流感病毒感染A549細(xì)胞外泌體差異microRNA篩選及靶基因分析①

葉賀賀 盧 濤 鐘 婧 董佳敏 李夢(mèng)佳 李 珂 吳 瑩

（北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488）

流感是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，主要通過(guò)空氣中含流感病毒的氣溶膠進(jìn)行傳播［1］。流感是人類面臨的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題，據(jù)WHO 統(tǒng)計(jì)，流感病毒平均每年導(dǎo)致300~500 萬(wàn)人感染重癥，30~50萬(wàn)人死亡［2］。流感感染存在復(fù)雜的免疫病理。流感病毒主要感染呼吸道上皮細(xì)胞，在上皮細(xì)胞中復(fù)制，可引起上皮細(xì)胞凋亡、壞死；同時(shí)，病毒成分被上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞等免疫細(xì)胞的模式識(shí)別受體（PRRs）識(shí)別，活化免疫細(xì)胞，產(chǎn)生IFNs、TNF-α、IL-1β、CCL2等細(xì)胞因子，啟動(dòng)機(jī)體抗流感免疫應(yīng)答［3］。不充分的抗病毒免疫應(yīng)答導(dǎo)致病毒大量復(fù)制，而過(guò)度免疫應(yīng)答也導(dǎo)致免疫病理反應(yīng)，因此，病毒、宿主、免疫應(yīng)答間的平衡決定了流感的結(jié)局。其中，病毒與宿主細(xì)胞以及免疫細(xì)胞間的相互作用一直是感染免疫領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。

外泌體是一種由多種細(xì)胞分泌的含多種遺傳物質(zhì)和信號(hào)分子的膜性囊泡，大小為30~150 nm，可在細(xì)胞間傳遞蛋白、mRNA 和miRNA，是細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵遞質(zhì)［4］。外泌體可通過(guò)多種機(jī)制與靶細(xì)胞相互作用，而外泌體攜帶的miRNA 是其發(fā)揮作用的重要原因［5］。研究表明，病毒可改變被感染細(xì)胞分泌的外泌體miRNA 表達(dá)，差異表達(dá)的miRNA 對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行修飾或改變，為病毒復(fù)制和傳播創(chuàng)造有利條件［6-7］。目前流感病毒感染中對(duì)外泌體的研究較少。本研究對(duì)流感病毒感染A549 細(xì)胞分泌的外泌體進(jìn)行提取、鑒定，通過(guò)RNAseq 檢測(cè)外泌體攜帶的差異miRNA，對(duì)差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)、分析，以期進(jìn)一步研究流感病毒感染上皮細(xì)胞外泌體miRNA的免疫功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 狗腎細(xì)胞株MDCK 購(gòu)于北京協(xié)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；人肺癌基底上皮細(xì)胞株A549由北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)整合中心實(shí)驗(yàn)室所惠贈(zèng)。

1.1.2 流感病毒株 甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株P(guān)R8（A/PR8/34）由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供，本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存。

1.1.3 試劑 DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone 公司）；DMSO、雙抗青鏈霉素、胰蛋白酶（Trypsin，Gibco 公司）；胎牛血清（ABW 公司）；RIPA 裂解液（Thermo 公司）；ECL 超敏顯色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；外泌體磁珠提取試劑盒（美天旎公司）；流感病毒核蛋白NP 抗體（北京義翹神舟公司）；Hsp70、calnexin、CD63 和 CD9 單 克 隆 抗 體（Santa Cruz公司）；β-actin、488標(biāo)記的羊抗鼠IgG（H+L）、山羊封閉血清、山羊抗小鼠、山羊抗兔抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 流感病毒擴(kuò)增 選取9 日齡SPF 級(jí)雞胚，在胚胎對(duì)側(cè)氣室線0.5 cm 處避開大血管標(biāo)記進(jìn)針部位，無(wú)菌鉆蛋器對(duì)準(zhǔn)進(jìn)針位置鉆開約2 mm 小孔，無(wú)菌注射器吸取0.2 ml PR8 垂直經(jīng)小孔注入雞胚，棉簽蘸取融化的石蠟封口。將雞胚傾斜45°于37 ℃培養(yǎng)48 h，每隔8 h 翻轉(zhuǎn)1 次雞胚。-20 ℃豎直保存1 h后轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱過(guò)夜，收取雞胚尿囊液待用。HA檢測(cè)雞胚尿囊液中PR8 血凝效價(jià)，選取血凝效價(jià)高或接近的雞胚尿囊液混勻，分裝，-80 ℃保存待用。

