低溫脅迫下兩種不同形態(tài)群體擬穴青蟹轉(zhuǎn)錄組分析

陳 潔 董 夢 崔 悅 房翠蓮 陳旭堂 劉子明

(1. 麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院, 麗水 323000; 2. 麗水市生態(tài)經(jīng)濟(jì)研究所, 麗水 323000)

擬穴青蟹(Scylla paramamosain)屬于甲殼綱、梭子蟹科、青蟹屬, 主要分布于我國東南沿海海域,是青蟹屬的優(yōu)勢種[1—3]?！膀阃蠊?jié)外緣中部發(fā)達(dá)刺的有無”是鑒定青蟹屬不同種的主要分類特征之一。對福建漳州擬穴青蟹進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析, 發(fā)現(xiàn)擬穴青蟹大多數(shù)個(gè)體(80%左右)一對螯足腕節(jié)外緣中部都不具有發(fā)達(dá)的刺, 少數(shù)個(gè)體具有發(fā)達(dá)的刺[4]。于是, 將“一對螯足腕節(jié)外緣中部都不具有發(fā)達(dá)的刺”和“至少一只螯足腕節(jié)外緣中部具有發(fā)達(dá)的刺”的擬穴青蟹分別定義為Sp1和Sp2群體。通過研究上述兩個(gè)形態(tài)群體擬穴青蟹鰓、肝胰腺和肌肉線粒體呼吸速率的季節(jié)變化, 發(fā)現(xiàn)Sp1和Sp2群體線粒體呼吸代謝的季節(jié)變化存在差異, 其中冬季差異最為顯著[5]。

至今, 有關(guān)溫度對擬穴青蟹的生物學(xué)效應(yīng)已有不少的研究報(bào)道。Kong等[6]的研究結(jié)果表明, 冬季青蟹鰓超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性顯著低于春、夏和秋季, 且低溫馴化會(huì)降低擬穴青蟹肌肉SOD、CAT和GPX活性[7], 由此說明在低溫條件下青蟹代謝水平降低, 活性氧生成減少進(jìn)而引起抗氧化酶活性的下降。近年來, 熱休克蛋白(HSPs)成為研究生物受溫度脅迫的一大熱點(diǎn)[8—10]。目前擬穴青蟹hsp90[11]、hsp70[12]、hsp60[13]和hsp10[14]等熱休克蛋白基因已被克隆, 初步的研究結(jié)果表明擬穴青蟹hsp70、hsp60和hsp10表達(dá)對溫度變化十分靈敏。

上述這些研究主要從個(gè)體水平考察溫度對擬穴青蟹的影響, 在群體水平上探索溫度脅迫對擬穴青蟹生物學(xué)效應(yīng)的報(bào)道很少。本研究以Sp1和Sp2兩種形態(tài)群體擬穴青蟹為研究對象, 通過轉(zhuǎn)錄組測序分析, 篩選低溫脅迫下差異表達(dá)基因, 將初步揭示擬穴青蟹不同形態(tài)群體對低溫脅迫的適應(yīng)性差異。這項(xiàng)工作的開展將有利于擬穴青蟹耐寒優(yōu)質(zhì)品種的選育及其種質(zhì)資源的保護(hù)。

1 材料與方法

1.1 擬穴青蟹樣品采集與處理

擬穴青蟹采樣于廣東省汕頭海域(緯度約23°22′N)。采集到的擬穴青蟹活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室, 按照本課題組建立的方法[4]篩選出Sp1和Sp2個(gè)體。Sp1和Sp2個(gè)體的殼寬平均值分別為 (12.56±1.37)和(12.28±1.85) cm, 雌雄比例為1﹕1。選取大小相似、肢體完整、體表無菌斑的個(gè)體暫養(yǎng)于200 L的培養(yǎng)箱中, 內(nèi)含150 L沙濾海水, 鹽度22, 溫度20℃, 暫養(yǎng)期間不投喂飼料, 暫養(yǎng)3d。擬穴青蟹Sp1和Sp2群體, 每個(gè)群體48只, 設(shè)置低溫脅迫組(8.0±0.5)℃和對照組(20.0±0.5)℃, 每組設(shè)置3個(gè)平行組(每組每個(gè)群體8只), 分別放于6個(gè)培養(yǎng)箱中。6h后取肝胰腺, 液氮速凍, 隨后存放于–80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序

