伯氏肩孔南極魚dusp1基因在冷應(yīng)激中的功能研究

王 映 胡玲紅 王化敏 陳良標(biāo) ,

(1. 上海海洋大學(xué)國家海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室, 上海 201306; 3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心, 上海 201306)

對于水生生物而言, 水溫是物種生存范圍限制的主要決定因素之一[1]。對于魚類而言, 魚的體溫取決于外部水環(huán)境的變化。溫度是其行為, 生理和分子過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素[2]。當(dāng)溫度下降到生存范圍的極限時, 會影響其呼吸系統(tǒng)和生理行為[3,4]。極低的溫度會直接導(dǎo)致魚類死亡, 這給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此, 探究魚類低溫耐受性的分子機制對于漁業(yè)發(fā)展和科學(xué)研究都具有重要的意義。

盡管許多研究表明, 魚類可以通過廣泛的生化、代謝和生理調(diào)節(jié)逐步建立寒冷的適應(yīng)性表型[5,6]。例如產(chǎn)生特定溫度的同工酶[6], 改變膜脂質(zhì)的含量和不飽和脂肪酸的水平[7], 合成分子伴侶[8], 改變線粒體的密度及其特性等[9]。 然而, 這需要經(jīng)過漫長的適應(yīng)演變過程。隨著轉(zhuǎn)錄組和基因組學(xué)在魚類物種中的應(yīng)用, 一些南極魚類的抗寒基因被相繼報道, 如Yang等[10]發(fā)現(xiàn)將南極魚(Lycodichthys dearborni)的Ⅲ型抗凍蛋白(AFP Ⅲ)四聚體導(dǎo)入煙草中能提高煙草的抗寒性能。將鱗頭犬牙南極魚(Dissostichus mawsoni)的CaM基因在斑馬魚(Danio rerio)胚胎成纖維ZF4細胞中過表達后能夠顯著提高細胞的抗寒能力[11], 將D. mawsoni的ZPC5基因在斑馬魚胚胎中過表達后能提高胚胎的低溫耐受性[12], 這表明南極魚在適應(yīng)低溫環(huán)境的過程中進化出了一些新基因用于抵抗極限低溫的侵襲。

Dusp1是一種雙特異性蛋白磷酸酶, 可對3個主要MAPK亞家族成員(MAPK/JNK, MAPK/p38和MAPK/ERK)中的蘇氨酸和酪氨酸殘基進行去磷酸化[13]。Hu等[14]研究發(fā)現(xiàn), 低溫脅迫誘導(dǎo)了羅非魚(Oreochromis niloticus)和斑馬魚(D. rerio)鰓中dusp1的大量表達, 這提示我們dusp1可能參與了魚類的低溫抵抗性能。將斑馬魚細胞中的dusp1基因進行敲降后, 發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下dusp1敲降的細胞凋亡比對照組顯著增多[15], 這表明dusp1參與了魚類冷應(yīng)激過程, 并在低溫情況下對細胞有保護功能,但其具體的分子機制并不清楚。

伯氏肩孔南極魚(Trematomus bernacchii)是南極魚亞目南極魚科的一種魚類, 長期生活在溫度極低的南極地區(qū), 是進行低溫適應(yīng)性進化研究的良好樣本。此外, 鑒于先前研究報道dusp1對低溫下斑馬魚細胞和胚胎具有應(yīng)激保護作用, 并且通過比對斑馬魚和南極魚dusp1基因序列發(fā)現(xiàn)其高度相似,因此我們推測生活在南極的伯氏肩孔南極魚dusp1基因在寒冷應(yīng)激方面可能會發(fā)揮一定作用。因此,在本研究中, 通過對伯氏肩孔南極魚dusp1編碼區(qū)的克隆, 并將其構(gòu)建到真核表達載體中, 在293T細胞中過表達后, 通過低溫脅迫實驗檢測了dusp1基因過表達的細胞與對照組細胞的ROS含量變化和細胞凋亡情況, 同時探究了其相關(guān)的分子機制, 揭示了伯氏肩孔南極魚dusp1基因在抗寒中的功能,為進一步探究冷脅迫下硬骨魚類dusp1的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所采用的伯氏肩孔南極魚是從南極中山站的海冰中鉆孔垂釣所得, 將其保存在?80℃冰箱中運回實驗室后直至使用。

