miR-107基因多態(tài)性及其表達(dá)與缺血性腦卒中的相關(guān)性研究①

黃艷云 雷 茗 譚 曇 劉純宏 王 艷 韋葉生 （百色市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，百色 533000）

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見腦血管疾病。其缺乏有效的早期診斷或者早期預(yù)警方法、治療時間窗短、預(yù)后差等問題，給臨床診療帶來了重大難題。尋找一種特異性強(qiáng)、敏感性高和穩(wěn)定性好的血清標(biāo)志物用于IS 的早期診斷、預(yù)后評估及療效監(jiān)測，成為全世界腦血管疾病領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)［1］。miR-107 即是目前備受關(guān)注的熱點(diǎn)之一。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，miR-107 作為轉(zhuǎn)錄后基因沉默的重要調(diào)節(jié)因子，在IS 患者的血漿或動物模型腦組織中異常表達(dá)，并通過多種作用機(jī)制參與IS 的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后，有望成為IS 早期診斷、預(yù)后判斷的潛在性生物標(biāo)記物和治療靶標(biāo)［2-5］。然而，miR-107 在 IS 這一疾病中異常表達(dá)的分子機(jī)制尚不清楚。大量研究已證實(shí)，miRNA 單核苷酸多態(tài)性與人類許多疾病的遺傳易感性相關(guān)，并影響miRNA 在疾病中的表達(dá)［6-7］。已有多項研究顯示，多種miRNA 單核苷酸多態(tài)性與IS 易感性相關(guān)，并影響自身在IS 中的表達(dá)［8-9］。有研究報道，miR-107 基因rs2296616 位點(diǎn)多態(tài)性與中國漢族人群胃腺癌的易感性和預(yù)后相關(guān)，并影響miR-107 在胃腺癌組織中的表達(dá)［10］。然而，截至目前，國內(nèi)外尚未查閱到有關(guān)miR-107 基因rs2296616 位點(diǎn)多態(tài)性與IS遺傳易感性方面的文獻(xiàn)報道，rs2296616位點(diǎn)多態(tài)性是否影響miR-107在IS中的表達(dá)調(diào)控也尚不清楚。因此，本課題組選擇miR-107 基因中具有多態(tài)性且已經(jīng)被報道與疾病相關(guān)的rs2296616 位點(diǎn)進(jìn)行研究。本研究將在廣西人群中探討miR-107基因rs2296616 位點(diǎn)多態(tài)性與IS 的遺傳易感性，并分析rs2296616 位點(diǎn)多態(tài)性與miR-107 表達(dá)的相關(guān)性，以期為廣西人群篩選出IS 的遺傳易感基因及其基因型，從而對高危人群進(jìn)行早期預(yù)防和早期干預(yù)，降低廣西人群IS的發(fā)病率。

1 資料與方法

1.1 資料 收集 2017 年 10 月至 2018 年 11 月右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院確診的IS 患者349 例。IS 診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會制訂的《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》。經(jīng)臨床、實(shí)驗(yàn)室及射影像學(xué)等檢查綜合確立IS 診斷。將同期在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心按性別、年齡匹配原則收集的372 例健康體檢者作為對照組，均體健且無心腦血管疾病史。所納入的研究對象均已排除腦出血、顱內(nèi)感染、各系統(tǒng)惡性腫瘤、血液病、自身免疫性疾病、感染性疾病以及嚴(yán)重的肝臟、腎臟、心臟等疾病。所有研究對象均為無血緣關(guān)系的廣西人群。本研究方案是在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)下實(shí)施，研究對象均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集所有受試者清晨空腹靜脈血 3~5 ml，以 EDTA-K2抗凝，用于基因組 DNA 抽提和單個核細(xì)胞的分離。另抽取3~5 ml 靜脈血，離心分離血清，用于血脂檢測。所有樣本保存于?70 ℃冰箱備用。

