IgA腎病患者血清Klotho水平與氧化應(yīng)激及腎功能指標(biāo)的相關(guān)性

梁 艷 孫蔚楠 張 宏 朱 清

（河南省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，河南省腎病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院，鄭州 450003）

IgA 腎?。↖gA nephropathy，IgAN）是一種以系膜區(qū)IgA 沉積為主要病理特征的原發(fā)性腎小球疾病，也是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要病因之一，其發(fā)病率約占原發(fā)性腎小球疾病的47.50%~52.66%，且有明顯升高的趨勢(shì)［1-2］；IgAN 雖然呈慢性進(jìn)行性進(jìn)展，但約有1/3患者在10~20年后發(fā)展至終末期腎臟病，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康［3］。目前，IgAN 診斷仍以腎穿刺活檢為“金標(biāo)準(zhǔn)”，但腎活檢作為有創(chuàng)性操作，存在著各種禁忌證和并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)；因此，尋找高敏感度和特異度的生物標(biāo)志物對(duì)IgAN 早期診斷和監(jiān)測(cè)治療具有重要意義。Klotho 是一種在腎臟、腦組織和甲狀旁腺中廣泛表達(dá)的抗衰老基因，其編碼的分泌型蛋白可以激素樣物質(zhì)進(jìn)入血液而發(fā)揮抗氧化、抗炎和抗凋亡等作用［4-5］。研究顯示，血清Klotho水平降低與糖尿病腎病和慢性腎臟病等疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且其表達(dá)水平與氧化應(yīng)激和腎功能指標(biāo)有一定的相關(guān)性［6-7］；但在IgAN 患者中該方面的研究較少。本研究擬分析血清Klotho 與IgAN 患者氧化應(yīng)激及腎功能指標(biāo)的相關(guān)性，旨在為血清Klotho用于IgAN診療提供新的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 收集2019 年5 月至2020 年10月河南省人民醫(yī)院腎病內(nèi)科收治的86例IgAN 患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①IgAN 患者均經(jīng)腎穿刺活檢后診斷為IgAN；②對(duì)參與本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠者；②患有糖尿病腎病、狼瘡性腎炎、肝炎、高血壓和惡性腫瘤等疾病者；③近3 個(gè)月服用激素或免疫抑制劑者。86例患者中男47例、女39例，年齡（37.45±10.02）歲，體重指數(shù)（24.17±1.84）kg/m2；按照Lee 氏病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［8］將其分為輕度組（Ⅰ~Ⅱ級(jí)，共36例）、中度組（Ⅲ級(jí)，共32例）和重度組（Ⅳ~(yú)Ⅴ級(jí)，共18例）。另外選取同期77例健康體檢者作為對(duì)照組，其中，男40例、女37例，平均年齡（35.26±8.85）歲，體重指數(shù)（23.32±2.10）kg/m2。IgAN 組和對(duì)照組在性別、年齡和體重指數(shù)方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。該實(shí)驗(yàn)獲得河南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)同意。

1.1.2 試劑與儀器 ELISA 試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）；BK-600全自動(dòng)生化儀（山東博科再生醫(yī)學(xué)有限公司）。

1.2 方法 所有研究對(duì)象采集5 ml 晨起靜脈血，1 000 r/min 離心5 min 收集血清；留取所有研究對(duì)象的24 h 尿液。參照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清Klotho 和超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平，BK-600全自動(dòng)生化儀檢測(cè)腎功能指標(biāo)血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平和 24 h 尿蛋白，并以MDRD方程計(jì)算腎小球?yàn)V過(guò)率（eGFR）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0 進(jìn)行分析，對(duì)照組和IgAN 組之間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，而輕度組、中度組和重度組采用單因素方差分析進(jìn)行比較；血清Klotho 與IgAN 患者氧化應(yīng)激、腎功能指標(biāo)的相關(guān)性則采用Pearson 法進(jìn)行分析。P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IgAN 組和對(duì)照組間血清Klotho 水平比較 如表1結(jié)果顯示，IgAN組患者血清Klotho、SOD和eGFR水平明顯低于對(duì)照組，而 MDA、Scr、BUN 和 24 h 尿蛋白水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。