1.2.2 A549、MDCK 細(xì)胞培養(yǎng) 從-80 ℃冰箱取出細(xì)胞株，快速放入37 ℃水浴鍋中解凍，移至含2 ml DMEM 培養(yǎng)基的離心管中，4 ℃、1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入2 ml 培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)移至含5 ml 培養(yǎng)基的T25 培養(yǎng)瓶，十字形混勻后37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至單層80%~90%融合，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 次，加入1 ml 0.25%胰酶消化，當(dāng)細(xì)胞變圓脫落時(shí)，加入完全培養(yǎng)基終止消化。一部分細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，4 ℃、1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入1 ml細(xì)胞凍存液混勻，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞凍存管凍存；另一部分細(xì)胞懸液分裝于其他細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代2~3 次后加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板用于病毒感染性測(cè)定試驗(yàn)。

1.2.3 流感病毒株P(guān)R8 半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量（TCID50）測(cè)定 病毒組用DMEM 培養(yǎng)基對(duì)PR8 進(jìn)行連續(xù)10 倍遞次稀釋，將各稀釋度的病毒液接種于MDCK細(xì)胞單層吸附的96孔板，對(duì)照組僅加稀釋液。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h，棄病毒液改用細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)，孵育24 h、48 h、72 h 后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathogenic effect，CPE），記錄病變程度和孔數(shù)。以對(duì)照組為參照，病毒感染細(xì)胞出現(xiàn)變圓、壞死、從瓶壁脫落的病變率達(dá)50%以上的細(xì)胞孔為病變孔，Reed-Muench 法計(jì)算病毒TCID50。

1.2.4 間接免疫熒光檢測(cè)PR8對(duì)A549細(xì)胞的感染率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，接種于6孔板（0.1 ml/孔），37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，病毒組用100 μl PR8稀釋液（100 TCID50）感染細(xì)胞，對(duì)照組僅加稀釋液，2 h后棄上清，更換為無(wú)血清完全培養(yǎng)基，48 h 后終止培養(yǎng)。選取其中3 個(gè)孔分別加入1 ml 胰酶消化后計(jì)數(shù)，鋪于 6 孔板。PBS 浸洗 5 min×3 次，多聚甲醛固定15 min，PBS 浸洗3 min×3次，0.3%Triton X-100室溫通透 10 min，PBS 浸洗 3 min×3 次，吸水紙吸干PBS，滴加山羊血清室溫封閉1 h，加入NP 抗體4 ℃孵育過(guò)夜，加入488標(biāo)記的羊抗鼠IgG（H+L）二抗孵育1 h，PBS浸洗3 min×3次，滴加DAPI避光孵育5 min，PBST 洗滌5 min×4 次，含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 外泌體提取 A549細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.2.4，終止培養(yǎng)后收集細(xì)胞上清，4 ℃、2 000 g 離心30 min，收集上清。采用超速離心法提取外泌體，4 ℃、300 g 離心 10 min，取上清，4 ℃、2 000 g 離心10 min，取上清，4 ℃、10 000 g離心10 min，取上清經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾轉(zhuǎn)移至超高速離心管，4 ℃、110 000 g 離心75 min，棄上清，收集管底沉淀，10 ml PBS 重懸，4 ℃、110 000 g 離心 75 min，PBS 重懸沉淀，分裝并標(biāo)記病毒組為PR8-exos，對(duì)照組為Conexos。采用免疫磁珠法純化外泌體，按照試劑盒說(shuō)明書將超速離心所得的PR8-exos與CD9磁珠、CD63磁珠、CD81磁珠共孵育1 h，加至μMACS 分選柱，用100 μl 分離緩沖液洗滌 3 次，將 μMACS 分選柱移出磁場(chǎng)，洗脫得到純化的外泌體。

1.2.6 電鏡觀察外泌體的形態(tài)和粒徑大小 取10 μl 外泌體重懸液置于載樣200 目銅網(wǎng)，室溫靜置5 min，用濾紙從側(cè)面吸干液體，取10 μl 3%磷鎢酸滴加于銅網(wǎng)，室溫復(fù)染5 min，吸干磷鎢酸，將銅網(wǎng)置于65 ℃白熾燈下烘干10~15 min，80 kV 條件下采用透射電鏡觀察。