1.2.2 基因組DNA 提取和分析 統(tǒng)一使用深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供的全血DNA 快速提取試劑盒從白細(xì)胞中提取基因組DNA（嚴(yán)格按照說明書操作）。采用1%瓊脂糖對提取完成后的DNA 樣本（1 μl）進(jìn)行電泳，以檢測其質(zhì)量和估計其濃度。根據(jù)估計濃度將DNA樣本稀釋到工作濃度5~10 ng/μl，沒有明顯DNA條帶的樣本則不稀釋。

1.2.3 引物的設(shè)計與合成 通過NCBI 查找包含rs2296616 位點(diǎn)的適宜長度DNA 片段，將查找到的DNA 序列輸入Prime 3.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計，得到的引物序列委托上海天昊生物科技有限公司合成。rs2296616 位點(diǎn)正向引物序列為5'-ACACAGCTTTCACCGGGTTGAG-3'；反向引物序列為5'-TGCCTGAGGACGATTTTGAACA-3'，延伸引物序列為5'-TTTTTTTTTTTGGCTCCATTGCTCGGATGTG-3'。

1.2.4 多重SNa Pshot 技術(shù)檢測rs2296616 位點(diǎn)多態(tài)性 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為正反向引物各1.0 μl，1×GC-Ⅰ緩沖液（TaKaRa）2.0 μl，dNTPs 2 μl，1 U TaqDNA 聚合酶 1 μl，DNA 模板 1 μl，加雙蒸水至總體積 20 μl。PCR 產(chǎn)物采用 2 U 的核酸外切酶Ⅰ（EXOⅠ，Epicentre）和5 U 蝦堿基磷酸酶（SAP，Pro?mega）純化后使用 SNaPshotMultiplex Kit（ABI）進(jìn)行延伸反應(yīng)。延伸產(chǎn)物用1 U SAP 純化后使用ABI3730X測序儀進(jìn)行測序，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。使用Gene-Mapper 4.1（Applied Biosystems Co.Ltd.，USA）分析原始測序數(shù)據(jù)。

1.2.5 外周血單個核細(xì)胞中miR-107 表達(dá)水平的檢測 采用Trizol 法提取外周血單個核細(xì)胞的總RNA，提取產(chǎn)物置紫外分光光度計260 nm 和280 nm處檢測吸光度值（OD），計算OD260/OD280以評估RNA樣品的純度，若比值為1.8~2.0 則RNA 樣品純度符合實(shí)驗(yàn)要求。采用寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行基因mRNA 表達(dá)量的檢測。通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒（miR-X miRNA First-Strand Synthesis Kit，TaKaRa）將 RNA 合成為 cDNA，最后按照 cDNA 2 μl、SYBR Advantage Premix 12.5 μl、正向和反向引物各0.5 μl、ROX Dye 0.5 μl、去離子水9 μl 的體系進(jìn)行PCR 反應(yīng)。根據(jù)相對定量分析——2?ΔΔCt法，比較IS組和對照組外周血單個核細(xì)胞中miR-107的表達(dá)差異，并分析rs2296616 位點(diǎn)多態(tài)性對基因表達(dá)的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。在IS 組和對照組中采用χ2檢驗(yàn)分析rs2296616 的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。計數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，計量資料需先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布則應(yīng)用t檢驗(yàn)或方差分析，不服從正態(tài)分布則應(yīng)用秩和檢驗(yàn)，并以表示。病例組和對照組間基因型、等位基因以及遺傳模型的比較采用二元Logistic 回歸分析，以優(yōu)勢比（OR）和 95% 可 信 區(qū) 間（CI）評 估 miR-107 基 因rs2296616 位點(diǎn)多態(tài)性與IS 易感性的相關(guān)性，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象相關(guān)臨床資料的比較 本研究共納入研究對象721例，其中IS組349例，男224例，女 125 例，年齡（61.5±12.2）歲，對照組 372 例，男240例，女132例，年齡（59.9±13.4）歲。兩組研究對象的平均年齡和性別構(gòu)成比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（分別為P=0.098 和P=0.926）。IS 組患者的血清總膽固醇（TCH）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、極低密度脂蛋白膽固醇（VLDL-C）以及甘油三酯（TG）水平與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），見表1。

