基于響應(yīng)面法優(yōu)化獼猴桃白蘭地釀造工藝

李建芳，余鴻飛，丁 慧，靳羽慧，張陽陽，周 楓

（1.信陽農(nóng)林學(xué)院 食品學(xué)院，河南 信陽 464000；2.河南省豫南特色食物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，河南 信陽 464000）

獼猴桃又稱羊桃、藤梨、奇異果等，為起源于我國的多年生落葉藤本植物[1]，其果實(shí)富含維生素C、維生素E、多酚等多種抗氧化物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[2]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，截至2019年，我國的獼猴桃種植面積及產(chǎn)量穩(wěn)居世界第一[3]，是名副其實(shí)的獼猴桃種植大國。

獼猴桃屬于呼吸躍變型水果，其季節(jié)性強(qiáng)、成熟期集中、不耐儲運(yùn)的特點(diǎn)，使得產(chǎn)地面臨巨大的倉儲與銷售壓力[4]。目前我國的獼猴桃仍以鮮食為主[5]，獼猴桃深加工產(chǎn)業(yè)仍較為單一。大量的獼猴桃被用以制作果汁、果脯、果醬等產(chǎn)品，同質(zhì)化程度高，且對獼猴桃的附加值提升十分有限[6]。

本試驗(yàn)以新鮮獼猴桃為原料，通過發(fā)酵與蒸餾獲得獼猴桃白蘭地，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化獼猴桃白蘭地的生產(chǎn)條件，以期豐富優(yōu)質(zhì)獼猴桃資源深加工產(chǎn)品，有助于緩解獼猴桃成熟期集中帶來的銷售難題，對于延長獼猴桃產(chǎn)業(yè)鏈，增加產(chǎn)品附加值，促進(jìn)獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有較強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

優(yōu)質(zhì)無破損獼猴桃：市售；71 B降酸型活性干酵母：丹麥拉曼德有限公司；果膠酶（食品級，酶活力5萬U/g）：河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；蔗糖（食品級）、無水碳酸鈉、無水乙醇（均為分析純）：無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；pH 0.5～5.0精密pH試紙：上海三愛思試劑有限公司；醫(yī)用級脫脂棉、脫脂棉紗布：?？h潔云衛(wèi)生材料有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-250BШ型生化培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司；MA-A1-159型電蒸鍋：中山市美澳塑膠制品有限公司；HHR-2W型手持式折射儀：成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 獼猴桃白蘭地釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

獼猴桃→分選清洗→破碎打漿→酶解→調(diào)節(jié)糖酸度→接種酵母→主發(fā)酵→過濾→蒸餾→陳釀→獼猴桃白蘭地

原料的篩選及預(yù)處理：篩選成熟度適中的獼猴桃[7]，使用蒸餾水進(jìn)行表面清洗后，將果實(shí)連皮使用破壁機(jī)破碎，制備果漿。

酶解：向獼猴桃勻漿中加入70 mg/L[8]果膠酶充分?jǐn)嚢瑁?5 ℃靜置2 h。

調(diào)節(jié)糖酸度：使用化學(xué)法進(jìn)行初次降酸，向果膠酶處理后的果漿中加入1.8 g/L碳酸鈉調(diào)節(jié)后總酸含量為4.6 g/L（以檸檬酸計(jì)）[9]；通過外源添加蔗糖的方式進(jìn)行初始含糖量的調(diào)節(jié)。

酵母接種與主發(fā)酵：稱取適量71B活性酵母干粉溶解于100 mL 35 ℃溫水[10]，靜置20 min進(jìn)行活化。將活化后的酵母以一定接種量加入獼猴桃果漿中充分混勻，完成酵母接種。將接種完成后的果漿轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)，每罐1 L（不超過容積的60%），于一定溫度條件下進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵液殘?zhí)牵? g/L時(shí)視為發(fā)酵結(jié)束[11]。

