CDK2/4/6抑制劑PF-06873600的合成工藝研究

丁 蕾 袁 昕 姜虹羽 焦小雨 邵俊蘭 唐春雷

(江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

PF-06873600的化學(xué)名稱為6-(二氟甲基)-8-((1R，2R)-2-羥基-2-甲基環(huán)戊基)-2-((1-(甲磺?；?哌啶-4-基)氨基)吡啶基[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮，是由美國輝瑞制藥公司研發(fā)的一種具有口服活性的、選擇性的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)抑制劑[1]。CDKs屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，其激酶活性需要與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合來激活，在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄過程中起著重要作用，通過靶向CDKs阻滯細(xì)胞增殖和分化已成為抗腫瘤的重要方法[2，3]。由輝瑞制藥公司研發(fā)的CDK4/6抑制劑帕博西尼(Palbociclib)，已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于治療乳腺癌[4]，然而隨著臨床研究的不斷發(fā)展，帕博西尼的臨床療效逐漸表現(xiàn)出耐藥性[5]。Freeman-Cook, Kevin等人通過臨床前模型和臨床轉(zhuǎn)錄組標(biāo)本的分析發(fā)現(xiàn)CDK2信號(hào)通路的激活作為一種補(bǔ)償性機(jī)制導(dǎo)致了其耐藥性[1]。基于帕博西尼的支架設(shè)計(jì)得到的PF-06873600在臨床前研究中表現(xiàn)出較高的選擇性和抗腫瘤活性，其對(duì)CDK2、CDK4和CDK6的酶抑制常數(shù)(Ki)分別為0.09 nM、0.13 nM和0.16 nM。目前，一項(xiàng)名為PF-06873600針對(duì)癌癥患者的研究正處于臨床Ⅱ期(NCT03519178)。PF-06873600有望在因?qū)ε敛┪髂岙a(chǎn)生耐藥性而復(fù)發(fā)的疾病中表現(xiàn)出有效的治療活性。本文對(duì)PF-06873600的合成方法進(jìn)行研究，以期為該化合物的合成以及結(jié)構(gòu)類似物的研究提供理論參考。

目前，只有原研公司報(bào)道了PF-06873600的合成路線(圖1)[6,7]:以1-甲基-6-氧雜雙環(huán)[3，1，0]己烷(1)為起始原料，在100 ℃條件下以水為溶劑，與芐胺反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)萃取、旋蒸和正庚烷打漿后得到淡黃色固體產(chǎn)物2；隨后用手性氨基酸進(jìn)行手性拆分得到3；產(chǎn)物3在Pd(OH)2/C和H2條件下脫芐胺得到中間體4；以(4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-基)甲醇為原料，異丙醇作為溶劑，在N,N-二異丙基乙胺催化下，與中間體4發(fā)生取代反應(yīng)，得到產(chǎn)物5；隨后產(chǎn)物5經(jīng)二氧化錳氧化得到氧化產(chǎn)物6；產(chǎn)物6與乙酸乙酯在LiHMDS的催化下環(huán)合得到環(huán)合產(chǎn)物7；環(huán)合產(chǎn)物7再經(jīng)氧化劑oxone氧化得到中間體8；之后1-甲砜基-4-氨基哌啶與中間體8發(fā)生取代反應(yīng)得到產(chǎn)物9；隨后以乙腈為溶劑，產(chǎn)物9與N-碘代琥珀酰亞胺發(fā)生取代反應(yīng)得到碘代產(chǎn)物10；最后碘代產(chǎn)物10與(二氟甲基)三甲基硅烷反應(yīng)得到終產(chǎn)物PF-06873600。

圖1 PF-06873600的合成路線1

原研專利的合成路線步驟為10步反應(yīng)，其合成起始原料較為昂貴，增加了工藝成本，另外部分中間體的合成過程較為復(fù)雜，限制了該合成路線在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。本文以廉價(jià)易得的1-甲基環(huán)戊烯(K-1)為起始原料，經(jīng)一步反應(yīng)即可得到昂貴的1-甲基-6-氧雜雙環(huán)[3，1，0]己烷(1)，且收率高達(dá)95%，大大降低了工藝成本。本工藝路線中用更廉價(jià)的5-溴-2，4-二氯嘧啶替換(4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-基)甲醇，經(jīng)三步反應(yīng)即可得到中間體9(K-6)，較原研路線縮短了一步，且收率由原來的34.9%提升至36.2%。另外，在K-6的后處理中，經(jīng)實(shí)驗(yàn)探索，采用正庚烷∶乙酸乙酯=10∶1作為打漿溶劑，節(jié)約了時(shí)間和溶劑成本。優(yōu)化后的工藝路線在保證總收率的前提下，降低了生產(chǎn)成本和能耗，反應(yīng)條件相對(duì)溫和，后處理操作簡便，適合工業(yè)化制備。合成路線見圖2。