利用Trizol(生工, 中國)提取擬穴青蟹肝胰腺總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳和 NanoDrop 2000(Thermo,美國)檢測總RNA質(zhì)量和濃度。將檢測合格的總RNA送杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司測序。采用mRNASeq sample preparation kit(Illumina, 美國)構(gòu)建cDNA文庫, 利用IlluminaHiseq4000高通量平臺(tái)(LC Sciences, 美國), 通過Paired-end 300 bp雙末端測序模式對12個(gè)樣本進(jìn)行測序。

1.3 序列組裝和基因注釋

將原始序列中低質(zhì)量、帶接頭和N比例大于10%的序列去除后, 利用Trinity 2.4.0軟件進(jìn)行無參拼接, 將拼接得到的最長序列作為基因的參考序列(Unigene)[15]。使用BUSCO(v5.1.2)軟件對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行完整性評估。隨后用DIAMOND軟件將Unigene分別與NCBI NR(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、eggNOG(http://eggnogdb.embl.de/)、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)、Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)、GO(http://www.geneontology.org/)和Swiss-prot(http://www.expasy.ch/sprot/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對和注釋。

1.4 基因差異表達(dá)分析

基因表達(dá)量采用TPM(Transcripts Per Million)方法計(jì)算[16]。差異表達(dá)基因采用edgeR[17]軟件包篩選, 篩選閾值為log2(fold change)>1和FDR<0.05。差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析分別利用GOseq R和KOBAS軟件包進(jìn)行(FDR<0.05)[18,19]。

1.5 熒光定量PCR

選取上調(diào)和下調(diào)基因各5個(gè)。用TRIzol抽提樣本總RNA, 利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa, 日本)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。使用BioRad CFX96 Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(BioRad, 美國)進(jìn)行qPCR, 反應(yīng)體系為: SYBR Premix ExTaq(2×)緩沖液(TaKaRa)12.5 μL, cDNA模板0.5 μL, 引物(10 μmol/L)各1 μL,以ddH2O補(bǔ)足至25 μ L。反應(yīng)程序?yàn)? 94℃預(yù)變性5min; 95℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 30s, 40個(gè)循環(huán)。qPCR檢測結(jié)果使用2–ΔΔCt方法分析[20]。以18S rRNA作為內(nèi)參基因, 所用引物見表 1, 引物的擴(kuò)增效率根據(jù)熒光定量PCR的MIQE指南, 使用 cDNA樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定, 引物的特異性根據(jù)熔解曲線分析確定。每組每個(gè)群體4個(gè)樣品, 每個(gè)樣品技術(shù)重復(fù)4次。

表1 引物序列Tab. 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 測序和組裝結(jié)果

低溫脅迫組和對照組2個(gè)群體各取3個(gè)肝胰腺經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組測序、原始數(shù)據(jù)過濾后共計(jì)獲得66.00 Gb有效數(shù)據(jù)(表 2)。有效數(shù)據(jù)已上傳至NCBI Sequence Read Archive (SRA)數(shù)據(jù)庫(登錄號(hào): PRJNA 743858)。Trinity組裝去冗余后獲得81853個(gè)Unigene。Unigene序列長度在201—17151 bp, 平均長度為420 bp,N50為1460 bp。BUSCO分析顯示,C值(Complete)為917占比90.5%, 其中S值(Complete and single-copy)544,D值(Complete and duplicated)373, 分別占比53.7%和36.8%, 說明拼接的轉(zhuǎn)錄組完整性較好。

表2 不同形態(tài)群體擬穴青蟹肝胰腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)Tab. 2 Hepatopancreatic transcriptome data of Scylla paramamosain with different morphological populations

