基于纖維素酶酶解對虎掌菌破壁工藝優(yōu)化

李澤林,王秋婷,桂海佳,谷大海,王雪峰,肖智超,王桂瑛,普岳紅,范江平

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,昆明 650201)

目前，菌類因其獨特的鮮美滋味(如野生菌與人工養(yǎng)殖菌)被國內(nèi)外越來越多地用于生產(chǎn)制作極具菌香風(fēng)味的調(diào)味料。郭磊等[1]以云南美味牛肝菌為基料研制了菌香調(diào)味料，并分析了其營養(yǎng)成分。清源[2]以新鮮塊菌為原材料對其護色以及酶解工藝進行了優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上研制出了獨具風(fēng)味的塊菌調(diào)味醬。Simanungkalit等[3]以平菇為材料研制了調(diào)味品并對其品質(zhì)的影響因素進行了分析。以菌類為基料研制的調(diào)味品不僅具有獨特的菌香味，而且還很大程度地保留了它們的營養(yǎng)成分，具有較大的研究前景。

虎掌菌又名棗翹鱗肉齒菌(Sarcodonimbricatus(L.)P.Karst.)，菌體一般呈黑褐色，以菌蓋有塊狀鱗片、形狀像虎爪而得名[4]?；⒄凭獯己穹枷闱衣詭Э辔叮扇胨?，已有研究證明其具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、增強免疫力等生物活性作用[5-6]。其含有豐富的礦質(zhì)元素，高蛋白、低脂肪并且含有多種人體必需的氨基酸，其與非必需氨基酸比例適宜，且含有一定濃度的呈味氨基酸，具備制作調(diào)味基料優(yōu)良的前提條件[7-9]。

但是，食用菌的細(xì)胞壁主要由葡聚糖、幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)、少部分木質(zhì)素和纖維素組成，與植物細(xì)胞壁不同[10]。食用菌的細(xì)胞壁對細(xì)胞有支撐的作用，如維持生長發(fā)育過程中細(xì)胞的形狀，為細(xì)胞抵御外界滲透壓、機械力提供保護，還可以保持細(xì)胞內(nèi)水分，防止野生菌組織衰老與軟化等[11-12]。另外，食用菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)可以聚合在一起形成聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而防止細(xì)胞內(nèi)成分流出[13]，可見細(xì)胞壁對食用菌的生長發(fā)育至關(guān)重要[14-15]，然而細(xì)胞壁的這些結(jié)構(gòu)導(dǎo)致在調(diào)味品研制的過程中風(fēng)味物質(zhì)的釋放受阻以及滋味物質(zhì)(如游離氨基酸、還原糖)的形成減少，從而影響調(diào)味品的最終口感。因此，在研制調(diào)味品的前期階段對食用菌進行破壁處理是關(guān)鍵且必要的。

所以，為了更好地協(xié)助釋放虎掌菌的菌香味物質(zhì)，本研究擬以虎掌菌為原材料并以還原糖含量為檢測指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計纖維素酶酶解對虎掌菌破壁工藝進行優(yōu)化，旨在為虎掌菌的風(fēng)味物質(zhì)釋放以及以虎掌菌為調(diào)味基料的調(diào)味品的深入研究提供試驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

虎掌菌：新鮮、無病蟲害及瑕疵，購于云南省易門縣，經(jīng)鼓風(fēng)干燥箱烘干，打粉機粉碎過60目篩后放置于干燥器中備用。

纖維素酶(食品級，50000 U/g)：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；3,5-二硝基水楊酸(分析純)：廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；氫氧化鈉(分析純)、丙三醇(分析純)、葡萄糖(分析純)：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PHS-3C型雷磁pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；JC-SY型電熱恒溫水浴鍋 上海成順儀器儀表有限公司；VYJG-9420型鼓風(fēng)干燥箱 杭州億捷科技有限公司；DXF-02C型打粉機 廣州大祥電子機械設(shè)備有限公司。