圖2 PF-06873600的合成路線2

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

LCMS-80質(zhì)譜儀(日本島津公司)；LC1260色譜儀(安捷倫科技有限公司)；Bruker AVII-400 MHZ 核磁共振儀(德國Bruker公司，TMS為內(nèi)標(biāo))；紫外線分析儀(鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為市售分析純或化學(xué)純，未進(jìn)一步純化處理。

1.2 合成步驟

1.2.1 2-(芐基氨基)-1-甲基環(huán)戊烷-1-醇(K-2)的制備

1-甲基環(huán)戊烯(30 g，365 mmol)溶于300 mL DCM中，冰浴條件下，慢慢滴加m-CPBA(94.53 g，547.5 mmol)的DCM(100 mL)混懸液，滴畢，移至室溫，攪拌反應(yīng)過夜。TLC監(jiān)測原料反應(yīng)完畢。反應(yīng)液硅藻土過濾，濾液依次用10%硫代硫酸鈉水溶液洗兩遍、飽和碳酸氫鈉水溶液洗三遍、水洗一遍，之后加入無水硫酸鈉干燥，抽濾，濾液減壓濃縮，得到淡黃色油狀液體(34 g，收率95%)，不做進(jìn)一步純化直接投入下一步反應(yīng)。在裝有100 mL水和芐胺(36.5 g，341 mmol)的反應(yīng)瓶中加入淡黃色油狀液體(33.5 g，341 mmol)，將反應(yīng)瓶移至100 ℃油浴中攪拌18 h，反應(yīng)體系冷卻至室溫，移至冰浴中。反應(yīng)液中先加適量水，然后用濃HCl調(diào)pH至1，乙酸乙酯萃取兩遍，合并水相，并用NaOH調(diào)pH至10；再用乙酸乙酯萃取三遍，合并有機(jī)相，有機(jī)相中加無水硫酸鈉，抽濾，濾液減壓濃縮除去大部分溶劑得棕褐色油狀液體。棕褐色油狀液體在更高真空度的條件下濃縮除去一部分芐胺，然后向殘留液體中加入正庚烷攪拌30 min，有淡黃色固體析出，抽濾，真空干燥后得到淡黃色固體49 g，收率為65.4%。MS-ESI, m/z：206[M+H]+。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ：7.38-7.32 (m, 4H), 7.28-7.23 (m, 1H), 3.91(d,J=13.2 Hz,1H), 3.80(d,J=13.3 Hz, 1H), 2.89(dd,J=8.7, 7.5 Hz, 1H), 2.12-2.07 (m, 1H), 1.80-1.59 (m, 5H), 1.37-1.31 (m, 1H), 1.26(s, 3H)。

1.2.2 (1R，2R)-2-(芐基氨基)-1-甲基環(huán)戊烷-1-醇((1R,1R)K-2)的制備

在單口瓶A中，將K-2(48 g，233.8 mmol)溶于EtOH(320 mL)，加熱至80 ℃，回流攪拌30 min。同時(shí)在配有內(nèi)插溫度計(jì)和冷凝管的三頸瓶B中，將手性氨基酸(2S)-[(3，5-二硝基苯甲?；?氨基](苯基)乙酸(40.4 g，116.9 mmol，0.5eq)溶于EtOH(640 mL)，加熱至80 ℃，回流攪拌30 min，至白色固體溶解，溶液澄清。然后在80 ℃條件下將A瓶中的反應(yīng)液慢慢加入B瓶中，可以觀察到逐漸有固體產(chǎn)生，繼續(xù)在80 ℃條件下攪拌4 h，反應(yīng)瓶降溫至室溫，抽濾干燥后得白色固體46.7 g。將白色固體溶于水(200 mL)和乙酸乙酯(300 mL)的混合溶液中，向混合溶液中加入稀鹽酸(4 M, 50 mL)攪拌30 s，可觀察到有清晰的分層。分液得到水相和有機(jī)相。有機(jī)相進(jìn)一步用稀鹽酸(0.2 M, 25 mL×2)洗兩遍，然后合并三次水相，在冰浴條件下用NaOH緩慢地將pH調(diào)至10，加入70 mL飽和NaCl稀釋，用乙酸乙酯萃取4遍，合并有機(jī)相。有機(jī)相中加無水硫酸鈉干燥，抽濾，濾液減壓濃縮得白色固體(1R，2R)-2-(芐基氨基)-1-甲基環(huán)戊烷-1-醇(22.8 g)，收率為95%。隨后用1.0 eq的(2S)-[(3，5-二硝基苯甲酰基)氨基](苯基)乙酸將所得產(chǎn)物重復(fù)上述操作一次，最終得到白色固體22.1 g，收率為92%。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ：7.38-7.32 (m, 4H), 7.28-7.23 (m, 1H), 3.91 (d,J=13.2 Hz, 1H), 3.80(d,J=13.3 Hz, 1H), 2.89 (dd,J=8.7, 7.5 Hz, 1H), 2.12-2.07 (m, 1H), 1.80-1.59 (m, 5H), 1.37-1.31 (m, 1H), 1.26 (s, 3H)。