1.2 南極魚dusp1基因的克隆及真核表達載體的構(gòu)建

使用TRIzol (Invitrogen, 美國)試劑, 根據(jù)說明書操作從伯氏肩孔南極魚的肌肉組織中提取總RNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性,采用分光光度計Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific, 美國)對RNA濃度和質(zhì)量進行檢測。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa, 日本)按照說明書操作進行cDNA第一鏈的合成。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中伯氏肩孔南極魚dusp1基因(GenBank登錄號:XM_034121366.1)的編碼序列設(shè)計特異性引物dusp11F和dusp1R1(表 1)進行目的基因的擴增, 隨后將目的基因的PCR產(chǎn)物純化后連接到pEASY?-T5 Zero克隆載體(Transgen, 北京), 轉(zhuǎn)化至Trans1-T1(Transgen, 北京)感受態(tài)細胞中, 將陽性單克隆擴大培養(yǎng)后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序驗證。

以測序正確的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增dusp1基因的編碼序列(Coding sequence, CDS), 由于缺乏特異性抗體我們通過在終止密碼子之前加上一段商業(yè)化的HIS標(biāo)簽(表 1), 之后進行PCR擴增,隨后將目的條帶采用膠回收試劑盒(Omega, 美國)進行切膠回收純化, 利用In-Fusion?HD Cloning試劑盒(TaKaRa, 日本), 與實驗室保存的真核表達載體pcDNA3.1(+)根據(jù)說明書操作步驟進行無縫克隆連接, 所用的無縫克隆引物列于表 1中。隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans-T1 (Transgen, 北京)感受態(tài)細胞中, 經(jīng)涂板、菌落PCR驗證、測序和陽性克隆擴大培養(yǎng)后, 使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(Promega, 美國)提取質(zhì)粒, 用于細胞轉(zhuǎn)染。

表1 本研究所用引物Tab. 1 Primers for this study

1.3 293T細胞系的轉(zhuǎn)染、蛋白表達和亞細胞定位分析

將293T細胞置于含10%胎牛血清(Gibco, 美國)和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone, 美國)中,放置在溫度為37℃, 二氧化碳濃度為5%, 95%濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞的匯合度達到70%—80%時, 采用TurboFect轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher Scientific, 美國)根據(jù)說明書操作進行空載質(zhì)粒和pcDNA3.1-dusp1載體的轉(zhuǎn)染。為了檢測DUSP1蛋白和磷酸化p38蛋白的表達情況進行了Western Blot分析, 收集轉(zhuǎn)染后48h的細胞用于DUSP1蛋白的表達分析, 隨后收集低溫脅迫下實驗組和對照組的細胞進行磷酸化p38蛋白分析, 采用PBS洗滌兩次后加入RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)收集細胞總蛋白, 采用BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific, 美國)測定蛋白濃度, 之后將對照組和實驗組蛋白各取30 μg進行Western Blot檢測, 所用一抗為鼠抗HIS抗體(華安, 杭州)和p-p38抗體(華安,杭州), 二抗為HRP標(biāo)記的羊抗小鼠抗體(華安,杭州)。

將轉(zhuǎn)染后的細胞在37℃最適生長溫度培養(yǎng)24h后采用免疫熒光技術(shù)檢測蛋白在細胞中的定位情況, 具體操作為將生長于6孔板中的細胞在室溫下用4%多聚甲醛固定30min。用PBS洗滌2次后, 采用通透封閉緩沖液(0.1%Triton X-100, 1%BSA)封閉30min。然后, 將實驗組和對照組中的細胞與針對HIS(1﹕100)的商業(yè)單克隆抗體(Abcam, 英國)一起于37℃孵育1h。以10min的間隔用PBS洗滌細胞2次, 隨后與GFP-Alexa 488 偶聯(lián)的羊抗小鼠(Invitrogen, 美國)二抗在室溫下孵育1h。采用PBS洗滌細胞兩次各5min, 用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI, Sigma,美國)進行細胞核染色5min, 水洗3次, 每次5min, 最后采用倒置熒光顯微鏡(Carl Zeiss, 德國)觀察熒光在細胞中的分布情況并拍照。