表1 IgAN組與對(duì)照組間血清Klotho、氧化應(yīng)激指標(biāo)和腎功能指標(biāo)水平的比較（）Tab.1 Comparison of serum Klotho，oxidative stress and renal function indicators between IgAN group and control group（）

表1 IgAN組與對(duì)照組間血清Klotho、氧化應(yīng)激指標(biāo)和腎功能指標(biāo)水平的比較（）Tab.1 Comparison of serum Klotho，oxidative stress and renal function indicators between IgAN group and control group（）

Groups Control（n=77）IgAN（n=86）t P Klotho/（U·L-1）118.77±10.48 91.49±8.99 17.89＜0.001 SOD/（U·L-1）82.72±6.59 67.54±7.39 13.78＜0.001 MDA/（nmol·ml-1）6.25±0.48 8.46±1.55 12.00＜0.001 Scr/（μmol·L-1）55.91±4.64 108.08±29.26 15.47＜0.001 BUN/（mmol·L-1）6.30±1.42 11.58±3.61 12.03＜0.001 24 h urine protein/g 0.05±0.03 1.17±0.49 20.02＜0.001 eGFR/［ml/（min·1.732）］122.60±16.36 80.43±16.67 16.27＜0.001

2.2 不同嚴(yán)重程度組間血清Klotho 水平比較 如表2 結(jié)果顯示，輕度組、中度組和重度組IgAN 患者血清 Klotho、SOD、MDA、Scr、BUN、24 h 尿蛋白、eGFR 水平整體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中重度組和中度組Klotho水平均低于輕度組，而重度組低于中度組。

表2 不同嚴(yán)重程度IgAN組間血清Klotho、氧化應(yīng)激和腎功能指標(biāo)水平的比較（）Tab.2 Comparison of serum Klotho，oxidative stress and renal function indicators between IgAN groups with different severity（）

表2 不同嚴(yán)重程度IgAN組間血清Klotho、氧化應(yīng)激和腎功能指標(biāo)水平的比較（）Tab.2 Comparison of serum Klotho，oxidative stress and renal function indicators between IgAN groups with different severity（）

Note：Compared with mild group，1）P＜0.05；compared with moderate group，2）P＜0.05.

eGFR［ml/（min·1.732）］98.33±6.46 74.68±5.131）56.89±3.651）2）373.92＜0.001 Groups Klotho/（U·L-1）SOD/（U·L-1）Scr/（μmol·L-1）Mild（n=36）Moderate（n=32）Severe（n=18）F P 98.56±7.02 91.13±5.251）82.07±6.151）2）42.99＜0.001 74.27±4.02 65.45±4.361）58.57±3.251）2）100.02＜0.001 MDA/（nmol·ml-1）7.68±1.25 8.53±1.031）9.87±2.111）2）14.70＜0.001 83.35±10.26 117.84±15.391）146.18±21.241）2）113.34＜0.001 BUN/（mmol·L-1）8.82±1.52 12.65±3.021）15.42±3.481）2）41.98＜0.001 24 h urine protein/g 1.15±0.21 1.38±0.271）1.66±0.421）2）19.48＜0.001

2.3 IgAN 患者血清Klotho 與氧化應(yīng)激及腎功能指標(biāo)的相關(guān)性 如表3 結(jié)果顯示，IgAN 患者血清Klotho與SOD、eGFR呈正相關(guān)（P＜0.05），而與MDA、Scr、BUN和24 h尿蛋白呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

表3 Klotho與IgAN患者氧化應(yīng)激、腎功能指標(biāo)的相關(guān)性Tab.3 Correlation between Klotho and oxidative stress and renal function indicators in IgAN patients

2.4 血清Klotho 在IgAN 診斷中的價(jià)值 ROC 分析結(jié)果顯示，Klotho 診斷IgAN 的ROC 曲線下面積為0.975（95%CI為0.937~0.993），診斷敏感度和特異度分別為93.02%和92.21%，對(duì)應(yīng)的最佳診斷臨界值為103.27 U/L，見(jiàn)圖1。