1.2.7 納米粒徑分析（NTA）檢測(cè)外泌體的粒徑分布 將外泌體用 PBS 稀釋，0.22 μm 濾膜過(guò)濾，取3 ml 懸液用可視化納米顆粒示蹤分析儀Zetaview PMX 110 進(jìn)行粒徑分析，設(shè)置參數(shù)為激光器488 nm、25 ℃、pH=7.2、導(dǎo)電性敏感度90%、快門數(shù)70、光亮強(qiáng)度70、模式11 point、拍照模式middle。納米粒度分析儀檢測(cè)外泌體粒徑分布情況。

1.2.8 Western blot 檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白表達(dá)分 別 取 PR8-exos、Con-exos、A549 細(xì) 胞 裂 解 液 和100 TCTD50的 PR8 稀釋液，RIPA 裂解液裂解后加入4×SDS上樣緩沖液，95 ℃水浴變性10 min，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，冰上轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉 1 h，TBST 洗膜 3 次，分別加入 β-actin、calnexin、Hsp70、CD63、CD9 抗體 37 ℃孵育 2 h，TBST 洗滌3 次，加入對(duì)應(yīng)二抗37 ℃孵育 1 h，PBS 洗滌3 次，加入超敏型ECL顯色液曝光并保存圖片。

1.2.9 外泌體RNA 提取 向PR8-exos 和Con-exos重懸液中各加入700 μl QIAzol，漩渦振蕩10 s，簡(jiǎn)短離心后室溫孵育 5 min，加入 140 μl 氯仿/異戊醇（24∶1）混勻，室溫孵育2~3 min。4 ℃、12 000 g 離心8 min，取上清，加入2 倍上清體積的無(wú)水乙醇，混勻，過(guò)柱純化，加入 700 μl RWT 緩沖液洗 1 次，加入500 μl PE 緩沖液洗 2 次，12 000 g 離心 2 min，甩干膜，棄收集管，將柱子移至新的收集管，加入20 μl去RNA酶水，室溫孵育1 min，12 000 g離心2 min，洗脫RNA，得到約15 μl洗脫產(chǎn)物。

1.2.10 RNAseq 構(gòu)建文庫(kù)，取RNA 樣品，用聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離回收Small RNA。配制3'接頭的連接體系，70 ℃ 2 min，25 ℃ 2 h；加入反轉(zhuǎn)錄引物，65 ℃ 15 min，以0.3 ℃/s降溫至4 ℃；配制并加入5'接頭連接體系，70 ℃ 2 min，25 ℃ 1 h。進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-PCR 擴(kuò)增，回收產(chǎn)物，保存于EB 緩沖液。采用安捷倫2100 生物分析儀檢測(cè)濃度與文庫(kù)長(zhǎng)度。變性打開雙鏈PCR 產(chǎn)物，加入環(huán)化引物，使PCR 單鏈成環(huán)狀。通過(guò)聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，鑒定PR8-exos 和Con-exos 中差異表達(dá)的miRNA，進(jìn)行差異表達(dá)分析和生物學(xué)功能KEGG和GO富集分析。

2 結(jié)果

2.1 流感病毒株P(guān)R8 感染MDCK、A549 細(xì)胞 觀察 PR8 對(duì) MDCK 細(xì)胞的 CPE，Reed-Muench 法計(jì)算其TCID50為10-4.12/0.1 ml。與對(duì)照組相比，100 TCID50PR8 感染后的A549 細(xì)胞胞質(zhì)中均可觀察到明顯綠色熒光。通過(guò)對(duì)比白光和熒光下細(xì)胞數(shù)，100 TCID50的PR8對(duì)A549細(xì)胞感染率為100%，同時(shí)未觀察到A549細(xì)胞出現(xiàn)空泡、變圓等CPE（圖1）。

圖1 間接免疫熒光法檢測(cè)PR8對(duì)A549細(xì)胞的感染率Fig.1 Infection rate of PR8 on A549 cells detected by indirect immunofluorescence assay

2.2 外泌體形態(tài)與粒徑大小 電鏡觀察囊泡形態(tài)和大小可對(duì)Con-exos和PR8-exos進(jìn)行初步鑒定，拍攝視野中Con-exos 和PR8-exos 直徑多為50~150 nm，但大小不完全一致；小囊泡形態(tài)均為杯托狀小囊泡，是典型的圓形雙層膜小囊泡結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖2 透射電鏡觀察外泌體形態(tài)和大?。?00 nm/200 nm）Fig.2 Morphology and size of exosomes observed by transmission electron microscopy（100 nm/200 nm）

