調(diào)控γδT細(xì)胞受體對(duì)腦缺血再灌注小鼠Treg及細(xì)胞因子的影響①

劉宏為 李冶秋 王 勇 朱宏飛 （天門市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天門 431700）

心臟驟停（cardiac arrest，CA）是嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病之一，雖然快速有效的心肺腦復(fù)蘇（cardiopulmonary-cerebral resuscitation，CPCR）可減輕CA 的危害，但其病死率仍然很高，主要原因?yàn)槠鞴偃毖跞毖笤俟嘧p傷［1-4］。研究表明，大腦對(duì)缺血缺氧非常敏感，其損傷是CA 患者的主要死亡原因，67.7%院外和22.9%院內(nèi)CA 患者死亡由腦損傷所致，僅12.3%CA 患者在CPCR 后具有良好的神經(jīng)功能預(yù)后［5］。因此腦功能恢復(fù)是CPCR的關(guān)鍵。

近年T 細(xì)胞在心肌缺血/再灌注損傷中的作用逐漸被揭示，其缺失可減輕全腦缺血再灌注損傷［6］。γδT 細(xì)胞是一種作用介于固有免疫和適應(yīng)性免疫的T 細(xì)胞，其分泌的細(xì)胞因子IL-17A 可增加心肌梗死面積，但其在CPCR 后全腦缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中的作用研究較少［7］。本研究建立小鼠CPCR 模型，探究γδT 細(xì)胞受體拮抗劑對(duì)Treg 及相關(guān)細(xì)胞因子的影響，旨在為研究γδT 細(xì)胞受體在CPCR 后全腦缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 100 只SPF 級(jí)健康成年雄性C57BL/6 小鼠，7~9 周齡、體質(zhì)量 20~25 g（合格證號(hào)：11400700257295），購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［SCXK（京）2016-0006］。置于12 h 光/12 h暗（光照時(shí)間7：00~19：00）、（22±2）℃、（52±2）%濕度環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲食和飲水。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照國(guó)家相關(guān)法律及動(dòng)物倫理學(xué)要求在武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑及儀器 ELISA 試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（顯色法）、RIPA（強(qiáng)）組織細(xì)胞快速裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）、PBS磷酸鹽緩沖液購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司；甲醛、無水乙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、TEMED、過硫酸銨購(gòu)自美國(guó) Sigma；PVDF 膜、化學(xué)發(fā)光試劑、UPT 優(yōu)普特實(shí)驗(yàn)室超純水器購(gòu)自法國(guó)Millipore；小動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)自美國(guó)Harvard Apparatus；正置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica；移液器購(gòu)自法國(guó)Gilson；酶標(biāo)儀、洗板機(jī)購(gòu)自芬蘭Thermo Labsystems。

1.2 方法

1.2.1 CA-CPCR 模型構(gòu)建 小鼠麻醉后插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣，小鼠各項(xiàng)指標(biāo)維持如下標(biāo)準(zhǔn)10 min：直腸溫度（Trec）為（37.0±0.5）℃，呼吸末二氧化碳分壓（EtCO2）35~45 mmHg，心率（HR）>200 次/min，動(dòng)脈血壓（MAP）>60 mmHg，靜脈注射70 μl 0.5 mol/L（4 ℃）KCl，關(guān)閉呼吸機(jī)誘導(dǎo)小鼠CA，心電圖活動(dòng)停止且動(dòng)脈血壓迅速下降至<10 mmHg即為誘導(dǎo)成功。經(jīng)過6 min 的CA 后，手動(dòng)進(jìn)行CPCR（胸外按壓，約300次/min），靜脈注射0.5 ml腎上腺素（生理鹽水溶解，16μg/ml），重新以190次/min機(jī)械通氣，胸部按壓根據(jù)MAP和EtCO2調(diào)整，如小鼠2.5 min 內(nèi)未恢復(fù)自主循環(huán)及呼吸則宣布失敗。MAP<50 mmHg 時(shí)，靜脈注射0.1~0.2 ml 腎上腺素生理鹽水溶液（16μg/ml）；自主呼吸恢復(fù)至60次/min后45 min 停止呼吸機(jī)，拔除氣管導(dǎo)管及各種導(dǎo)管并對(duì)傷口進(jìn)行閉合處理，放回籠中飼養(yǎng)。

1.2.2 神經(jīng)功能評(píng)分 小鼠蘇醒后參照LONGA等［8］5 分制法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。0 分：無神經(jīng)功能缺損體征；1 分：左側(cè)前肢不能完全伸展；2 分：大鼠行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3 分：大鼠行走時(shí)身體向左側(cè)傾倒；4 分：意識(shí)喪失，不能自發(fā)行走。分值越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重，其中1~3分者為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，因麻醉未清醒和經(jīng)解剖證實(shí)為蛛網(wǎng)膜下腔出血者不計(jì)入實(shí)驗(yàn)組。