圖1 血清Klotho診斷IgAN的ROC曲線Fig.1 ROC curve of serum Klotho in diagnosis of IgAN

2.5 血清Klotho 在IgAN 病情診斷中的價(jià)值 ROC分析結(jié)果顯示，血清Klotho 鑒別診斷輕度和中度IgAN 的 ROC 曲線下面積為 0.735（95%CI為 0.614~0.835），敏感度和特異度分別為93.75% 和52.78%，診斷臨界值為97.01 U/L（圖2A）；鑒別診斷中度和重度IgAN 的ROC 曲線下面積為0.858（95%CI為0.730~0.940），敏感度和特異度分別為77.78% 和 84.37%，診斷臨界值為 85.81 U/L（圖2B）。

圖2 血清Klotho診斷IgAN嚴(yán)重程度的ROC曲線Fig.2 ROC curves of serum Klotho in diagnosis of IgAN severity

3 討論

IgAN 又名Berger's 病，是因糖基化異常的IgA1免疫復(fù)合物沉積于腎小球所引起的一系列病理改變，臨床主要表現(xiàn)包括血尿、蛋白尿和腎功能異常等。目前，有創(chuàng)性檢查腎穿刺活檢仍是IgAN診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，不便反復(fù)操作且給患者帶來(lái)一定的傷害［9］，因此，亟需尋找一種特異性生物學(xué)標(biāo)志物用于IgAN 診療。Klotho 是一種衰老抑制基因，其編碼的蛋白包括膜結(jié)合型和分泌型兩種，其中膜結(jié)合型Klotho 主要表達(dá)于腎臟遠(yuǎn)曲小管中，可通過(guò)與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GF）受體結(jié)合在鈣磷代謝等過(guò)程中發(fā)揮重要作用；而分泌型Klotho 是由組織分泌后釋放到胞外并進(jìn)入體液循環(huán)，可于血液、尿液和腦脊液等體液中檢測(cè)到，具有唾液酸酶的作用［10］。本研究在外周血中檢測(cè)到的主要是分泌型Klotho。Klotho 已被報(bào)道在慢性腎臟?。╟hronic kidney diseases，CKD）、糖尿病腎病和急性腎損傷等腎臟疾病中呈低表達(dá)狀態(tài)，與腎損傷程度密切相關(guān)，增加Klotho 表達(dá)可發(fā)揮腎臟保護(hù)作用［11-12］。本研究比較了 86例 IgAN 患者和 77例健康體檢者血清中Klotho 表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IgAN 患者血清Klotho 水平明顯降低；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著IgAN 病情程度的加重，血清中Klotho 水平減低逐漸明顯，提示血清Klotho 與IgAN 病情進(jìn)展密切有關(guān)。目前，關(guān)于IgAN 發(fā)病機(jī)制并不完全清楚，但已被證實(shí)與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)［13］。含IgA 免疫復(fù)合物可刺激系膜細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基，引起抗氧化物SOD和谷胱甘肽過(guò)氧化酶等減少，而氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA和終末氧化蛋白產(chǎn)物等增多，打破原有的氧化-抗氧化平衡，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)造成腎組織損傷，促進(jìn)IgAN 的發(fā)生發(fā)展［14］。有學(xué)者探討了氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA 等在 IgAN 中的異常變化［15］，但未見(jiàn)IgAN不同病情中這些指標(biāo)的差異性研究。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了IgAN 患者中SOD 水平降低而MDA 升高的狀態(tài)，且隨著患者病情進(jìn)展差異越明顯。有研究顯示，Klotho 對(duì)組織氧化應(yīng)激反應(yīng)具有一定抑制作用［15-16］。XING 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)糖尿病小鼠的Klotho 水平可以激活核因子-紅細(xì)胞2 相關(guān)因子（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信號(hào)通路從而抑制糖尿病誘導(dǎo)的腎臟氧化應(yīng)激損傷和足細(xì)胞凋亡，改善腎功能并降低腎小球硬化。Wnt 信號(hào)通路的激活是公認(rèn)的腎臟氧化應(yīng)激損傷和足細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制［18］；KIM 等［19］研究發(fā)現(xiàn) Klotho 表達(dá)可顯著影響Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄本和蛋白的表達(dá)水平，提高Klotho 蛋白表達(dá)水平可提高細(xì)胞的ATP 水平和抗氧化活性，因此推測(cè)Wnt 信號(hào)通路也是Klotho 介導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制之一。此外，關(guān)于Klotho 與腎功能的相關(guān)性也已有許多報(bào)道，其主要機(jī)制在于 Klotho 與 FGF 的結(jié)合［20］；FGF23 在阻止CKD 磷酸鹽積累中發(fā)揮重要作用，而這一過(guò)程依賴于Klotho 對(duì)FGF 受體的激活，并通過(guò)抑制Wnt/βcatenin 通路調(diào)節(jié)腎損傷過(guò)程，腎功能指標(biāo)也隨之發(fā)生改變［21］。因此，Klotho 水平與腎功能指標(biāo)存在相關(guān)性。目前，雖然在IgAN 中已有關(guān)于Klotho 的研究，但多集中在Klotho 甲基化或多態(tài)性與IgAN 進(jìn)展和腎功能方面［22-23］，而關(guān)于分泌型 Klotho 與 IgAN 患者氧化應(yīng)激和腎功能相關(guān)性的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，IgAN 患者血清Klotho 與 SOD、eGFR 呈正相關(guān)，而與 MDA 和腎功能相關(guān)指標(biāo)Scr、BUN、24 h尿蛋白呈負(fù)相關(guān)，提示下降的Klotho 水平與IgAN 患者的氧化應(yīng)激水平及腎功能密切相關(guān)，Klotho 可能通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化能力調(diào)節(jié)IgAN患者的腎功能。