1.2.3 (1R，2R)-2-((5-溴-2-氯嘧啶-4-基)氨基)-1-甲基環(huán)戊烷-1-醇(K-3)的制備

將(1R,1R)K-2(22 g，107.2 mmol)溶于異丙醇(500 mL)中，加入Pd/C(2.2 g)，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜，TLC監(jiān)測反應(yīng)完成。用硅藻土過濾反應(yīng)液除去鈀碳，濾餅用異丙醇洗兩遍，濾液減壓濃縮至溶劑剩余約300 mL，不做進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。在濾液中依次加入5-溴-2，4-二氯嘧啶(24.4 g，107.2 mmol)和三乙胺(10.7 g，107.2 mmol)，反應(yīng)液于室溫下攪拌4 h，TLC監(jiān)測反應(yīng)完成。反應(yīng)液減壓濃縮后經(jīng)柱層析得到白色固體25.2 g，收率為77%。MS-ESI, m/z：306，308[M+H]+。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ：8.17 (s, 1H), 5.47 (s, 1H), 4.27 (s, 1H), 4.24-4.18 (m, 1H), 2.30 (dt,J=8.3, 4.1 Hz, 1H), 2.00 (dd,J=11.4, 6.7 Hz, 1H), 1.88-1.73 (m, 3H), 1.57-1.50 (m, 1H), 1.15 (s, 3H)。

1.2.4 (1R，2R)-2-((5-溴-2-((1-(甲磺酰)哌啶-4-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-1-甲基環(huán)戊烷-1-醇(K-4)的制備

將K-3(25 g，82 mmol)溶于DMSO中，依次加入N,N-二異丙基乙胺(12.7 g，98.4 mmol)和1-甲砜基-4-氨基哌啶(20.5 g，114.8 mmol)，升溫至100 ℃攪拌反應(yīng)6 h，然后繼續(xù)升溫至110 ℃攪拌反應(yīng)6 h，TLC監(jiān)測反應(yīng)完成。反應(yīng)液用二氯甲烷稀釋，水洗四遍，水相用二氯甲烷萃取，然后合并有機(jī)相。有機(jī)相中加入無水硫酸鈉干燥，抽濾，濾液減壓濃縮后經(jīng)石油醚打漿得到白色固體24.9 g，收率為68%。MS-ESI, m/z：448，450[M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：7.86 (s, 1H), 6.83 (s, 1H), 5.78 (d,J=7.9 Hz, 1H), 4.61 (s, 1H), 4.24 (d,J=7.8 Hz, 1H), 3.74 (s, 1H), 3.53-3.48 (m, 2H), 2.86 (s, 3H), 2.81 (d,J=3.1 Hz, 2H), 1.92 (s, 2H), 1.66-1.58 (m, 4H), 1.57-1.43 (m, 4H), 1.09 (s, 3H)。

1.2.5 乙基(E)-3-(4-((1R，2R)-2-羥基-2-甲基環(huán)戊基)氨基)-2-((1-(甲基磺?；?哌啶-4-基)氨基)嘧啶-5-基)丙烯酸酯(K-5)的制備