2.3 外泌體粒徑分布 NTA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大部分囊泡粒徑為100 nm，PR8-exos 和Con-exos 粒徑大小分布幾乎一致（圖3）。50%Con-exos 粒徑分布在100 nm左右，另外50%Con-exos的粒徑分布在170 nm左右，100%PR8-exos 的粒徑分布在 150 nm 以下（表 1）。PR8-exos 濃度高于Con-exos 濃度，說(shuō)明流感病毒可刺激細(xì)胞外泌體產(chǎn)生（表2）。

圖3 NTA檢測(cè)外泌體粒徑分布及濃度Fig.3 Particle size distribution and concentration of exosomes detected by NTA

表1 Con-exos與PR8-exos粒徑分布（nm）Tab.1 Particle size distribution of Con-exos and PR8-exos（nm）

表2 Con-exos與PR8-exos濃度（Particles/ml）Tab.2 Concentrations of Con-exos and PR8-exos（Particles/ml）

2.4 外泌體表面分子標(biāo)志物表達(dá) Western blot 檢測(cè)表明不同來(lái)源外泌體和細(xì)胞裂解液，26、27 和70 kD 處均可檢測(cè)到目的條帶，說(shuō)明提取的外泌體攜帶CD63、CD9 和Hsp70 蛋白。同時(shí)正常細(xì)胞裂解液中檢測(cè)到calnexin，外泌體中卻均未檢測(cè)到。PR8病毒液中均未檢測(cè)到CD63、CD9、Hsp70 和calnexin（圖4）。

圖4 Western blot鑒定外泌體表面分子標(biāo)志物Fig.4 Molecular markers on surface of exosomes identified by Western blot

2.5 Con-exos 和PR8-exos 差異表達(dá)miRNA 凝膠成像系統(tǒng)和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)顯示，Con-exos 總RNA 濃度為 0.292 0 ng/μl，PR8-exos 總 RNA 濃度為0.364 0 ng/μl，均滿足建庫(kù)實(shí)驗(yàn)要求。將樣本與miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，共檢測(cè)到238 個(gè)已知miRNA，VENN 圖分析發(fā)現(xiàn)，Con-exos 攜帶 190 個(gè)miRNA，PR8-exos 攜帶 183 個(gè)，共 135 個(gè)，Con-exos 特有55 個(gè)，PR8-exos 特有 48 個(gè)（圖5）。篩選得到差異表達(dá) miRNA 共 84 個(gè)，與 Con-exos 組相比，PR8-exos組表達(dá)下調(diào)的43 個(gè)，表達(dá)上調(diào)的41 個(gè)。將篩選出的差異miRNA 的基因表達(dá)量進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)兩組差異基因呈3 種表達(dá)模式聚類（圖6），也說(shuō)明PR8-exos 和Con-exos 在基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平上存在明顯差異。PR8-exos 組特有的差異表達(dá)miRNA 共27個(gè)，Con-exos組特有的差異表達(dá)miRNA共3個(gè)。

圖5 Con-exos和PR8-exos miRNA韋恩圖Fig.5 miRNA VENN diagrams of Con-exos and PR8-exos

圖6 Con-exos和PR8-exos組差異miRNA表達(dá)變化聚類圖Fig.6 Cluster diagram of changes in differential miRNA expression in Con-exos group and PR8-exos group