過濾及蒸餾：發(fā)酵結(jié)束后，使用雙層紗布進(jìn)行醪液分離，去除發(fā)酵后的酒糟。獲得的獼猴桃酒滿罐密封、避光儲存于16 ℃條件下，避免氧化對成品酒品質(zhì)的不良影響。將過濾獲得的獼猴桃酒置入蒸餾裝置中，使用二次蒸餾法進(jìn)行白蘭地蒸餾：一次蒸餾溫度約95 ℃，保留10%vol～70%vol酒精度的蒸餾酒，以提升獲得的獼猴桃白蘭地質(zhì)量。二次蒸餾收集30%vol～70%vol酒精度的蒸餾酒，剩余的酒頭與酒尾與預(yù)蒸餾的原酒混合，繼續(xù)進(jìn)行蒸餾[12-14]。

陳釀：將蒸餾后獲得的獼猴桃白蘭地放入儲酒桶中滿罐密封陳釀45 d[15]，以減輕新生產(chǎn)的白蘭地所具有的辛辣、苦澀、刺激口感。陳釀過程中嚴(yán)格控制陳釀溫度（15 ℃）及儲藏室光線，持續(xù)監(jiān)測酒液揮發(fā)酸含量，以避免對成品酒品質(zhì)造成不利影響[16]。

1.3.2 獼猴桃白蘭地釀造工藝條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

發(fā)酵時(shí)間對獼猴桃白蘭地出酒率及感官評分的影響：將破碎后的獼猴桃果漿糖度調(diào)整至17%，接種0.2 g/L活化后的干酵母，發(fā)酵溫度為22 ℃，發(fā)酵時(shí)間分別為5 d、6 d、7 d、8 d、9 d[17]。發(fā)酵結(jié)束后蒸餾發(fā)酵液，得到酒精度為40%vol[18]獼猴桃白蘭地進(jìn)行感官評價(jià)并計(jì)算出酒率，探究發(fā)酵時(shí)間對獼猴桃白蘭地出酒率及感官評分的影響。

發(fā)酵溫度對獼猴桃白蘭地出酒率及感官評分的影響：將破碎后的獼猴桃果漿糖度調(diào)整至17%，接種0.2 g/L活化后的干酵母，分別于18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃條件下發(fā)酵7 d[15]。發(fā)酵結(jié)束后蒸餾發(fā)酵液，得到酒精度為40%vol獼猴桃白蘭地進(jìn)行感官評價(jià)并計(jì)算出酒率，探究發(fā)酵溫度對獼猴桃白蘭地出酒率及感官評分的影響。

酵母接種量對獼猴桃白蘭地出酒率及感官評分的影響：將破碎后的獼猴桃果漿糖度調(diào)整至17%，分別接種0.05 g/L、0.20 g/L、0.35 g/L、0.50 g/L、0.65 g/L活化后的干酵母[20]，發(fā)酵溫度為22 ℃，發(fā)酵時(shí)間為7 d。發(fā)酵結(jié)束后蒸餾發(fā)酵液，得到酒精度為40%vol獼猴桃白蘭地進(jìn)行感官評價(jià)并計(jì)算出酒率，探究發(fā)酵過程中酵母接種量對獼猴桃白蘭地出酒率及感官評分的影響。

初始糖度對獼猴桃白蘭地出酒率及感官評分的影響：將破碎后的獼猴桃果漿糖度分別調(diào)整至13.6%、15.3%、17.0%、18.7%、20.4%，以0.2 g/L接種活化后的干酵母，發(fā)酵溫度為22 ℃，發(fā)酵時(shí)間為7 d。發(fā)酵結(jié)束后蒸餾發(fā)酵液，得到酒精度為40%vol獼猴桃白蘭地進(jìn)行感官評價(jià)并計(jì)算出酒率，探究初始糖度對獼猴桃白蘭地出酒率及感官評分的影響[21]。

1.3.3 獼猴桃白蘭地釀造工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

選擇發(fā)酵溫度（A）、酵母接種量（B）、初始糖度（C）為響應(yīng)面優(yōu)化的3個(gè)考察因素，每個(gè)因素分別設(shè)定-1、0、1水平，以出酒率（Y1）、感官評分（Y2）為響應(yīng)值，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 獼猴桃白蘭地釀造工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for kiwifruit brandy brewing process optimization

1.3.4 測定方法

總糖、總酸、揮發(fā)酸、酒精度的測定：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[22]。

出酒率的計(jì)算：參考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[23]，先將所得原酒酒精度轉(zhuǎn)化成50%vol，經(jīng)查酒精度對照表，折算在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下，20 ℃時(shí)蒸餾出的白蘭地體積（mL）及酒度。計(jì)算公式如下：