表1 研究對象的一般情況和臨床生化指標(biāo)的比較Tab.1 Comparison of general conditions and clinical bio?chemical indexes of study subjects

2.2 miR-107 基因rs2296616 多態(tài)性的分型結(jié)果rs2296616 在病例組中存在 AA、AG 和 GG 三種基因型，在對照組中存在AA 和AG 兩種基因型，DNA 測序法的檢測結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了SNaPshot SNP 分型檢測的結(jié)果，測序結(jié)果如圖1所示。

圖1 miR-107基因rs2296616位點(diǎn)測序圖Fig.1 Sequencing map of miR-107 gene rs2296616

2.3 miR-107 基因rs2296616 多態(tài)性在兩組中的遺傳平衡評估 在IS組和對照組中，rs2296616位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（P>0.05），說明所選研究樣本來自同一孟德爾群體，能夠反映rs2296616 在目標(biāo)人群中的分布情況，適合進(jìn)行遺傳學(xué)統(tǒng)計分析。結(jié)果見表2。

表2 rs2296616 多態(tài)性在兩組中的Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)Tab.2 Hardy-Weinberg genetic balance test of rs2296616 polymorphism in two groups

2.4 miR-107 基因rs2296616 多態(tài)性在兩組不同性別間的比較 結(jié)果如表3 所示，rs2296616 位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布在IS 組和對照組男、女不同性別間的比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 rs2296616多態(tài)性在IS組和對照組性別間的比較［例（%）］Tab.3 Comparison of rs2296616 polymorphisms between genders in IS group and control group［n（%）］

2.5 miR-107 基因 rs2296616 多態(tài)性與 IS 的遺傳易感性分析 以AA 基因型為參照，rs2296616 位點(diǎn)的AG 和GG 基因型在IS 組和對照組中的分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；以A 等位基因?yàn)閰⒄?，G 等位基因在兩組中的分布差異也無統(tǒng)計學(xué)意義；在顯性模型、隱性模型和超顯性模型中也均未發(fā)現(xiàn)rs2296616 位點(diǎn)的基因型頻率在兩組間的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義。納入IS 的常見風(fēng)險因素如年齡、性別、高血壓、糖尿病、TCH、HDL-C、LDL-C、VLDL-C 及TG 進(jìn)行二元Logistic 回歸校正計算后，rs2296616 位點(diǎn)基因型和遺傳模型的頻率在IS 組和對照組中的分布差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

表4 miR-107基因rs2296616多態(tài)性與IS的遺傳易感性分析Tab.4 Genetic susceptibility analysis between miR-107 gene rs2296616 polymorphism and IS

2.6 miR-107 表達(dá)水平與rs2296616 多態(tài)性的相關(guān)性分析 基因表達(dá)檢測結(jié)果顯示，miR-107 在IS 組患者外周血單個核細(xì)胞中的表達(dá)水平是對照組的（2.03±1.14）倍，顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），如圖 2A 所示。但在 IS 組中，rs2296616 位點(diǎn)AA 基因型與AG/GG 基因型之間miR-107 表達(dá)水平的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，如圖2B所示。

圖2 miR-107 在IS 組和對照組中的表達(dá)及其與rs2296616多態(tài)性的關(guān)系Fig.2 Expression of miR-107 in IS group and control group and its relationship with rs2296616 polymor?phism