2.2 轉(zhuǎn)錄組序列功能注釋

本次轉(zhuǎn)錄組測序共計(jì)獲得81853個(gè)Unigene, 將Unigene分別與NR、Pfam、Swissprot、eggNOG、GO和KEEG數(shù)據(jù)庫比對, 其中比對到NR數(shù)據(jù)庫的基因數(shù)最多為18278, 注釋率為22.33%; 比對到swissprot庫的基因數(shù)最少為12556, 注釋率為15.34%(表 3)。GO分析結(jié)果顯示, 共有13951個(gè)Unigene得到注釋。總共匹配到50個(gè)GO類, 歸為3大類, 分別是生物進(jìn)程(25類, 50.00%)、細(xì)胞組分(15類, 30.00%)和分子功能(10類, 20.00%), 其中富集在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核等細(xì)胞組分的基因數(shù)最多。有12848條Unigene注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫, 分屬于40個(gè)代謝通路, 歸為6大類。其中注釋序列數(shù)量較多的代謝途徑分別為運(yùn)輸和分解代謝; 翻譯、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo); 折疊、分選和降解和糖代謝等。

表3 DIAMOND注釋結(jié)果Tab. 3 DIAMOND annotation results

2.3 差異表達(dá)基因篩選

采用edgeR分析發(fā)現(xiàn)Sp1群體在低溫脅迫下共有15773個(gè)差異表達(dá)基因, 其中上調(diào)145個(gè), 下調(diào)15628個(gè)(圖 1A); Sp2群體在低溫脅迫下共有323個(gè)差異表達(dá)基因, 其中上調(diào)114個(gè), 下調(diào)209個(gè)(圖 1B)。

圖1 低溫脅迫下不同形態(tài)群體擬穴青蟹肝胰腺基因表達(dá)差異火山圖Fig. 1 The ‘volcano plot’ picture of differentially expressed genes of Scylla paramamosain with different morphological populations under cold challenge

依據(jù)FDR值越小, 差異越顯著的原則, 從兩種形態(tài)擬穴青蟹在低溫脅迫下差異表達(dá)基因中篩選到差異表達(dá)最顯著的基因各10個(gè)(表 4)。

2.4 差異基因GO和KEGG通路富集分析

對所有差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集和KEGG通路分析, 以獲得其潛在的功能注釋。Sp1群體在低溫脅迫下差異表達(dá)基因在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、RNA結(jié)合、核糖體結(jié)構(gòu)組分和翻譯等富集量較高(圖 2A);Sp2群體在低溫脅迫下差異表達(dá)基因在甾體羥化酶活性、DNA整合和碳酸氫鹽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性等富集較多(圖 2B)。

圖2 差異表達(dá)基因的GO富集分布散點(diǎn)圖Fig. 2 GO enrichment results of differentially expressed genes

對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析, 結(jié)果顯示, Sp1群體在低溫脅迫下差異表達(dá)基因在核糖體、剪接體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工等信號(hào)通路富集較多(圖 3A), 而Sp2群體在低溫脅迫下差異表達(dá)基因在賴氨酸降解、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝、精氨酸和脯氨酸的代謝等代謝通路富集較多(圖 3B)。

圖3 差異表達(dá)基因的KEEG富集分布散點(diǎn)圖Fig. 3 KEGG enrichment results of differentially expressed genes

2.5 差異表達(dá)基因RT-qPCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性, 從表 4中挑選了5個(gè)上調(diào)基因和5個(gè)下調(diào)基因。如圖 4所示,轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析結(jié)果和熒光定量PCR結(jié)果基本一致, 表明本研究轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果是可靠的。

圖4 RT-qPCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因Fig. 4 Validation of differentially expressed genes by RT-qPCR

表4 低溫脅迫下兩種不同形態(tài)群體擬穴青蟹差異表達(dá)最顯著的前10個(gè)基因Tab. 4 The top 10 differentially expressed genes of Scylla paramamosain with different morphological populations under cold challenge