感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：感官評定由20名經(jīng)統(tǒng)一培訓(xùn)的食品發(fā)酵專業(yè)老師及學(xué)生組成，采用9點(diǎn)類項(xiàng)標(biāo)度的方法從香氣、味道和色澤方面對獼猴桃白蘭地進(jìn)行感官評定。根據(jù)各位評委的評分計(jì)算均值，感官評定總分為各項(xiàng)評分均值之和，感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 獼猴桃白蘭地感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of kiwifruit brandy

續(xù)表

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及均值計(jì)算，使用Design Expert 8.0.6軟件繪制回歸模型及響應(yīng)面分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃白蘭地釀造工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對獼猴桃白蘭地感官評分及出酒率的影響

由圖1可知，出酒率隨發(fā)酵時(shí)間延長呈先上升后下降的趨勢，發(fā)酵5 d時(shí)殘?zhí)瞧?，發(fā)酵仍不完全，出酒率僅為7.89%；發(fā)酵7～8 d時(shí)，出酒率較穩(wěn)定，為13.75%；至9 d時(shí)出酒率略有下降，為12.7%，這一現(xiàn)象可能與發(fā)酵過程中的酒精揮發(fā)有關(guān)，也可能是發(fā)酵末期酵母活力下降，導(dǎo)致雜菌生長分解酒精所致。感官評分隨發(fā)酵時(shí)間延長呈先升高后趨于平穩(wěn)的趨勢，發(fā)酵3 d時(shí)發(fā)酵罐中開始產(chǎn)生果香；發(fā)酵5 d時(shí)發(fā)酵仍不完全，酒精含量低，香氣物質(zhì)含量較少，感官評分僅為75分；發(fā)酵7～9 d的感官評分維持在80分，但發(fā)酵7 d時(shí)，果香和發(fā)酵香氣更為突出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長酒體果香逐漸變淡，同時(shí)出現(xiàn)苦澀感。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間7 d為宜。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對獼猴桃白蘭地出酒率和感官評分的影響Fig. 1 Effect of fermentation time on liquor yield and sensory score of kiwifruit brandy

2.1.2 發(fā)酵溫度對獼猴桃白蘭地感官評分及出酒率的影響

由圖2可知，出酒率隨發(fā)酵溫度升高呈先上升后下降的趨勢，發(fā)酵溫度18 ℃條件下酵母活力較弱、起酵速度慢、出酒率低，僅為7.37%；18～22 ℃區(qū)間內(nèi)，出酒率與發(fā)酵溫度呈正相關(guān)，發(fā)酵溫度22 ℃時(shí)獼猴桃白蘭地出酒率最高，為12.7%；發(fā)酵溫度超過22 ℃后出酒率逐漸下降，這可能與酒精揮發(fā)及高溫條件下酵母的過早老化相關(guān)[24]。感官評分隨發(fā)酵溫度升高呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)發(fā)酵溫度為18 ℃時(shí)，酒體具有明顯苦澀感，這可能是酵母降酸能力受限造成有機(jī)酸含量升高所致；22 ℃時(shí)酵母的發(fā)酵活力強(qiáng)，獼猴桃白蘭地的香氣更加細(xì)膩優(yōu)雅，感官評分為82分；發(fā)酵溫度超過22 ℃時(shí)發(fā)酵速度顯著加快且酵母老化也隨之加快，快速的發(fā)酵也加劇了香氣物質(zhì)的揮發(fā)，造成香氣質(zhì)量下降。因此，選擇發(fā)酵溫度22 ℃為宜。

圖2 發(fā)酵溫度對獼猴桃白蘭地出酒率和感官評分的影響Fig. 2 Effect of fermentation temperature on liquor yield and sensory score of kiwifruit brandy