3 討論

IS 是一種發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜的多發(fā)性腦血管疾病。盡管人類對IS 發(fā)病機(jī)制的探索從未停止，但其病因?qū)W至今始終未被完全闡明?，F(xiàn)階段的觀點(diǎn)普遍認(rèn)為傳統(tǒng)風(fēng)險因素（如高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、吸煙和飲酒等）是IS 的外因，遺傳因素是IS的內(nèi)因［11］。外因影響內(nèi)因，內(nèi)因通過外因起作用。單獨(dú)或者雙重暴露于傳統(tǒng)風(fēng)險因素和遺傳因素下的高危人群發(fā)生IS 的風(fēng)險要明顯高于普通人群。當(dāng)前，針對傳統(tǒng)風(fēng)險因素的預(yù)防和早期干預(yù)使得IS的防治工作取得了一定的成效。但對遺傳因素在IS 中作用機(jī)制的了解還只是冰山一角，限制了遺傳因素在IS 防治工作中的應(yīng)用。因此，開展基因與IS的相關(guān)性研究對推動IS的防治工作具有重要意義。

眾所周知，動脈粥樣硬化是IS 發(fā)生的高危風(fēng)險因素，而高脂血癥是動脈粥樣硬化的重要誘發(fā)因素。高脂血癥一般以成人空腹12~14 h 血清TG 超過1.70 mmol/L、TCH超過5.72 mmol/L為診斷標(biāo)準(zhǔn)。大量流行病學(xué)調(diào)查證明，高TG 是動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險因素［12-13］；膽固醇升高，尤其是血漿LDL、VLDL 水平持續(xù)升高與動脈粥樣硬化的發(fā)病率呈正相關(guān)［14-15］。相反，HDL 可通過膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制清除動脈壁的膽固醇，將其轉(zhuǎn)運(yùn)至肝代謝并排出體外［16］。此外，HDL 有抗氧化作用，防止LDL 氧化，并可通過競爭性抑制阻抑LDL 與內(nèi)皮細(xì)胞的受體結(jié)合而減少其攝取，因此，HDL 有抗動脈粥樣硬化作用［17］。由此可見，血脂水平與IS 的發(fā)生息息相關(guān)。本研究也觀察到，IS 組患者的血清TCH、TG、LDL-C和VLDL-C 水平顯著高于對照組，HDL-C 水平顯著低于對照組，提示血脂水平與IS 的風(fēng)險相關(guān)，與IS的許多既往研究結(jié)果是一致的［11，18］。因此，檢測并比較病例對照組的血脂水平，將有助于在分析基因多態(tài)性與IS 易感性的相關(guān)性時校正其對統(tǒng)計結(jié)果的影響。

越來越多的證據(jù)表明，基因多態(tài)性與IS 的易感性相關(guān)，并已有項目應(yīng)用于臨床中，例如，亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性用于IS 易感性的預(yù)測［19-20］。早期關(guān)于基因多態(tài)性與IS的相關(guān)性研究主要集中在編碼蛋白的基因上。隨著對非編碼miRNA的發(fā)現(xiàn)以及人們對其結(jié)構(gòu)和功能的深入認(rèn)識，人們發(fā)現(xiàn)miRNA 單核苷酸多態(tài)性影響成熟miRNA 的表達(dá)，并影響自身結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，進(jìn)而對靶mRNA 的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生全局性影響，導(dǎo)致人類許多疾病的發(fā)生［6-7］。miRNA 單核苷酸多態(tài)性與 IS 的相關(guān)性研究逐漸受到重視，成為IS 新的診療方向。目前，已有多種miRNA 單核苷酸多態(tài)性被檢測出與地域性IS的遺傳易感性有關(guān)［9，21-22］。在不同地區(qū)、種族人群中探討同一miRNA 基因多態(tài)性與IS 易感性的關(guān)系或許能為我們解答為何IS 的發(fā)病率呈現(xiàn)地域性、種族性差異的原因［23］，或許還能發(fā)現(xiàn)miRNAs在IS 中異常表達(dá)的分子機(jī)制。本課題組前期的研究結(jié)果顯示，miR-107 基因rs2296616 位點(diǎn)多態(tài)性在不同種族、地區(qū)人群間存在明顯的差異［24］。本研究分析了廣西人群miR-107 基因rs2296616 位點(diǎn)多態(tài)性與IS 發(fā)病的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)無論是否校正混雜因素的影響，這個多態(tài)性位點(diǎn)的基因型、等位基因、顯性模型（GG+AGvsAA）、隱性模型（GGvsAA+AG）和超顯性模型（GG+AAvsAG）在病例對照組中的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示廣西人群miR-107 基因rs2296616位點(diǎn)多態(tài)性與IS發(fā)病可能不存在相關(guān)性。