1.2.3 分組及處理 實(shí)驗(yàn)共分為3 組：對(duì)照組（無CA/CPCR 組）、CPCR組（誘發(fā)CPCR后全腦缺血再灌注損傷）；CPCR+γδT細(xì)胞受體拮抗組（CPCR 處理后立即腹腔注射γδT 細(xì)胞受體拮抗藥物UC7-13D5，250 μg，2 d），每組 30 只，對(duì)照組及 CPCR 組腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.4 小鼠動(dòng)脈血收集 放血處死小鼠后快速斷頭取腦，去除嗅球、小腦及腦干等，留取大腦，各組取部分腦組織固定，進(jìn)行病理學(xué)檢查、免疫組織化學(xué)檢查和神經(jīng)元凋亡檢查，其余腦組織?70 ℃凍存待檢。

1.2.5 TUNEL 凋亡檢測(cè)腦組織損傷 參照試劑盒說明書進(jìn)行：取1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm 組織塊，置于10%甲醛固定48 h，流水沖洗并逐級(jí)脫水，移入石蠟液中包埋，置于?20 ℃冰箱中30 min 以上切片，TUNEL 檢測(cè)液處理樣品，PBS 沖洗 3 次，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，光鏡下檢查，顯微鏡拍照，Lecia Applaction Stiue圖像系統(tǒng)分析樣本相關(guān)部位。

1.2.6 HE 染色觀察神經(jīng)元損傷 切片，水浴展片，撈片，將切片小心貼附于載玻片，染色：常規(guī)脫蠟，水洗1~2 min，蘇木精染色3~6 min，流水洗去蘇木精1~2 min，1%鹽酸乙醇處理1~3 s，水洗1~2 s，促藍(lán)液返藍(lán)5~10 s，流水沖洗15~30 s，0.5%伊紅染色2~3 min，蒸餾水洗 1~2 s，80%乙醇清洗 15~30 s，95%乙醇清洗15~30 s，無水乙醇清洗1~2 s，二甲苯清洗2~3 s，新的二甲苯清洗2~3 s，中性樹膠封固，顯微鏡拍照，Lecia Applaction Stiue 圖像系統(tǒng)采集分析樣本相關(guān)部位。

1.2.7 ELISA 測(cè)定 MPO、TNF-α、IL-6 和 IL-1β 濃度 ELISA 試劑盒檢測(cè) TNF-α、IL-6、IL-1β 濃度及MPO活性，按試劑盒使用說明書操作。

1.2.8 Western blot 檢測(cè)腦組織Foxp3 蛋白表達(dá)將組織剪成細(xì)小碎片，按每20 mg 組織加入150~250μl 裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑），勻漿至完全裂解，4 ℃、12 000 g 離心 15 min，取上清，按 BCA 試劑說明書進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，?80 ℃貯存。配制12%SDS-PAGE膠，根據(jù)蛋白定量結(jié)果取所需蛋白，加入適量緩沖液，沸水浴 10 min 后離心取上清，20 μg/孔上樣，濃縮膠80 V、分離膠120 V 電泳，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。根據(jù)說明書稀釋一抗，按所需稀釋濃度將一抗加入封閉液中，與膜共同室溫孵育1 h，PBST 洗滌3次，5 min/次。根據(jù)用量按1∶10 000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育 1 h，PBST 洗滌 3 次，5 min/次，暗室中等量混勻ECL 發(fā)光液A、B，加在膜的正面與之充分接觸，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均采用表示。組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL 觀察腦組織損傷 CPCR 組小鼠腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞凋亡較對(duì)照組增多，CPCR+γδT 細(xì)胞受體拮抗組較CPCR組細(xì)胞凋亡減少（圖1）。

圖1 TUNEL檢測(cè)各組小鼠腦組織損傷Fig.1 Damage of in brain tissue of mice in each group detected by TUNEL

2.2 HE 染色觀察神經(jīng)元損傷 CPCR 組小鼠腦缺血灶中心區(qū)出現(xiàn)大量死細(xì)胞或細(xì)胞呈不規(guī)則狀態(tài)腫大，核膜破裂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，CPCR+γδT 細(xì)胞受體拮抗組較CPCR組病理學(xué)改變有所緩解（圖2）。