將K-4(24 g，53.7 mmol)溶于DMF(250 mL)中，依次加入碳酸鉀(14.8 g，76 mmol)，四三苯基磷鈀(12.4 g，7.6 mmol)和丙烯酸乙酯(8 g，80.5 mmol)。氮?dú)獗Ｗo(hù)，升溫至95 ℃，攪拌反應(yīng)過夜。反應(yīng)液冷卻至室溫后用硅藻土過濾，乙酸乙酯(200 mL)淋洗濾餅，濾液用水洗兩遍，合并分液所得有機(jī)相，加入無水硫酸鈉干燥、抽濾和減壓濃縮后得到粗產(chǎn)物K-5(17.5 g)，收率為70%。粗產(chǎn)物無需純化可直接用于下一步。MS-ESI, m/z：468[M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：8.28 (s, 1H), 7.80 (d,J=15.6 Hz, 1H), 7.16 (d,J=28.3 Hz, 1H), 6.89 (s, 1H), 6.24 (d,J=15.6 Hz, 1H), 4.69 (d,J=51.8 Hz, 1H), 4.35 (s, 1H), 4.14 (q,J=7.1 Hz, 2H), 3.85 (s, 1H), 3.53 (d,J=6.7 Hz, 2H), 2.87 (s, 3H), 2.85-2.79 (m, 2H), 1.96 (d,J=23.9 Hz, 4H), 1.65 (s, 6H), 1.23 (t,J=7.1 Hz, 3H), 1.06 (s, 3H)。

1.2.6 8-((1R，2R)-2-羥基-2-甲基環(huán)戊基)-2-((1-(甲基磺?；?哌啶-4-基)氨基)吡啶[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(K-6)的制備

將K-5(17 g，36.4 mmol)溶于無水四氫呋喃(100 mL)中，于室溫下加入1 mol/L的叔丁醇鉀的四氫呋喃溶液(145.6 mL, 145.6 mmol)，升溫至45 ℃，攪拌至反應(yīng)完成。反應(yīng)液冷卻至室溫加水淬滅，反應(yīng)液用乙酸乙酯稀釋，分液得有機(jī)相，干燥、減壓濃縮后得到粗產(chǎn)物，粗產(chǎn)物在正庚烷/乙酸乙酯的混合溶液(體積比10∶1)中打漿得到產(chǎn)物K-6(11.6 g)，收率為76%。MS-ESI, m/z：422[M+H]+。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ：9.53 (s, 1H), 8.43 (s, 1H), 7.46 (d,J=9.3 Hz, 1H), 6.36 (d,J=9.3 Hz, 1H), 5.74 (s, 1H), 4.24 (s, 1H), 4.02 (s, 1H), 3.82 (s, 2H), 2.96-2.91 (m, 2H), 2.84 (s, 3H), 2.82 (s, 1H), 2.25 (d,J=3.0 Hz, 2H), 2.03 (dd,J=7.0, 3.2 Hz, 2H), 1.88-1.83 (m, 2H), 1.70-1.65 (m, 4H), 1.19 (s, 3H)。

1.2.7 8-((1R，2R)-2-羥基-2-甲基環(huán)戊基)-6-碘-2-((1-(甲磺?；?哌啶-4-基)氨基)吡啶[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(K-7)的制備

將K-6(11 g，26.1 mmol) 和N-碘代琥珀酰亞胺(8.8 g，39.1 mmol)溶于乙腈(110 mL)中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，30 ℃攪拌30 min后，加入對(duì)甲苯磺酸水合物(0.5 g，2.6 mmol)，繼續(xù)氮?dú)獗Ｗo(hù)，30 ℃攪拌2 h。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成，反應(yīng)液用5%的亞硫酸鈉水溶液(150 mL)淬滅，減壓濃縮至剩余溶液約150 mL，然后于0 ℃下攪拌1 h；混合物抽濾，濾餅用5%的乙腈水溶液(150 mL)洗3次，置于真空干燥箱干燥過夜，得淡黃色固體11.1 g，收率78%。MS-ESI, m/z：548[M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：8.60 (d,J=14.7 Hz, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.03 (d,J=7.3 Hz, 1H), 5.90 (s, 1H), 4.37 (s, 1H), 3.57 (d,J=13.9 Hz, 2H), 2.87 (s, 3H), 2.86-2.78 (m, 2H), 2.17 (s, 2H), 1.90 (d,J=38.7 Hz, 4H), 1.65 (s, 3H), 1.46 (d,J=11.4 Hz, 1H), 0.93 (s, 3H)。

1.2.8 PF-06873600的制備

反應(yīng)瓶A：將叔丁醇鉀(6.8 g，60.3 mmol)和CuCl(3 g，30.1 mmol)溶于DMF(36 mL)中，30 ℃攪拌15 min；隨后加入(二氟甲基)三甲基硅烷(7.5 g，60.3 mmol)，30 ℃攪拌30 min；加入K-7(11 g，20.1 mmol)和丙二醇(2.3 g，16.1 mmol)的DMF(30 mL)溶液，于30 ℃攪拌16 h。