已有多項研究顯示，miR-107 有望成為IS 早期診斷、預(yù)后判斷的潛在性新型生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。有研究報道，與健康對照組相比，IS 組患者血漿中的miR-107 水平顯著提高了2.78 倍，并與卒中嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示循環(huán)中的miR-107 可作為潛在的新型非侵入性生物標(biāo)記物用于IS 的診斷［2］；另有研究報道，miR-107 水平在局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠的腦組織和血漿中升高，并通過抑制谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1 表達(dá)而增加缺血性中風(fēng)后谷氨酸的累積，其血漿水平可作為監(jiān)測IS 患者興奮性毒性的新型生物標(biāo)志物［4］；LI 等［5］發(fā)現(xiàn)，miR-107 在大鼠永久性中腦動脈閉塞后的缺血邊界區(qū)中強(qiáng)烈表達(dá)，并通過下調(diào)Dicer-1 促進(jìn)中風(fēng)后的血管生成，提示miR-107可作為中風(fēng)的治療靶標(biāo)。本次研究結(jié)果也顯示，IS 組患者外周血單個核細(xì)胞中miR-107 表達(dá)水平是對照組的（2.03±1.14）倍，顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究結(jié)果與前述報道的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步支持miR-107 作為IS 診斷的潛在性新型生物標(biāo)志物。然而，在分析rs2296616多態(tài)性與miR-107 表達(dá)水平之間的相關(guān)性時發(fā)現(xiàn)，rs2296616 多態(tài)性與IS 患者外周血單個核細(xì)胞中miR-107 的表達(dá)水平不存在相關(guān)性，提示rs2296616多態(tài)性對miR-107 的表達(dá)可能不具有調(diào)節(jié)作用，miR-107 在IS 中異常表達(dá)可能是其他發(fā)病機(jī)制所引起。

綜上所述，本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miR-107 的表達(dá)水平在IS 患者外周血單個核細(xì)胞中呈升高狀態(tài)，支持miR-107 作為IS 診斷的潛在性新型生物學(xué)標(biāo)志物。但是，miR-107 基因rs2296616 位點(diǎn)多態(tài)性與IS 的發(fā)生可能不存在關(guān)聯(lián)性，且對miR-107 的表達(dá)也可能不具有調(diào)節(jié)作用。當(dāng)然，由于樣本量相對較小、研究對象來源單一（選擇偏倚不可避免）、未對IS 患者進(jìn)行亞型分組以及缺乏基因與傳統(tǒng)風(fēng)險因素交互作用的研究等，使本研究存在一定的局限性。此外，由于基因多態(tài)性在不同種族和地理人群間存在差異性［25］，本研究對象僅局限于中國廣西地區(qū)人群，該結(jié)果可能不適用于其他種族人群，而且目前國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)其他地區(qū)人群miR-107基因多態(tài)性與IS 遺傳易感性研究的文獻(xiàn)報道，缺乏多地區(qū)人群的數(shù)據(jù)比對，miR-107 基因多態(tài)性是否與IS 的發(fā)病存在相關(guān)性仍需要更多地區(qū)、更大數(shù)據(jù)和更多方面的進(jìn)一步研究來求證。