有研究報(bào)道，血清Klotho 在急性腎損傷早期診斷方面具有潛在的臨床價(jià)值，其敏感度和特異性分別高達(dá)92%、94%［24］；另外，在2 型糖尿病腎臟病診斷方面，血清Klotho 的診斷敏感度和特異度分別為95.6%、84.5%［25］?？梢?jiàn)，Klotho 在腎臟相關(guān)疾病方面具有潛在的診斷價(jià)值。目前部分研究報(bào)道了Klotho 在 CKD 診斷中的價(jià)值［26］，但關(guān)于其在 IgAN 中的意義尚無(wú)報(bào)道。本研究對(duì)血清Klotho 在IgAN 患者中的診斷價(jià)值進(jìn)行ROC 曲線分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血清Klotho 診斷IgAN 的曲線下面積為0.975，其診斷臨界值對(duì)應(yīng)的敏感度和特異度分別為93.02%和92.21%；此外，其診斷輕中度、中重度IgAN 的曲線下面積分別為0.735和0.858，診斷臨界值的敏感度分別為93.75%和77.78%，特異度分別為52.78%和84.37%，提示血清Klotho 水平對(duì)于IgAN 的診斷以及嚴(yán)重程度的判斷均有一定價(jià)值，有望成為在臨床推廣的IgAN生物標(biāo)志物。值得注意的是，本研究未進(jìn)行膜結(jié)合型Klotho 表達(dá)水平的檢測(cè)，因此不能給出膜結(jié)合型Klotho 與IgAN 診斷的明確結(jié)論；而由于膜結(jié)合型Klotho 主要表達(dá)于腎臟組織，其檢測(cè)需要借助于組織穿刺后的免疫組化實(shí)驗(yàn)，因此該指標(biāo)的研究及在臨床上的應(yīng)用有一定局限性。因此，外周血中分泌型Klotho 可作為未來(lái)IgAN 診斷和靶向指標(biāo)的主要研究方向。

綜上所述，IgAN 患者血清Klotho 水平顯著低于對(duì)照組，且病情越嚴(yán)重血清Klotho 水平越低；血清Klotho 與IgAN 患者氧化應(yīng)激水平及腎功能指標(biāo)均有明顯相關(guān)性；血清Klotho 可用于IgAN 診斷和嚴(yán)重程度的評(píng)估。該結(jié)果為后續(xù)深入探討Klotho 參與IgAN 病情進(jìn)展的分子機(jī)制以及將血清Klotho 作為監(jiān)測(cè)指標(biāo)診斷和評(píng)估IgAN 病情提供了新的參考依據(jù)。