2.1.3 酵母接種量對獼猴桃白蘭地感官評分及出酒率的影響

由圖3可知，出酒率隨酵母接種量的增大呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)酵母接種量為0.05 g/L時(shí)，由于接入的釀酒酵母過少，造成了初期的發(fā)酵遲滯及后期的酵母老化，導(dǎo)致了出酒率的降低，僅為9.73%；當(dāng)酵母接種量為0.35 g/L時(shí)，獼猴桃白蘭地出酒率最高，為20.0%；而當(dāng)酵母接種量＞0.35 g/L時(shí)，過多的酵母導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)迅速被消耗，發(fā)酵基質(zhì)環(huán)境迅速惡化，使得酵母大量死亡并發(fā)生自溶，最終導(dǎo)致出酒率的下降，為12%。感官評分隨酵母接種量的增加呈先升高后降低的趨勢，酵母接種量為0.05 g/L時(shí)，獼猴桃果漿不能較好的完成發(fā)酵，香氣較為閉鎖，且具有不良發(fā)酵風(fēng)味，感官評分僅為75分；當(dāng)酵母接種量為0.35 g/L時(shí)，釀酒酵母發(fā)酵性能最佳，獼猴桃果香濃郁且具有豐富的發(fā)酵香氣，感官評分達(dá)到80分；當(dāng)酵母接種量＞0.35 g/L時(shí)起酵較快，果香及發(fā)酵香氣快速產(chǎn)生，但發(fā)酵期結(jié)束后留存的香氣明顯變淡，澀味也略有增加，感官評分有所降低。因此，選擇酵母接種量0.35 g/L為宜。

圖3 酵母接種量對獼猴桃白蘭地出酒率和感官評分的影響Fig. 3 Effect of yeast inoculum on liquor yield and sensory score of kiwifruit brandy

2.1.4 初始糖度對獼猴桃白蘭地感官評分及出酒率的影響

由圖4可知，出酒率隨初始糖度的增大呈先上升后下降的趨勢，初始糖度為13.6%時(shí)出酒率最低，為8.67%，可能是低糖度條件下酒精發(fā)酵底物不足所致；當(dāng)初始糖度為17%時(shí)，獼猴桃白蘭地的出酒率達(dá)到最高，為16.67%；初始糖度＞17%后，出酒率與含糖量呈反比下降，其原因可能為過高的初始糖度會對釀酒酵母產(chǎn)生滲透壓脅迫，造成酵母前期活力不足，起酵困難，從而導(dǎo)致獼猴桃白蘭地的出酒率降低[25]。感官評分隨初始糖度的增加呈先升高后降低的趨勢，初始糖度為13.6%時(shí)發(fā)酵速度慢，發(fā)酵結(jié)束后果香與發(fā)酵香氣均較淡，感官評分僅有73分；當(dāng)調(diào)整初始糖度為17%時(shí)，起酵速度較快，蒸餾過后得到的酒體香味較突出，感官評分最高，為82分；初始糖度＞17%時(shí)，高濃度的糖含量造成了發(fā)酵初期的滲透壓脅迫，并在發(fā)酵末期促進(jìn)了其他微生物的代謝，并最終影響了獼猴桃白蘭地的品質(zhì)。因此，選擇初始糖度17%為宜。

圖4 初始糖度對獼猴桃白蘭地出酒率和感官評分的影響Fig. 4 Effect of initial sugar content on liquor yield and sensory score of kiwifruit brandy

2.2 獼猴桃白蘭地釀造工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 回歸模型建立及方差分析

使用Design Expert 8.0.6軟件對Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到出酒率（Y1）、感官評分（Y2）與發(fā)酵溫度（A）、酵母接種量（B）、初始糖度（C）間的二次多項(xiàng)回歸模型：

出酒率：Y1=21.69+0.57A+0.78B+0.27C+AB-1.17AC+1.63BC-3.59A2-1.53B2-1.50C2

感官評分：Y2=83.20+1.13A+0.38B+1.25C+0.25AB+AC+0.5BC-3.73A2-3.73B2-3.47C2

表3 獼猴桃白蘭地釀造工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments for kiwifruit brandy brewing process optimization

對出酒率試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。由表4可知，該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），所得的回歸方程能夠很好的預(yù)測響應(yīng)值；在回歸分析模型中，一次項(xiàng)B和交互項(xiàng)AB、AC、BC及二次項(xiàng)A2、B2、C2均對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)A對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），在響應(yīng)值分析中占主要影響因素；在選取的各因素水平范圍中，按照影響響應(yīng)值的大小，排列順序?yàn)锽（酵母接種量）＞A（發(fā)酵溫度）＞C（初始糖度），響應(yīng)面結(jié)果方差分析中模型決定系數(shù)為0.983 9，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj為0.963 2，證明擬合度較好，能夠解釋96.32%的響應(yīng)值變化。