1.4 293T細胞低溫處理形態(tài)觀察和ROS檢測

將轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和dusp1重組質(zhì)粒的細胞進行18℃/10h、18℃/15h、13℃/10h和13℃/15h的低溫脅迫處理后, 采用倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)并拍照。隨后吸棄培養(yǎng)基, 并用PBS輕輕清洗細胞,吸棄PBS后, 加入1 mL濃度為20 μmol/L的采用不含血清的培養(yǎng)基稀釋的ROS熒光探針DCFH-DA工作液。隨后將細胞放回相應(yīng)處理溫度的培養(yǎng)箱中避光孵育30min, 收集細胞至棕色避光管中并用PBS洗滌2次后每孔加入500 μL不含血清的培養(yǎng)基重懸細胞, 采用流式細胞儀(BD Accuri C6, 美國)上機檢測。實驗組和對照組均設(shè)置3個重復(fù)孔, 并進行3次生物學(xué)實驗重復(fù)。

1.5 細胞凋亡檢測

將轉(zhuǎn)染24h后的細胞吸棄培養(yǎng)基后, 加入預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次, 隨后加入0.25%的胰酶(不含EDTA)消化, 消化時間不宜過長, 看到細胞收縮變圓即可加入培養(yǎng)基終止以防止假陽性。800 r/min離心5min后棄掉上清, 加入預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次, 加入100 μL1×Binding Buffer到含有1×105—5×105個細胞的棕色避光管中, 加入5 μL購買于碧云天公司的碘化丙啶(Propidium iodide, PI)染色試劑室溫下避光染色10min, 后加入400 μL1×Binding Buffer, 采用流式細胞儀(BD Accuri C6, 美國)檢測細胞凋亡情況。

1.6 細胞RNA的提取和caspase-3的定量PCR檢測

采用TRIzol (Invitrogen, 美國)試劑, 提取各組細胞的RNA, 采用上述方法經(jīng)過質(zhì)檢和濃度測定后, 使用Prime Script RT試劑盒(TaKaRa, 日本), 將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。使用FastStart Universal SYBR Green Master Kit(Roche, 瑞士)和Light-Cycler480(Roche, 瑞士)進行qPCR分析, 以β-actin為參考基因(表 1), 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中caspase-3基因的所有轉(zhuǎn)錄本共有區(qū)域設(shè)計特異性引物(表 1),通過Pfaff[16]描述的方法定量基因的表達。

1.7 基因序列分析

通過ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測dusp1的開放閱讀框及編碼的氨基酸序列; 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量, 理論等電點, 不穩(wěn)定系數(shù),脂肪系數(shù)和親水性系數(shù)使用protparam(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測; 使用NCBI的BLASTP程序搜索不同物種的dusp1同源基因序列。采用Mega7.0軟件和DNAMAN軟件對伯氏肩孔南極魚和其他物種的dusp1基因進行同源性比對分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。用GraphPad Prism 8軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)及作圖, 當(dāng)P＜0.05時認為差異顯著(以*表示), 當(dāng)P＜0.01時認為差異極顯著(以**表示)。

2 結(jié)果

2.1 伯式肩孔南極魚dusp1基因的序列分析及同源比對

伯式肩孔南極魚dusp1基因的開放閱讀框為1128 bp, 編碼376個氨基酸殘基。通過protparam在線軟件分析伯氏肩孔南極魚dusp1基因的氨基酸序列發(fā)現(xiàn), 其理論等電點為7.52, 不穩(wěn)定系數(shù)為57.62,脂肪系數(shù)為87.90, 親水性系數(shù)為–0.012, 表明其為親水性蛋白。通過多物種的氨基酸序列比對顯示,伯氏肩孔南極魚與人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的對應(yīng)物分別享有72.55%和70.92%的氨基酸相似性, 與青鳉(Oryzias latipes)和斑馬魚(D.rerio)享有88.15%和82.69%的同源性, 與斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)、紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)、尼羅羅非魚(O. niloticus)和虹鱒(Oncorhynchus mykiss)分別享有93.94%、91.22%、90.69%和86.28%的序列相似性, 這表明dusp1基因在哺乳類和魚類中都具有序列的高度保守性。此外, 對其蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn), 第67至第69位氨基酸為其核定位信號序列(Nuclear localization sequence,NLS: aa 67—69), 在其氨基酸272—277位的催化域中包含一個必需的半胱氨酸殘基(Cys272), 這在人、小鼠及其他比對的魚類中都是相同的, 預(yù)示著該半胱酸殘基對于DUSP1結(jié)構(gòu)保持的重要性。

