人前梯度蛋白2與黏蛋白5AC在慢性鼻-鼻竇炎中的表達及意義

王 娜 柴向斌 （山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，太原 030001）

慢性鼻-鼻竇炎（chronic rhinosinusitis，CRS）是一種以炎癥調(diào)節(jié)失衡為特征的異質(zhì)性、多因素慢性疾病，是鼻-鼻竇黏膜急性炎癥免疫應答失調(diào)而導致的長期炎癥狀態(tài)，其主要臨床表現(xiàn)為鼻塞、流涕，部分伴有嗅覺障礙和耳面部癥狀等［1-4］。流行病學研究表明，CRS 在北美和歐洲的發(fā)病率為4.5%~12%，我國15~75歲人群中CRS發(fā)病率高達8.2%，且近年發(fā)病率及復發(fā)率呈逐年升高趨勢，而長期鼻塞、流涕嚴重影響患者生活質(zhì)量，因此CRS 發(fā)病機制、預防及治療仍是國內(nèi)外關注的重點問題［5-6］。

CRS 一般分為兩個亞型：慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉（CRS without nasal polyps，CRSsNP）和慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉（CRS with nasal polyps，CRSwNP）［6］。杯狀細胞化生、黏液高分泌和黏液清除不足是CRS的重要病理生理特征，也是導致鼻漏和鼻塞等常見癥狀的原因［7-10］。黏蛋白（mucoprotein，MUC）是黏液重要組成，賦予黏液一定黏性和彈性，而MUC5AC是分泌性黏蛋白的主要成分［11］。正常生理情況下，杯狀細胞分泌的MUC5AC 具有構成氣道黏液屏障、參與形成黏膜固有免疫的功能，而當鼻-鼻竇黏膜受刺激時，會促進杯狀細胞過度活化增生產(chǎn)生過多MUC5AC，導致鼻腔竇口引流障礙，對CRS發(fā)病率和患者生活質(zhì)量影響較大［10-13］。目前，對杯狀細胞增殖分化和黏液高分泌尚無特效治療方法，需進一步了解黏蛋白過度產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)機制［14］。近年人前梯度蛋白2（anterior gradient 2，AGR2）在眾多研究中均被發(fā)現(xiàn)與哮喘和肺部疾病杯狀細胞增生和MUC5AC 過度產(chǎn)生密切相關，AGR2 可能是調(diào)節(jié)黏液高分泌的關鍵因子，但AGR2 在CRS 患者中的表達和調(diào)控尚未見文獻報道［15-16］。本研究通過觀察AGR2 在CRS 患者鼻竇黏膜中的表達與分布及其與MUC5AC 的關系，初步探討CRS 的黏液高分泌免疫調(diào)控機制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選取 2019 年 8 月至 2020 年 1 月于山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科行鼻內(nèi)鏡手術的患者組織標本45例，其中以15例CRSsNP患者的下鼻甲黏膜為CRSsNP 組，男5 例，女10 例，年齡 18~65 歲，平均（44.73±15.22）歲；以 15 例CRSwNP 患者鼻息肉組織為 CRSwNP 組，男 8 例，女7 例，年齡27~66 歲，平均（49.93±13.98）歲；以15 例鼻中隔偏曲或鼻外傷患者下鼻甲黏膜組織為正常對照組，男 11 例，女 4 例，年齡 18~67 歲，平均（42.50±13.54）歲。手術中取出標本后分為兩份，一份立即存放于RNAlater試劑，?80 ℃保存，用于定量mRNA 檢測；另一份立即于4%多聚甲醛固定，用于HE 染色、AB-PAS 染色及IHC 檢測。本研究中CRSwNP 和CRSsNP 診斷基于患者臨床病史和前鼻鏡、鼻內(nèi)窺鏡及鼻竇CT 結果，符合EPOS 2012 和中國慢性鼻竇炎診斷和治療指南（2018）［2，6，17］。對照組均無鼻部癥狀，無特應性疾病病史，對常見過敏原的皮膚點刺試驗結果為陰性。排除標準：①手術前4周內(nèi)接受過抗生素和糖皮質(zhì)激素治療；②患有囊性纖維化、阿司匹林耐受不良、腫瘤、免疫缺陷或其他遺傳性疾病。本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者知情同意。