2.6 差異miRNA 的KEGG 和GO 富集分析 對(duì)Con-exos 和 PR8-exos 篩選出的差異 miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，84 個(gè)差異miRNA 共預(yù)測(cè)到579 個(gè)靶基因mRNA。對(duì)其靶基因mRNA 進(jìn)行GO 富集分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的靶基因主要富集于有絲分裂細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換、細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)穩(wěn)定、細(xì)胞對(duì)DNA 損傷刺激的反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA 模板、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控、DNA 模板、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、凋亡過(guò)程的正調(diào)控、細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖的積極調(diào)節(jié)、凋亡過(guò)程、基因表達(dá)的正調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化、病毒過(guò)程、蛋白質(zhì)泛素化、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、DNA 模板、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA 模板、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過(guò)程（圖7），表明差異表達(dá)的miRNA 可能在這些過(guò)程調(diào)控中發(fā)揮作用。對(duì)差異miRNA靶基因進(jìn)行KEGG富集分析（圖8），表明差異miRNA 調(diào)控的靶基因主要涉及細(xì)胞增殖和凋亡、固有免疫及炎癥反應(yīng)、干擾素相關(guān)信號(hào)通路。與細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控相關(guān)的差異miRNA有36個(gè)，PR8-exos 中表達(dá)上調(diào)的有 18 個(gè)，下調(diào)的有 18 個(gè)，靶基因主要集中于p53信號(hào)通路、前列腺癌、叉頭蛋白O（FoxO）信號(hào)通路、AMPK 信號(hào)通路、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）信號(hào)通路、細(xì)胞周期、乙型肝炎、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路、肺癌蛋白多糖、磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路、腫瘤通路、胰島素信號(hào)通路、癌癥中的 microRNAs、麻疹、Hippo 信號(hào)通路、黏著斑、癌癥轉(zhuǎn)錄調(diào)控、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、小G 蛋白R(shí)ap 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、病毒致癌通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工、人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒感染、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)等信號(hào)通路。與固有免疫及炎癥反應(yīng)相關(guān)的差異miRNA 有64 個(gè)，PR8-exos 中表達(dá)上調(diào)的31 個(gè)，下調(diào)的33 個(gè)，調(diào)控的靶基因主要集中于MyD88、IL-10、Jak-STAT、CAMKⅡ、SOCS 和 NLRP 等信號(hào)通路。與 Con-exos 相比，PR8-exos 差異miRNA 調(diào)控的與干擾素信號(hào)通路有關(guān)的靶基因有41個(gè)，調(diào)控這些靶基因的miRNA 有66個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的30 個(gè)，表達(dá)下調(diào)的36 個(gè)。相關(guān)靶基因涉及IFN 基因（IFNL1、IFNA2、IFNA8、IFNB1）、IFN 受體基因（IFNAR1、IFNLR1）、干擾素刺激基因（MX2、IRF9、CCL11）、JAK-STAT通路（JAK2、STAT2）。結(jié)果見(jiàn)附錄表（www.immune99.com）。

圖7 Con-exos 和 PR8-exos 組差異 miRNA 靶基因 GO 富集分析Fig.7 Go enrichment analysis of differential miRNA target genes in Con-exos and PR8-exos groups

圖8 Con-exos 和 PR8-exos 組差異 miRNA 靶基因 KEGG富集分析Fig.8 KEGG enrichment analysis of differential miRNA target genes in Con-exos and PR8-exos groups

3 討論

外泌體可攜帶miRNAs 影響靶細(xì)胞功能，在病毒復(fù)制、感染免疫中發(fā)揮重要作用。研究表明，外泌體與靶細(xì)胞融合后，外泌體傳遞的病毒和細(xì)胞miRNAs 可通過(guò)抑制 mRNA 翻譯改變基因表達(dá)［8］。EB病毒感染的細(xì)胞外泌體富含EBER、LMP1和EB病毒BART miRNA，可通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移至鄰近或遠(yuǎn)隔未感染細(xì)胞，激活A(yù)KT和ERK信號(hào)通路，從而維持病毒持續(xù)潛伏感染與腫瘤形成［9-10］。MAEMURA 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染小鼠后，可促進(jìn)肺組織外泌體分泌，小鼠支氣管肺泡灌洗液中差異miRNAs明顯升高，其中miR-483-3p 升高顯著，可調(diào)節(jié)Ⅰ型IFN 和促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，在抗病毒及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也在高致病性H5N1 禽流感病毒感染的小鼠血清中發(fā)現(xiàn)外泌體囊泡中miR-483-3p顯著增加，可增強(qiáng)促炎細(xì)胞因子基因在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)［12］。MAEMURA 等［11］研究表明，小鼠流感病毒感染模型中肺泡灌洗液及血漿中的外泌體miRNAs 成分在流感感染免疫中發(fā)揮重要作用。研究流感病毒感染細(xì)胞外泌體攜帶的差異miRNAs 及其功能有助于深入了解流感感染中的病毒與宿主以及免疫細(xì)胞間的相互作用。

目前對(duì)流感病毒感染細(xì)胞外泌體的研究仍較少，因此，本文首先對(duì)流感病毒PR8 感染A549 細(xì)胞后分泌的外泌體（PR8-exos）及正常A549 細(xì)胞分泌的外泌體（Con-exos）進(jìn)行提取和鑒定。由于外泌體與病毒形態(tài)、大小極為相似，課題組采用超速離心法結(jié)合CD9、CD81、CD63 磁珠免疫法對(duì)外泌體進(jìn)行提取分離。通過(guò)100 000 g 超速離心收集產(chǎn)物，可能包含了囊泡與病毒的混合物，但外泌體標(biāo)志蛋白有CD9、CD63 和CD81 等，而病毒表面一般無(wú)這些標(biāo)志蛋白表達(dá)，因此可通過(guò)CD9、CD81和CD63免疫磁珠吸附純化外泌體［13］。