2.2 載體構(gòu)建、蛋白表達及細胞定位分析

以pcDNA3.1(+)質(zhì)粒為骨架構(gòu)建了表達南極魚dusp1基因的真核表達載體(圖 1A), 分別將空載質(zhì)粒和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后, 通過免疫熒光檢測了蛋白的分布情況, 發(fā)現(xiàn)綠色熒光信號分布在細胞核中, 之后采用細胞計數(shù)方法統(tǒng)計轉(zhuǎn)染效率約為80%, 而在對照組中未觀察到熒光信號(圖 1B)。為了驗證dusp1基因在細胞中的蛋白表達情況, 分別收集了對照組和實驗組細胞的總蛋白進行Western Blot分析, 結(jié)果顯示, 在41 kD處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶, 但在轉(zhuǎn)染空載的細胞中未檢測到 (圖 1C)。這表明, 伯氏肩孔南極魚dusp1基因在293T細胞中成功地進行了表達, 可進行下一步的功能驗證。

圖1 dusp1的載體構(gòu)建和蛋白表達分布Fig. 1 Vector construction and the distribution of dusp1 protein expression in cells

2.3 細胞形態(tài)學(xué)觀察

為探索伯氏肩孔南極魚dusp1基因在低溫下發(fā)揮的功能, 在轉(zhuǎn)染細胞后24h將過表達dusp1組細胞和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組細胞放入18℃和13℃低溫培養(yǎng)箱中分別處理10h和15h后對細胞形態(tài)進行觀察, 結(jié)果表明(圖 2), 空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞在18℃/10h后出現(xiàn)皺縮, 細胞呈梭形分布, 少量細胞開始變圓, 細胞觸角數(shù)量減少, 而過表達dusp1組僅有少量細胞出現(xiàn)輕微皺縮。在18℃/15h后轉(zhuǎn)染空載組中有大量細胞變圓, 細胞觸角大量收縮, 細胞聚攏成團, 而轉(zhuǎn)染dusp1組僅有少量細胞皺縮變圓, 仍有大量細胞觸角分布。在13℃/10h后轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組細胞均變圓呈斑塊狀聚集, 少量細胞死亡并從皿底脫落,過表達dusp1組細胞此時開始變圓, 在皿底仍分布有少量細胞觸角, 在13℃/15h后轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組細胞碎裂, 大量細胞死亡并從皿底脫落, 轉(zhuǎn)染dusp1組細胞此時開始出現(xiàn)斑塊狀聚集, 僅有少量細胞死亡。以上結(jié)果表明南極魚dusp1的過表達能夠減輕低溫脅迫對細胞形態(tài)的損傷, 對于維持細胞形態(tài)完整具有重要作用。

圖2 不同溫度處理下細胞形態(tài)學(xué)分析Fig. 2 Cell morphological analysis at different treatment temperatures

2.4 ROS檢測

ROS在低溫誘導(dǎo)的細胞凋亡中起著關(guān)鍵作用。采用熒光探針DCFH-DA對過表達dusp1組和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組細胞中的ROS進行了標(biāo)記, 并采用流式細胞儀對兩組細胞中ROS含量進行檢測發(fā)現(xiàn),在18℃/10h和18℃/15h處理后, 轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組細胞中ROS含量與過表達dusp1組相比分別上調(diào)了約2.9倍和1.7倍(圖 3B、3C和3F), 在13℃/10h和13℃/15h處理后, 轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組細胞中ROS含量比過表達dusp1組高約1.4和1.7倍(圖 3D、3E和3F), 這表明南極魚dusp1在細胞中的過表達可減輕低溫刺激下ROS的積累。

