固定。

1.3.3 制片 棄上清液后，實(shí)驗(yàn)人員視細(xì)胞數(shù)量多少加入適量固定液制成細(xì)胞懸液；吸取細(xì)胞懸液滴在冰凍載玻片上滴2-3滴，酒精燈上過(guò)火焰，晾干，用1∶10 Giemsa 染色液染色10 min(pH=6.8磷酸緩沖液稀釋)，自來(lái)水洗去多余染液，吹干，中性樹(shù)膠封片后鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 染色體結(jié)構(gòu)畸變的觀察

人離體外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)制片后，鏡下觀察染色體分布均勻、形態(tài)良好、染色體畸變易于辨認(rèn)的分裂相，觀察結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)過(guò)4個(gè)輻照劑量的觀察，3.0 Gy電離輻照劑量誘導(dǎo)染色體畸變率較高，其畸變類型多見(jiàn)微小體、染色體碎片、雙著絲粒染色體(dic)，少見(jiàn)環(huán)狀染色體(r),畸變類型見(jiàn)圖片，結(jié)合細(xì)胞生長(zhǎng)情況，認(rèn)為3.0 Gy劑量為理想的誘導(dǎo)染色體畸變輻照劑量。染色體畸變類型見(jiàn)圖1-3。

表1 不同劑量X射線輻照后染色體畸變率

圖1 雙著絲粒染色體+環(huán)狀染色體+染色體斷片

圖2 微小體+染色體斷片

圖3 染色體斷片

2.2 實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果

教師將制作的畸變玻片標(biāo)本用于2019級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。經(jīng)178名學(xué)生問(wèn)卷星調(diào)查，學(xué)生對(duì)染色體結(jié)構(gòu)畸變實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果優(yōu)評(píng)率為90.45%，認(rèn)為染色體畸變標(biāo)本分裂相多且分散良好的占82.02%，對(duì)畸變類型差評(píng)者僅占2.81%。

3 討論

染色體畸變是指染色體數(shù)目或者結(jié)構(gòu)發(fā)生的改變，按發(fā)生原因可以分為自發(fā)畸變、誘發(fā)畸變和親代遺傳，造成染色體畸變的原因有物理因素、化學(xué)因素、生物因素和母親年齡等因素。染色體畸變與人類遺傳病密切相關(guān)[5]。本文主要探討染色體結(jié)構(gòu)畸變標(biāo)本制備。電離輻射屬于物理因素，普遍認(rèn)為電離輻射引起的染色體畸變?yōu)槿旧w型結(jié)構(gòu)畸變，主要表現(xiàn)為微小體、斷片、雙著絲粒、環(huán)狀染色體等，化學(xué)致突變劑和病毒感染引起染色單體型畸變較常見(jiàn)[6]。

染色體畸變是致突變的重要因素，教學(xué)方式是通過(guò)顯微鏡下觀察染色體畸變玻片標(biāo)本來(lái)驗(yàn)證染色體畸變的理論知識(shí)，但存在的問(wèn)題是染色體數(shù)目畸變玻片標(biāo)本數(shù)量充足，結(jié)構(gòu)畸變玻片標(biāo)本無(wú)法滿足每位學(xué)生鏡下觀察的需求，這給實(shí)驗(yàn)教學(xué)帶來(lái)了一定的困難。作者用X射線誘導(dǎo)染色體結(jié)構(gòu)畸變，以獲得分裂相多且染色體畸變類型豐富的玻片標(biāo)本。由于X電離輻射劑量對(duì)標(biāo)本質(zhì)量有較大的影響，作者設(shè)定了4個(gè)X電離輻射劑量組，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)輻射劑量低于2.0 Gy時(shí)，染色體畸變率較低；照射劑量達(dá)4.0 Gy時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，染色體分裂相大量減少，染色體畸變率雖高，但顯微鏡下觀察難度增加，所制備的標(biāo)本已不能滿足教學(xué)需要；而3.0 Gy放射劑量較易發(fā)現(xiàn)多種染色體畸變類型，主要包括微小體、斷片、雙著絲粒、環(huán)狀染色體等畸變類型，且染色體分裂相也易于尋找，顯微鏡下觀察效果良好，可以制作出實(shí)驗(yàn)教學(xué)所需玻片標(biāo)本，提示3.0 GyX射線輻照劑量是制作染色體畸變標(biāo)本較合適的放射劑量，且滿足學(xué)生獨(dú)立觀察染色體結(jié)構(gòu)畸變的需求，改變示教及模式圖的教學(xué)方式；經(jīng)學(xué)生問(wèn)卷星調(diào)查分析，染色體畸變觀察實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果優(yōu)評(píng)率達(dá)90.45%，滿足了染色體畸變觀察實(shí)驗(yàn)教學(xué)的需求。

實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作的重點(diǎn)在于激發(fā)學(xué)生探求科學(xué)研究的興趣，使實(shí)驗(yàn)室成為培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新精神和實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ闹饕嚨豙7]。這需要克服各種困難，大膽探討，提高技術(shù)水平，才能開(kāi)創(chuàng)具有特色的、多樣化的實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程。染色體畸變玻片標(biāo)本制作的難點(diǎn)在于輻照劑量，掌握合適的輻照劑量是成功制作標(biāo)本的關(guān)鍵。本中心制作的100張染色體結(jié)構(gòu)畸變玻片標(biāo)本已用于醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，使學(xué)生對(duì)染色體畸變有了感性認(rèn)知，提高了醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的效果，并為染色體畸變玻片標(biāo)本的制作提供技術(shù)參考。