表4 以出酒率為評價(jià)指標(biāo)的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of response surface experiments results using liquor yield as evaluation index

對感官評價(jià)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。由表5可知，該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），所得回歸方程能夠很好的預(yù)測響應(yīng)值；在回歸分析模型中，一次項(xiàng)A、C及二次項(xiàng)A2、B2、C2均對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），在響應(yīng)值分析中占主要影響因素；在選取的各因素水平范圍中，依據(jù)方程系數(shù)的估計(jì)值A(chǔ)=1.13，B=0.38和C=1.25，按照影響響應(yīng)值的大小，排列順序?yàn)镃（初始糖度）＞A（發(fā)酵溫度）＞B（酵母接種量），響應(yīng)面結(jié)果方差分析中模型決定系數(shù)為0.979 0，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj為0.952 1，證明擬合度較好，能夠解釋95.21%響應(yīng)值的變化。

表5 以感官評分為評價(jià)指標(biāo)的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of response surface experiments results using sensory score as evaluation index

2.2.2 出酒率響應(yīng)面分析及優(yōu)化

使用Design Expert 8.0.6軟件根據(jù)出酒率回歸模型繪制響應(yīng)面分析圖，以進(jìn)一步研究各因素間交互作用對出酒率的影響作用，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，發(fā)酵溫度、酵母接種量、初始糖度間交互作用對獼猴桃白蘭地出酒率影響的響應(yīng)面均呈凸面，存在最高點(diǎn)，且等高線均呈橢圓形，說明各因素間交互作用對獼猴桃白蘭地的出酒率的影響顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖5 發(fā)酵溫度、酵母接種量、初始糖度交互作用對獼猴桃白蘭地出酒率影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig. 5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,yeast inoculum,initial sugar content on liquor yield of kiwifruit brandy

根據(jù)出酒率的回歸模型方程得到獼猴桃白蘭地的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度22 ℃，初始糖度18%，酵母菌接種量0.37 g/L，此時(shí)獼猴桃白蘭地出酒率的預(yù)測值為21.93%。根據(jù)感官評分的回歸模型方程得到獼猴桃白蘭地的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度20.5 ℃，初始糖度14%，酵母菌接種量0.34 g/L，此時(shí)獼猴桃白蘭地感官評分的預(yù)測值為85分。

由于出酒率與生產(chǎn)成本直接相關(guān)，且最高出酒率發(fā)酵條件下的預(yù)測感官評分（83分）與感官評分回歸模型方程預(yù)測得到的最高感官評分（85分）差異較小，綜合考慮，確定獼猴桃白蘭地的最優(yōu)發(fā)酵工藝為發(fā)酵溫度22 ℃，初始糖度18%，酵母菌接種量0.37 g/L。

為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，以分析得到的最佳發(fā)酵工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，三組平行試驗(yàn)得到的出酒率分別為21.76%、21.88%和22.06%，均值為21.90%，與理論預(yù)測值21.93%非常接近，在此條件下得到的獼猴桃白蘭地果香酒香濃郁，風(fēng)味典型性，感官評分為81分。因此認(rèn)為該響應(yīng)面法優(yōu)化獼猴桃白蘭地釀造工藝較為準(zhǔn)確，可應(yīng)用到釀造白蘭地實(shí)際生產(chǎn)中。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)及中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)對獼猴桃白蘭地的釀造工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明對出酒率影響的順序?yàn)榻湍附臃N量（B）＞發(fā)酵溫度（A）＞初始糖度（C），對感官評分影響的順序?yàn)镃（初始糖度）＞A（發(fā)酵溫度）＞B（酵母接種量）。以出酒率為主要評價(jià)指標(biāo)，得出獼猴桃白蘭地的最優(yōu)工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度22 ℃、初始糖度18%，酵母菌接種量0.37 g/L。此條件下，出酒率可達(dá)21.90%，得到的獼猴桃白蘭地果香酒香濃郁，風(fēng)味典型性，感官評分為81分。證明響應(yīng)面模型擬合效果較好。該工藝條件下所得的獼猴桃白蘭地果香酒香濃郁，風(fēng)味典型性，具有良好的應(yīng)用前景。