1.1.2 試劑與儀器 愛先藍-糖原染色（AB-PAS染色）試劑盒（珠海貝索生物技術有限公司）；兔抗人-AGR2單克隆抗體、兔抗人-MUC5AC單克隆抗體（英國Abcam 公司）；即用型免疫組化SP試劑盒（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）；TRIzol 試劑（北京索萊寶科技有限公司）；RT-PCR 試劑盒（RR820A，日本TaKaRa 公 司）；RT-PCR 引 物（AGR2、MUC5AC、GAPDH，上海生工）；PCR 儀（ABI7500，美國Applied Biosystems 公司）；醫(yī)學圖像采集系統(tǒng)（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 HE 染色 將甲醛固定的標本常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片（4 μm），各標本4~6 張切片。取2 張切片脫蠟至水，蘇木精染色10 min，沖洗，伊紅染色5 min，脫水透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察鼻黏膜上皮及黏膜下腺體病理變化，采集圖像分析。

1.2.2 AB-PAS 染色 將所用標本常規(guī)脫水，包埋，切片，烘干，脫蠟至水，蒸餾水清洗，行AB-PAS染色（先用AB染液染15 min，水洗，高碘酸溶液氧化10 min，蒸餾水沖洗，雪夫試劑染10 min，流水沖洗；蘇木素染核2 min，流水沖洗，脫水透明，中性樹膠封片）。光學顯微鏡下觀察酸性黏蛋白MUC陽性表達及分布（主要為藍色區(qū)域），圖像采集分析，400 倍視野下隨機選取5處不重疊的著色視野進行觀察，最后在同一條件下采用Image Pro Plu 6.0 軟件測定陽性染色區(qū)域累積光密度（integrating optical density，IOD）與黏膜上皮總面積（Area）百分比，即平均光密度（IOD/Area）。

1.2.3 IHC 檢測 將石蠟切片烘干，按順序進行常規(guī)脫蠟水洗，枸櫞酸鈉抗原修復，嚴格按照SP 試劑盒說明書阻斷過氧化物酶，加入非特異性染色阻斷劑，滴加一抗（兔抗人-AGR2 單克隆抗體1∶300、兔抗人-MUC5AC 單克隆抗體1∶500），每片滴加 30 μl抗體37 ℃孵育60 min，PBS 沖洗，加二抗（羊抗兔抗體 1∶100）37 ℃孵育 20 min，PBS 沖洗后 DAB 顯色，顯微鏡下觀察染色至適度時終止。蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，脫水封片，常規(guī)光鏡下分別觀察AGR2和MUC5AC 陽性表達（AGR2 蛋白陽性信號定位于細胞質(zhì)，呈棕褐色；MUC5AC 陽性細胞為黃色或棕黃色顆粒）。400 倍視野下隨機選取5處不重疊的著色視野進行觀測，Image Pro Plus 6.0 軟件統(tǒng)一條件下測定陽性染色（AGR2 和MUC5AC）區(qū)域平均光密度（IOD/Area）。

1.2.4 qRT-PCR 將組織剪碎研磨，TRIzol 試劑提取總RNA，RNA 逆轉(zhuǎn)錄，嚴格按照試劑盒20μl PCR反應體系實驗步驟進行PCR 反應，以GAPDH 為內(nèi)參，2?ΔΔCt計算人鼻腔鼻竇黏膜中 AGR2 與 MUC5AC相對表達，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primers sequences

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS26.0 軟件和Graph-Pad Prism 9.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以表示；對非正態(tài)分布數(shù)據(jù)進行非參數(shù)Kruskal-Wallis H 檢驗和Mann-WhitneyU檢驗，兩變量相關性分析采用Spearman 秩相關檢驗，雙側(cè)顯著性水平α 為0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料 45 例入組患者年齡、性別資料如表2，三組患者性別、年齡特征差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），因此可排除因性別及年齡對實驗結果的影響。

表2 三組患者性別及年齡差異比較Tab.2 Comparison of gender and age differences among three groups of patients

2.2 HE染色及AB-PAS染色結果

2.2.1 HE 染色 光學顯微鏡下正常組黏膜上皮可見假復層纖毛柱狀上皮，CRSsNP組和CRSwNP組患者鼻黏膜上皮明顯增厚，杯狀細胞明顯增生，其中有漿細胞、淋巴細胞及嗜酸性粒細胞等炎癥細胞浸潤（圖1）。

2.2.2 AB-PAS 染色 所有患者酸性MUC 廣泛表達于鼻黏膜上皮杯狀細胞，呈較強藍色，其中CRSsNP 和CRSwNP 患者上皮MUC 平均光密度百分比均顯著高于正常對照組（P<0.05），而兩者陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖1、表3）。