3 討論

肝胰腺作為甲殼動(dòng)物重要的組成部分, 具有消化吸收、解毒、清除氧自由基和免疫防護(hù)等功能[21,22]。前期研究已明確溫度脅迫可影響擬穴青蟹肝胰腺的膜脂肪酸組成、線粒體呼吸速率、線粒體酶活性、抗氧化酶活性和熱休克蛋白表達(dá)等[4,23,24]。因此本研究以擬穴青蟹肝胰腺為材料, 通過轉(zhuǎn)錄組測序分析比較Sp1和Sp2群體在低溫脅迫下轉(zhuǎn)錄水平的差異。測序共獲得81853條Unigene, 其中22.33%為已知基因, 這在一定程度上豐富了擬穴青蟹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。

變溫動(dòng)物在應(yīng)對低溫時(shí), 通常通過溫度補(bǔ)償機(jī)制來提高代謝速率, 以維持正常生命活動(dòng)。但當(dāng)環(huán)境溫度劇烈變化時(shí), 一些變溫動(dòng)物則會(huì)停止代謝進(jìn)入休眠狀態(tài), 以度過惡劣的環(huán)境[25―27]。水溫從20℃驟降至8℃, 在Sp2群體擬穴青蟹肝胰腺中檢測到

323個(gè)Unigene顯著差異表達(dá), 其中上調(diào)114個(gè), 下調(diào)209個(gè)。這些Unigene在甾體羥化酶活性、DNA整合和碳酸氫鹽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性等GO富集較多, 并進(jìn)一步富集在賴氨酸降解、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝、精氨酸和脯氨酸的代謝等代謝通路。水溫從24℃緩慢降至18℃(每天降溫2℃), 凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)肝胰腺的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果同樣表明低溫脅迫下差異表達(dá)基因富集在氨基酸的生物合成途徑以及精氨酸和脯氨酸的代謝中[28]。凡納濱對蝦3個(gè)家系的差異表達(dá)Unigene分別為1973、1677和687個(gè)[28], 多于經(jīng)歷水溫驟降12℃的擬穴青蟹Sp2群體, 由此推測Sp2群體的擬穴青蟹對水溫快速下降的代謝響應(yīng)相對遲緩。

對于Sp1群體, 差異表達(dá)基因篩選的結(jié)果顯示低溫脅迫下共有15773個(gè)Unigene顯著差異表達(dá)。廣溫性草魚(Ctenopharyngodon idellus)從27℃水溫緩慢降至12℃和4℃, 腦轉(zhuǎn)錄組測序分別檢測到1273和1987個(gè)差異表達(dá)Unigene[29]。對低溫敏感的熱帶魚虎皮魚(Puntius tetrazona)從27℃水溫驟降至13℃, 腦、鰓和肝臟轉(zhuǎn)錄組測序分別檢測到10272、7771和4632個(gè)差異表達(dá)Unigene[30]。由此可看出,面對水溫驟降, 擬穴青蟹Sp1群體的代謝響應(yīng)遠(yuǎn)比Sp2群體敏感。Sp1群體肝胰腺下調(diào)表達(dá)的Unigene在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、RNA結(jié)合、核糖體結(jié)構(gòu)組分和翻譯等GO富集量較高, 并進(jìn)一步富集在核糖體、剪接體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工等信號(hào)通路, 這說明Sp1群體擬穴青蟹蛋白質(zhì)合成加工過程大幅度減弱。

面對不利環(huán)境, Sp1群體擬穴青蟹能快速地降低生理活動(dòng), 減緩低溫對機(jī)體的損傷, 而Sp2群體擬穴青蟹在應(yīng)對低溫時(shí), 僅調(diào)整了物質(zhì)代謝, 這可能使得Sp2群體在應(yīng)對低溫時(shí)機(jī)體更容易受到傷害,甚至導(dǎo)致死亡現(xiàn)象的發(fā)生。在早期的研究中, 我們調(diào)研了福建漳州海區(qū)的Sp1和Sp2群體, 其中Sp1群體的數(shù)量是Sp2群體數(shù)量的3倍多, 這可能與兩個(gè)群體對溫度變化存在適應(yīng)差異有關(guān)。在本研究的基礎(chǔ)上, 我們將進(jìn)一步挖掘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)同時(shí)結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)分析尋找其他低溫脅迫適應(yīng)性指標(biāo)來進(jìn)一步揭示Sp1和Sp2群體對溫度的適應(yīng)差異。