反應(yīng)瓶B: 將叔丁醇鉀(6.8 g，60.3 mmol)和CuCl(3 g，30.1 mmol)溶于DMF(28 mL)中，30 ℃攪拌15 min；隨后加入(二氟甲基)三甲基硅烷(7.5 g，60.3 mmol)，30 ℃攪拌30 min。

將反應(yīng)瓶B的混合溶液加入反應(yīng)瓶A中，30 ℃ 攪拌20～72 h，TLC監(jiān)測反應(yīng)完成。反應(yīng)液用2-甲基四氫呋喃(100 mL)轉(zhuǎn)移至裝有飽和氯化銨水溶液(60 mL)和35%氯化鎂水溶液(60 mL)的反應(yīng)瓶中，室溫下攪拌30 min后分液，水相用 2-甲基四氫呋喃(60 mL)萃取一遍，合并有機(jī)相。有機(jī)相中加入丙酮(60 mL)后依次用飽和氯化銨水溶液(60 mL)和水(60 mL)洗兩遍；混合溶液經(jīng)硅藻土過濾得濾液，濾液減壓濃縮和重結(jié)晶后得到白色固體，即PF-06873600(8.4 g)，收率為89%。MS-ESI, m/z：470.2[M-H]-。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：8.80-8.75 (m, 1H), 8.21 (s, 1H), 8.09-7.97 (brs, 1H), 7.01-6.74 (m, 1H), 5.85(brs, 1H), 4.41-3.90 (m, 2H), 3.58-3.41 (m, 6H), 2.84 (s, 3H), 2.35-2.33 (m, 2H), 2.19-1.49 (m, 7H), 1.04 (s, 3H)。

2 結(jié)果與討論

2.1 起始原料的替換

以廉價(jià)易得的1-甲基環(huán)戊烯為起始原料，經(jīng)一步反應(yīng)即可得到較為昂貴的原研路線起始原料1-甲基-6-氧雜雙環(huán)[3，1，0]己烷，且該步反應(yīng)收率高達(dá)95%，這一變更極大地降低了合成成本。

2.2 重要中間體原料的替換

在合成吡啶并嘧啶母核結(jié)構(gòu)時(shí)，原研路線使用了較為昂貴的原料(4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-基)甲醇，本工藝路線中改用廉價(jià)的5-溴-2，4-二氯嘧啶，經(jīng)三步反應(yīng)即可得到關(guān)鍵中間體9(K-6)，關(guān)鍵中間體9(K-6)的合成路線及收率見表1，由表1數(shù)據(jù)可以看出，本工藝路線較原研路線縮短了一步且收率提升至36.2%。

表1 關(guān)鍵中間體9(K-6)的合成路線及收率

2.3 中間體K-6的后處理優(yōu)化

對(duì)中間體K-6進(jìn)行后處理，發(fā)現(xiàn)K-6在正庚烷/乙酸乙酯的混合溶液體系中溶解性不佳，通過實(shí)驗(yàn)尋找最佳的二元溶劑配比(表2)。由表2可以看出，當(dāng)正庚烷∶乙酸乙酯=10∶1時(shí)，K-6的純度及收率達(dá)到最大值，因此在后處理時(shí)，選擇正庚烷∶乙酸乙酯=10∶1作為打漿溶劑。

表2 不同比例的二元溶劑打漿對(duì)K-6純度與收率的影響

3 結(jié)論

本文改進(jìn)了PF-06873600的合成路線，用1-甲基環(huán)戊烯代替昂貴的1-甲基-6-氧雜雙環(huán)[3，1，0]己烷作為起始原料，經(jīng)還原、手性氨基酸的拆分、脫保護(hù)基和取代得到K-3，同時(shí)用5-溴-2，4-二氯嘧啶替代了4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-基)甲醇，進(jìn)一步降低了合成成本。中間體K-3經(jīng)取代、Heck反應(yīng)完成吡啶并嘧啶母核結(jié)構(gòu)的合成，縮短反應(yīng)步驟的同時(shí)也提高了收率。最后，關(guān)鍵中間體K-6經(jīng)碘化和二氟甲基銅配合物得到目標(biāo)化合物PF-06873600，純度為98.5%。改進(jìn)后的工藝路線總收率為12.4%。該方法使用的原材料簡單易得、后處理操作簡便，產(chǎn)物純化多采用打漿重結(jié)晶，避免柱層析分離，便于放大生產(chǎn)，同時(shí)也為PF-06873600及其衍生物的合成提供參考。