圖3 不同溫度處理下細胞ROS含量變化Fig. 3 Intracellular ROS detection of cells under different temperature conditions

2.5 細胞凋亡檢測

為檢測低溫脅迫下細胞的凋亡情況, 采用PI對細胞進行染色并用流式細胞儀檢測了細胞的凋亡率(圖 4), 在低溫18℃/10h和18℃/15h處理后, 轉(zhuǎn)染空載組細胞死亡率分別為(8.42±0.03)%和(16.8±2.15)%, 過表達dusp1組細胞死亡率分別為(2.29±0.03)%和(10.3±1.07)%, 在13℃/10h和13℃/15h處理后, 轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組細胞死亡率分別為(19.3±3.15)%和(25.3±3.78)%, 過表達dusp1組細胞死亡率分別為(16.4±2.21)%和(20.2±2.37)%。所有實驗組細胞凋亡率顯著低于對照組(P＜0. 05)。由以上結(jié)果可知過表達dusp1基因可顯著減少低溫下細胞的凋亡率。

圖4 不同溫度處理下細胞凋亡檢測Fig. 4 Cell apoptosis under different temperature conditions

2.6 相關(guān)凋亡基因表達情況檢測

ROS的過量產(chǎn)生會引起促凋亡基因p38的積累從而誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡, 而caspase-3是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行分子。我們通過Western Blot和RT-qPCR技術(shù)檢測了過表達dusp1組和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組細胞在低溫脅迫下p38的磷酸化水平和caspase-3的mRNA水平(圖 5)。結(jié)果表明, 在低溫脅迫后, 過表達dusp1組細胞中p38的磷酸化水平和caspase-3的mRNA水平顯著低于轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組, 這表明過表達dusp1能有效抑制促凋亡基因的表達,緩解細胞在低溫下的死亡進程。

圖5 p38磷酸化水平和caspase-3的mRNA表達水平檢測Fig. 5 The levels of phosphorylated p38 and the mRNA expression of caspase-3

3 討論

雙特異性磷酸酶(Dual-specificity phosphatase,dusp1)也稱作絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(Mitogen-activated protein kinase phosphatase-1, MKP-1)是一組既可以使酪氨酸殘基去磷酸化, 又可使絲氨酸/蘇氨酸殘基去磷酸的酶分子[17]。這些酶分子的結(jié)構(gòu)高度保守, 均包含非催化的N端結(jié)構(gòu)域和C端的催化結(jié)構(gòu)域。后者包含高度保守的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPase)活性位點序列(I/V)HCXAGXXR(S/T/G)。N端結(jié)構(gòu)域包含一個保守的模塊序列, 稱為激酶相互作用基序(KIM), 該序列介導(dǎo)MAPK底物的差異識別和結(jié)合, 并且還包含決定亞細胞定位的核定位(NLS)或輸出(NES)信號[18]。在本研究中,通過氨基酸序列相似性比對發(fā)現(xiàn)在第67至第69位氨基酸發(fā)現(xiàn)其核定位信號序列(RRR), 表明了dusp1定位于細胞核中, 這與我們的亞細胞定位分析結(jié)果一致。在人和小鼠的N端保守模塊中該序列組成為RRRAK, 其中位于第57位的賴氨酸殘基(Lys57)可被P300乙?；? 增強其與p38的相互作用,從而增加其磷酸酶活性并中斷MAPK信號傳導(dǎo)[19]。在本研究中, 伯氏肩孔南極魚dusp1在其N端的保守模塊序列為RRRAR, 將賴氨酸突變?yōu)榫彼?Arg,R), 但與人和小鼠相比, 均同為堿性氨基酸。因此,筆者推測其在魚類中的功能與哺乳動物類似, 該精氨酸也可能介導(dǎo)其與p38的相互作用從而影響MAPK信號傳導(dǎo)。此外, 在其氨基酸272-277位的催化域中包含一個必需的半胱氨酸殘基(Cys272), 這與人和小鼠相同[20]。所有這些證據(jù)都表明dusp1在人類、小鼠和魚類中都享有高度的保守性, 可能執(zhí)行相似的功能。