2.3 IHC結果

2.3.1 MUC5AC 染色結果 光學顯微鏡下發(fā)現(xiàn)MUC5AC 在 CRSsNP 組和 CRSwNP 組黏膜上皮染色較多，主要位于杯狀細胞的細胞質(zhì)，呈淺黃色或棕黃色顆粒，較對照組明顯增多（P<0.05），但兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖1、表3）。

2.3.2 AGR2 染色結果 光學顯微鏡下觀察到AGR2主要定位于CRSsNP或CRSwNP黏膜上皮細胞的細胞質(zhì)，呈棕黃或棕褐色顆粒，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但 CRSsNP 和 CRSwNP兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖1、表3）。

表3 3 組鼻黏膜組織 MUC、MUC5AC 和 AGR2 IOD/Area比較（）Tab.3 Comparison of IOD/Area of MUC，MUC5AC and AGR2 in three groups of nasal mucosa（）

表3 3 組鼻黏膜組織 MUC、MUC5AC 和 AGR2 IOD/Area比較（）Tab.3 Comparison of IOD/Area of MUC，MUC5AC and AGR2 in three groups of nasal mucosa（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05.

AGR2 3.76±1.95 20.26±2.971）23.87±6.381）Groups Control CRSsNP CRSwNP MUC 3.98±1.74 14.70±2.851）17.01±3.621）MUC5AC 2.78±1.34 16.18±5.881）19.60±4.261）

圖1 各組組織黏膜病理染色情況（×400）Fig.1 Pathological staining of tissue mucosa in each group（×400）

2.4 qRT-PCR 結果 qRT-PCR 檢測結果表明，所有病例均檢測到AGR2 和MUC5AC mRNA 表達。CRSsNP 組和 CRSwNP 組 AGR2 和 MUC5A mRNA 表達較正常對照組顯著升高（均P<0.05）。CRSsNP 和CRSwNP 兩組間 AGR2 和 MUC5AC mRNA 水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖2）。

圖2 正常鼻黏膜、CRSsNP 組鼻黏膜和NP組織MUC5AC、AGR2 mRNA表達比較Fig.2 Comparison of mRNA expressions of MUC5AC and AGR2 in normal nasal mucosa，CRSsNP group and NP tissue

2.5 CRSsNP 組 和 CRSwNP 組 AGR2、MUC5AC RNA 表達相關性分析 CRSsNP 組和 CRSwNP 組AGR2 和MUC5AC mRNA 表達均呈正相關（r=0.68、0.73，P<0.05），進一步提示AGR2 表達上調(diào)可能促進MUC5AC產(chǎn)生。

3 討論

CRS 屬于鼻-鼻竇黏膜的一種慢性炎癥性疾病，鼻腔屏障功能、黏液纖毛清除、模式識別受體等先天免疫機制失調(diào)及嗜酸性粒細胞、肥大細胞和先天淋巴樣細胞等先天免疫細胞可能參與CRS 發(fā)?。?8］。研究表明CRSwNP 特征為息肉和嗜酸性炎癥浸潤，而CRSsNP 特征為與中性粒細胞聚集、組織重塑和纖維化相關的非嗜酸性炎癥［19］。CRS的中心是失調(diào)的持續(xù)性炎癥，這種炎癥可能由先天免疫機制和獲得性免疫機制共同維持。先天免疫系統(tǒng)不依賴于先前的暴露，并提供最初的炎癥抗菌反應。上皮細胞層通過物理屏障功能、黏液分泌及黏液-纖毛清除對鼻腔先天免疫有很大貢獻［18，20］。

觀察到在HE 染色及AB-PAS 染色中，CRSsNP和CRSwNP兩組與正常對照組相比鼻黏膜上皮明顯增厚，杯狀細胞大量增生，MUC 過度分泌。黏液主要來源于杯狀細胞，MUC5AC 是黏液的主要蛋白成分，是宿主抵抗吸入性病原體的第一道防線［21］。但病理條件下，各種急、慢性炎癥刺激可增加產(chǎn)生黏液的杯狀細胞數(shù)量和活性，引起MUC過度表達和黏液高分泌，影響氣道內(nèi)正常的黏液-纖毛轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和天然免疫功能，從而導致慢性鼻引流障礙和鼻塞，嚴重影響CRS 患者生活質(zhì)量［21-22］。因此，黏蛋白高分泌的分子機制研究非常重要。