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)純化的外泌體形態(tài)為圓盤杯托狀小囊泡，符合文獻(xiàn)報(bào)道的外泌體典型形態(tài)。NTA 檢測(cè)結(jié)果提示 PR8-exos 濃度高于 Con-exos，說(shuō)明流感病毒感染可刺激外泌體分泌［13］，與MAEMURA等［11］在流感病毒感染小鼠模型中觀察到的結(jié)果一致。

Western blot 進(jìn)一步鑒定了外泌體的蛋白標(biāo)志物。根據(jù)國(guó)際囊泡協(xié)會(huì)要求，采用蛋白標(biāo)志物鑒定外泌體時(shí)應(yīng)選擇3 個(gè)陽(yáng)性指標(biāo)、1 個(gè)陰性指標(biāo)，陽(yáng)性指標(biāo)包括跨膜蛋白（如四次跨膜蛋白CD63、CD9等）、細(xì)胞內(nèi)源性蛋白，如腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）、膜聯(lián)蛋白A（Annexin A，ANXA）、Rab 家族蛋白 Rab 及熱休克蛋白（如Hsp70、Hsp90 等），而不存在的1 個(gè)陰性指標(biāo)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來(lái)源蛋白，如鈣連接蛋白（calnexin，CANX）、高爾基體基質(zhì)蛋白（golgi matrix protein，GM130）或核蛋白［14］。Western blot 對(duì) PR8-exos、Con-exos 鑒定的結(jié)果均符合國(guó)際囊泡協(xié)會(huì)制定的3個(gè)陽(yáng)性、1個(gè)陰性的標(biāo)準(zhǔn)，證實(shí)所提取的囊泡為外泌體，而正常細(xì)胞細(xì)胞裂解液中檢測(cè)到的calnexin 外泌體中均未檢測(cè)到，PR8 病毒裂解液中也未檢測(cè)到CD63、CD9、Hsp70和calnexin。

miRNAs 也是外泌體囊泡攜帶的主要成分，外泌體通過(guò)轉(zhuǎn)移miRNAs 影響靶細(xì)胞功能，是外泌體主要的作用方式之一。miRNAs 是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心成員，在流感感染免疫中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。研究報(bào)道，在病毒感染中，外泌體包含的miRNAs 如hsa-miR-92a、hsa-miR-320c、hsa-miR-30e 表達(dá)上調(diào)可能會(huì)調(diào)控病毒基因片段，影響病毒感染［15］。目前，關(guān)于流感病毒感染細(xì)胞外泌體miRNAs 的報(bào)道較少。毛立［16］報(bào)道了外泌體和自噬在山羊副流感病毒3型（CPIV3）感染中的作用，發(fā)現(xiàn)CPIV3感染可促進(jìn)細(xì)胞分泌外泌體，CPIV3 外泌體（CPIV3-exo）對(duì)miRNA有明顯的選擇性，可攜帶miRNA參與調(diào)控細(xì)胞自噬相關(guān)通路，抑制IFN-α 和oasl 的表達(dá)。在MAEMURA 等［11］對(duì)流感病毒感染小鼠肺泡灌洗液中差異miRNA表達(dá)譜的研究中，miR-16-5p等miRNA發(fā)生明顯變化，本課題組提取的流感病毒感染A549細(xì)胞分泌的外泌體中也檢測(cè)到miR-16-5p 的差異表達(dá)。MAEMURA 等［11］主要研究了肺泡灌洗液中顯著差異表達(dá)的miR-483-3p，發(fā)現(xiàn)其可調(diào)控IFN-β，調(diào)節(jié)病毒感染后的固有免疫應(yīng)答，但PR8-exos 中并未檢測(cè)到miR-483-3p 的差異表達(dá)，可能是由于不同病毒毒株感染，以及不同種屬的組織、細(xì)胞來(lái)源的外泌體中差異miRNA 的表達(dá)譜不同。PR8-exos 中差異miRNA 調(diào)控的靶基因主要涉及細(xì)胞增殖凋亡、固有免疫與炎癥反應(yīng)、IFN 相關(guān)的信號(hào)通路等。本研究為進(jìn)一步探討流感病毒感染A549 細(xì)胞外泌體miRNA在流感病毒感染免疫中的作用奠定了基礎(chǔ)。