1.3 工藝流程

準(zhǔn)確稱取虎掌菌干粉→加水混勻→調(diào)節(jié)pH→加入纖維素酶→調(diào)節(jié)溫度→酶解→檢測還原糖含量。

操作要點：根據(jù)單因素試驗條件調(diào)節(jié)pH為4.5～6.0；調(diào)節(jié)溫度為選取水浴酶解溫度40～55 ℃，保證同一條件下溫度恒定。

1.4 單因素試驗

以還原糖含量為指標(biāo)，分別選取溫度(40，45，50，55 ℃)、時間(1，1.5，2，2.5 h)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)、酶添加量(0.3%、0.4%、0.5%、0.6%)、pH(4.5，5.0，5.5，6.0)進行單因素試驗。

1.5 響應(yīng)面設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，其因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素水平表

1.6 還原糖含量測定

參照時培寧等[16]和王莉麗等[17]的方法，以還原糖含量為指標(biāo)，采用DNS法測定纖維素酶對虎掌菌破壁的效果。

1.6.1 DNS試劑的配制

稱取3.25 g 3,5-二硝基水楊酸，加少量水溶解后，轉(zhuǎn)移至500 mL棕色容量瓶中，加入162.5 mL的氫氧化鈉溶液(2 mol/L)和22.5 g丙三醇，溶解混勻。

1.6.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制

稱取1.000 g的葡萄糖，加水溶解并定容至1000 mL后，分別取出0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mL于試管中，加水至0.5 mL，再加入1.5 mL的DNS試劑，混勻后沸水浴5 min，冷卻后再加入4 mL的蒸餾水，混勻后靜置20 min，在540 nm處測定吸光值。

1.6.3 樣品測定

取1.0 mL的稀釋液于試管中，吸取1.5 mL的DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻后再加入4 mL的蒸餾水，放置20 min，在540 nm處測定吸光值。

1.7 數(shù)據(jù)分析

每次試驗均重復(fù)3次，使用Design Expert設(shè)計響應(yīng)面試驗，GraphPad Prism 9制作條形圖，Excel 2016處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶酶解時間對虎掌菌破壁效果的影響

在溫度50 ℃、料液比1∶15、pH 5.5、酶添加量0.4%的條件下，由圖1可知，隨著時間的延長，還原糖含量不斷增加，當(dāng)時間達到2 h時，還原糖含量最高(P<0.05)。這是因為隨著時間的增加，纖維素酶對細(xì)胞壁的作用不斷加大，使其分解產(chǎn)生還原糖，當(dāng)?shù)孜锿耆幌暮?，即使增加時間，還原糖含量也不會再增加。因此，2 h為最佳酶解時間。

圖1 時間對纖維素酶酶解效果的影響

2.2 纖維素酶酶解溫度對虎掌菌破壁效果的影響

酶解時間為2 h，其他條件不變。由圖2可知，溫度在40～50 ℃時，還原糖含量不斷增加，在50 ℃時達到最大值(2.03±0.05)%(P<0.05)，之后還原糖含量開始下降(P<0.05)。這是因為溫度不斷升高，刺激酶的活性，使酶活性提高，從而對細(xì)胞壁的分解能力增強，不斷產(chǎn)生還原糖；但超過一定的溫度時，部分酶蛋白分子失活變性。張名佳[18]的研究表明，溫度為50 ℃時，纖維素酶的穩(wěn)定性較好，與本試驗結(jié)果一致。因此，最適酶解溫度是50 ℃。

圖2 溫度對纖維素酶酶解效果的影響

2.3 纖維素酶酶解pH對虎掌菌破壁效果的影響

溫度為50 ℃，其他條件不變。由圖3可知，pH從4.5升至5.5時，還原糖含量不斷增加(P<0.05)，并且達到最大值(2.10±0.03)%，當(dāng)pH大于5.5時，還原糖含量開始顯著減少(P<0.05)。這是因為pH影響著酶的活性，適宜的pH有利于酶和底物結(jié)合[19]。因此，最適酶解pH值為5.5。