AGR2 是一種胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticu?lum，ER）蛋白，屬于伴侶蛋白二硫鍵異構酶家族（protein disulfide bond isomerase，PDI），可促進分泌途徑蛋白折疊等［23］。ZHEN 等［24］通過序列比較發(fā)現(xiàn)AGR2 具有蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶活性，可利用硫氧還原蛋白樣結構域中的活性位點促進通過ER 錯誤折疊的底物蛋白中二硫鍵重排，而多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵正確形成對穩(wěn)定分泌蛋白、膜蛋白等天然構象非常重要。近年越來越多研究證實，AGR2 與氣道黏液分泌相關，CHEN 等［23］通過免疫共沉淀研究發(fā)現(xiàn)，黏液化生過程中AGR2 能夠誘導啟動未成熟黏蛋白鏈內(nèi)和鏈間的二硫鍵重排進而形成穩(wěn)定的分泌蛋白，此外MUC成熟還要通過一系列翻譯后修飾促進ER 未成熟黏蛋白折疊和多聚化，這些都需要 AGR2 參與。SCHROEDER 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠肺組織中AGR2 基因表達明顯上調(diào)，而AGR2基因缺陷的哮喘小鼠MUC5AC 表達明顯下調(diào)，提示AGR2 在氣道MUC5AC 加工過程中起直接作用，參與哮喘氣道黏液高分泌調(diào)控［25-26］。本研究發(fā)現(xiàn)，CRS患者鼻黏膜上皮細胞、杯狀細胞和黏膜下腺體中AGR2 和MUC5AC 蛋白及mRNA 表達均顯著上調(diào)，且兩者存在明顯相關性，提示AGR2 可能參與CRS黏液高分泌調(diào)控，擴大了對CRSwNP 病理生理學的理解。

天然免疫效應細胞包括樹突狀細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞等，可能參與CRS 病理生理過程。樹突狀細胞吞噬淋巴細胞并向淋巴細胞呈遞抗原，有助于調(diào)節(jié)性T 細胞及B 細胞分泌表型［27］。西方人群中持續(xù)的 T 輔助細胞 2（Th2）偏斜的炎癥狀態(tài)與CRSwNP 有關，而在Th2 偏斜炎癥中，Th2 淋巴細胞是 IL-4、IL-5 和 IL-13 的主要來源，其中IL-5招募嗜酸性粒細胞聚集，IL-13作用于上皮誘導黏液分泌［28］。最新研究顯示，IL-13和表皮生長因子受體信號通路均是黏液產(chǎn)生所必需的，這些信號通路對不同類型黏液產(chǎn)生細胞有不同調(diào)節(jié)作用［24］。研究發(fā)現(xiàn)，IL-13 誘導下 SPDEF 可激活 AGR2基因啟動子，增加MUC5AC 基因表達和蛋白產(chǎn)量，而特異性敲除SPDEF 基因，MUC5AC 表達明顯降低，說明AGR2 誘導MUC5AC 合成的過程依賴于SPDEF 調(diào)控［29-30］。2013 年，ZHOU 等［31］研究發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠肺組織中AGR2蛋白上調(diào)與MUC5AC蛋白和IL-13 表達顯著相關，且發(fā)現(xiàn)地塞米松可下調(diào)AGR2 蛋白表達，改善MUC5AC 介導的黏液高分泌。2019 年，XU 等［26］在低氧小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，AGR2 可通過增加HIF-1α 穩(wěn)定性，缺氧誘導的氣道MUC5AC高分泌中起關鍵調(diào)節(jié)作用，因此AGR2 可能成為治療缺氧誘導的氣道高分泌的潛在靶點。

綜上，黏蛋白過度產(chǎn)生除與AGR2 表達上調(diào)有關外，還有多種調(diào)控因子參與。因此，AGR2 及其上游信號通路可能是與鼻黏蛋白高分泌相關炎癥和修復過程的重要調(diào)節(jié)物。本研究證明了AGR2 和MUC5AC 在CRS 中高表達，且兩者呈一定正相關，可能為黏液高分泌疾病發(fā)病機制提供新的方向，為未來CRS 黏液高分泌的靶向治療提供新的思路。而有關AGR2及其上游信號通路如何調(diào)控CRS患者黏蛋白過度分泌仍需進一步探討。