圖2 小鼠HE病理染色Fig.2 HE staining of mice pathology

2.3 腦組織MPO活性、TNF-α、IL-6和IL-1β濃度測(cè)定 ELISA 結(jié)果顯示，CPCR 組 MPO 活性、TNF-α、IL-6 和IL-1β 濃度較對(duì)照組升高（P<0.05），CPCR+γδT 細(xì)胞受體拮抗組較 CPCR 組 MPO 活性、TNF-α、IL-6和IL-1β濃度顯著下調(diào)（P<0.05，圖3）。

圖3 各組小鼠腦組織 MPO 活性、TNF-α、IL-6 和 IL-1β濃度Fig.3 Activity of MPO，concentrations of TNF-α，IL-6，IL-1β of mice in each group

2.4 Western blot 檢測(cè)腦組織Foxp3 蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，CPCR組Foxp3表達(dá)較對(duì)照組顯著下調(diào)（P<0.05），CPCR+γδT 細(xì)胞受體拮抗組較CPCR組Foxp3表達(dá)上調(diào)（P<0.05，圖4）。

圖4 各組小鼠Foxp3表達(dá)Fig.4 Expression of Foxp3 of mice in each group

3 討論

CA 導(dǎo)致的腦缺血再灌注損傷會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成較大傷害，患者可能出現(xiàn)意識(shí)或警覺性降低、記憶缺失、運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)和癲癇發(fā)作等輕微癥狀，嚴(yán)重者可發(fā)展為腦死亡［8］。國(guó)內(nèi)外對(duì)CPCR 后全腦缺血再灌注損傷的研究多數(shù)集中于氧化應(yīng)激、炎癥介質(zhì)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡及鈣超載等方面［9-10］。近年研究顯示T 細(xì)胞在腦缺血再灌注損傷中也有重要作用［6］。本研究顯示，CPCR 組小鼠腦缺血灶中心區(qū)出現(xiàn)大量死細(xì)胞或細(xì)胞呈不規(guī)則狀態(tài)腫大，核膜破裂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，CPCR+γδT細(xì)胞受體拮抗組較CPCR組病理學(xué)改變有所減輕，且細(xì)胞凋亡減少，提示γδT細(xì)胞在CA腦缺血再灌注中起重要作用。

炎癥反應(yīng)是引發(fā)腦缺血再灌注損傷的重要原因，CA/CPCR 大鼠血清 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 濃度顯著升高，抑制炎癥反應(yīng)對(duì)CA/CPCR 術(shù)后腦損傷保護(hù)具有重要意義［11］。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β、IL-6 等細(xì)胞因子在Th17/γδT細(xì)胞功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用［12-13］。中性粒細(xì)胞為心肌缺血/再灌注損傷引起的炎癥反應(yīng)相關(guān)免疫細(xì)胞［14］。MPO 是炎癥標(biāo)志物，其活性可反映中性粒細(xì)胞的聚集程度［15-16］。Treg在心肌缺血/再灌注損傷中也發(fā)揮重要作用，可通過下調(diào)趨化因子減少嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)［17］。Foxp3 作為 Treg 的重要標(biāo)志因子，在Treg 發(fā)育、分化和功能維持等方面發(fā)揮重要作用［18-19］。TGF-β 誘導(dǎo)初始 T 細(xì)胞表達(dá) Foxp3，促使初始T 細(xì)胞分化為Foxp3+Treg，發(fā)揮免疫抑制作用，分泌抑制性細(xì)胞因子平衡Th17 細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子（如 IL-6、TNF-α）［20］。本研究表明，CPCR 組小鼠腦組織中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 等細(xì)胞因子濃度和MPO 活性均升高，F(xiàn)oxp3表達(dá)下調(diào)，提示CPCR 小鼠腦組織中存在嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，與病理觀察結(jié)果一致，經(jīng)γδT細(xì)胞受體拮抗劑處理后，TNF-α、IL-6 和IL-1β 等細(xì)胞因子濃度和MPO 活性均降低，F(xiàn)oxp3 表達(dá)上調(diào)，提示拮抗γδT 細(xì)胞受體可抑制CPCR 小鼠腦組織炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與Treg 分化為Foxp3+Treg，從而進(jìn)行免疫抑制有關(guān)。

綜上，本研究通過構(gòu)建CA-CPCR 后腦缺血再灌注小鼠模型，了解到拮抗γδT 細(xì)胞受體可抑制小鼠腦組織炎癥反應(yīng)，對(duì)Treg 分化具有間接調(diào)控作用，有助于機(jī)體調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答與免疫抑制反應(yīng)的平衡關(guān)系，進(jìn)而對(duì)CA-CPCR 導(dǎo)致的腦缺血再灌注損傷發(fā)揮一定改善作用，為臨床上降低CA-CPCR 后中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供了參考。