圖3 pH對纖維素酶酶解效果的影響

2.4 纖維素酶添加量對虎掌菌破壁效果的影響

pH為5.5，其他條件不變。由圖4可知，隨著酶添加量的增加，還原糖含量先增加后減少，酶添加量在0.4%時還原糖含量達到最大值(P<0.05)。這是因為酶的濃度受到添加量的影響，隨著酶濃度的增加，纖維素酶酶解速率增加，導(dǎo)致還原糖含量增大，但當(dāng)添加量過多時，酶的濃度達到飽和狀態(tài)，抑制了酶解作用。因此，0.4%為酶的最適添加量。

圖4 酶添加量對纖維素酶酶解效果的影響

2.5 料液比對虎掌菌破壁效果的影響

酶添加量為0.4%，其他條件不變。由圖5可知，當(dāng)料液比為1∶20時，還原糖含量達到最大值(P<0.05)，隨后開始下降，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。這是因為適當(dāng)?shù)牡孜餄舛?，使酶能夠完全與底物結(jié)合，充分水解，達到最優(yōu)酶解效果；過高的底物濃度會使酶的濃度下降，導(dǎo)致酶解的反應(yīng)速率降低，難以酶解濃度高的物質(zhì)[20]。因此，最佳料液比為1∶20。

圖5 料液比對纖維素酶酶解效果的影響

2.6 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.6.1 試驗設(shè)計結(jié)果及回歸方差分析

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，在溫度為50 ℃、pH為5.5的條件下，利用響應(yīng)面對纖維素酶破壁工藝進一步優(yōu)化，設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果

對表2中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸模型方程為：Y=2.15+0.17A+0.11B-0.046C-0.021AB-0.29AC-0.22BC-0.14A2-0.36B2-0.22C2。

由表3可知，模型的P<0.01，且失擬項的P=0.1936>0.05，說明擬合度好，此模型可用。該回歸模型的絕對系數(shù)R2=0.9717，RAdj2=0.9353，相差較小，說明此模型可用于分析纖維素酶破壁的工藝優(yōu)化?；貧w方程一次項A、B，交互項AC、BC，二次項B2、C2對還原糖含量的影響極顯著(P<0.01)，二次項A2對還原糖含量的影響顯著(P<0.05)。根據(jù)各因素顯著水平，結(jié)合F值大小可以判斷酶解時間、酶添加量、料液比3個因素對還原糖含量的影響順序為酶解時間>酶添加量>料液比。

表3 回歸模型方差分析及模型顯著性檢驗

2.6.2 響應(yīng)曲面與等高線分析

響應(yīng)曲面圖和等高線圖能夠反映各因素影響程度的大小。由圖6中a可知，響應(yīng)曲面圖的坡面陡峭，酶解時間的等高線密集程度較高，說明酶解時間對還原糖含量的影響比酶添加量的影響顯著。由圖6中b可知，隨著酶解時間和料液比的增大，還原糖含量先增大后減小，酶解時間與料液比對還原糖含量的影響顯著，并且二者的交互項顯著。由圖6中c可知，隨著酶添加量和料液比的增大，還原糖含量先增大后減小，酶添加量與料液比對還原糖含量的影響顯著，并且二者的交互項顯著。

圖6 各因素交互作用響應(yīng)曲面及等高線圖

2.7 纖維素酶破壁最優(yōu)工藝及驗證試驗

通過模型得到的最優(yōu)結(jié)果：pH為5.5，溫度為50 ℃，酶解時間為2.5 h ,酶添加量為0.44%，料液比為1∶15.17，還原糖含量為2.36%。根據(jù)此工藝條件進行3組驗證試驗，得出還原糖含量的平均值為(2.28±0.03)%，與理論值相比誤差小，說明該優(yōu)化結(jié)果具有可行性。

3 結(jié)論

虎掌菌滋味鮮，美含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸以及對人體有益的微量元素，是制作獨特菌味調(diào)味料優(yōu)質(zhì)的原材料。本研究以虎掌菌為材料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面試驗優(yōu)化，得到最佳破壁條件為：pH 5.5、溫度50 ℃、酶解時間2.5 h、酶添加量0.44%、料液比1∶15.17，此條件下，還原糖含量的平均值為(2.28±0.03)%，與理論值2.36%接近，說明該優(yōu)化結(jié)果具有可行性。