研究表明ROS是誘導(dǎo)細胞死亡的介質(zhì)之一, 在細胞死亡信號通路中扮演了重要角色。在自然界中, 植物在遭受低溫刺激時會導(dǎo)致ROS含量的大量積累[21]。在細胞中, Chen等[22]研究發(fā)現(xiàn), 冷刺激是導(dǎo)致宮頸癌細胞和斑馬魚ZF4細胞中ROS積累的主要因素。此外, Chen等[23]通過對生活在極限溫度下的南極魚轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)許多抑制ROS的基因大量上調(diào), 這表明在寒冷脅迫下ROS的積累是一種普遍現(xiàn)象。但ROS的過度積累則會造成細胞氧化應(yīng)激損傷, 進而引發(fā)細胞凋亡。在本研究中, 我們發(fā)現(xiàn)低溫刺激會導(dǎo)致對照組細胞中ROS的大量上調(diào),而在過表達伯氏肩孔南極魚dusp1的細胞中ROS含量顯著低于對照組, 細胞凋亡率也顯著減少, 這表明在低溫刺激下dusp1會減輕細胞中ROS的積累,并在長時間的低溫處理中有利于緩解細胞凋亡的發(fā)生, 延長細胞的存活時長。

絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)是一類中央信號分子, 由P38、ERK和JNK 三個亞家族組成, 可對多種刺激作出反應(yīng), 控制著不同的細胞過程, 包括增殖、細胞存活和細胞死亡[24]。據(jù)報道, 細胞中p38/MAPK或其上游激酶的活化可誘導(dǎo)凋亡, 而阻斷p38/MAPK的活化可防止多種細胞凋亡的發(fā)生[25—27]?；钚匝?ROS)可以激活p38, 從而觸發(fā)隨后的凋亡程序, 例如某些細胞中caspase蛋白酶家族的激活。Caspase蛋白酶家族包括10個以上的成員, 被認為是細胞凋亡的下游執(zhí)行者。其中,caspase-3被認為是蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)的重要組成部分, 并在凋亡過程中起著關(guān)鍵作用[28]。我們先前的研究表明低溫刺激會引發(fā)細胞內(nèi)ROS的積累進而誘導(dǎo)p38/MAPK的表達, 觸發(fā)細胞凋亡的發(fā)生[22]。在本研究中我們通過檢測對照組和實驗組細胞中p38的磷酸化水平,發(fā)現(xiàn)南極魚dusp1的過表達顯著降低了細胞中p38的磷酸化水平和caspase-3的表達。由于dusp1是一種特異性的使p38去磷酸化而失活的酶分子,因此, 我們認為在對照組細胞中由于低溫刺激導(dǎo)致了ROS的積累引起p38的過度激活加劇了細胞凋亡進程致使caspase-3過度活化。而在實驗組中dusp1的過表達可通過滅活過度活化的p38進而減緩低溫刺激下caspase-3的激活進程來緩解細胞凋亡的發(fā)生。

先前的研究表明對斑馬魚細胞進行dusp1基因敲降后, 在低溫脅迫下, 實驗組細胞凋亡顯著高于對照組[15], 這表明伯氏肩孔南極魚dusp1基因與斑馬魚dusp1基因在功能上有一定的保守性, 但其具體的分子調(diào)控機制并不清楚。本研究首次證明了dusp1通過P38/MAPK信號通路參與了魚類細胞冷應(yīng)激的調(diào)控, 為探究dusp1在低溫下調(diào)控細胞命運的分子機制提供了新的證據(jù)。

綜上所述, 本研究首次報道了伯氏肩孔南極魚dusp1基因在低溫應(yīng)激過程中可以緩解細胞受低溫侵襲的程度, 并且這種保護作用主要是通過抑制p38/MAPK的過度磷酸化實現(xiàn)的, 表明了伯氏肩孔南極魚的dusp1基因在抗寒功能中具有重要作用,為探究極地魚類低溫適應(yīng)性進化機制研究提供了新的證據(jù)同時也為進一步探究冷脅迫下硬骨魚類dusp1的功能奠定了基礎(chǔ)。