不同氧化/冷凍條件對乳清蛋白結構的影響

張 楠，楊 晨，張偉偉，張紫藝，夏大瑩，汪建明

(天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457)

乳清蛋白約占乳蛋白的20%，包括β–乳球蛋白、α–乳白蛋白、免疫球蛋白、血清白蛋白、乳鐵蛋白、糖巨肽以及酶和生物活性因子等[1]，常用于冷凍甜品及香腸等各類食品加工中[2]．由于在加工過程中受到許多促氧化劑及受光、熱等自然條件的影響，所以乳清蛋白非常容易被氧化，發(fā)生斷裂和交聯(lián)及形成碳中心自由基等變化，使其結構性質(zhì)發(fā)生改變．然而這并不是終點，如在冷凍甜品中，氧化后的乳清蛋白又在冷凍條件下進行貯藏、運輸，低溫誘導下冰晶的形成會進一步改變?nèi)榍宓鞍椎慕Y構及性質(zhì)，致使食品結構、質(zhì)地等發(fā)生變化[3]．因此，探究冷凍對氧化乳清蛋白結構和性質(zhì)的影響非常必要．

馬思麗等[4]研究不同羥自由基氧化體系強度下的牛肌原纖維蛋白結構，發(fā)現(xiàn)隨著過氧化氫濃度的增加，其羰基含量、二聚酪氨酸含量和表面疏水性指數(shù)逐漸增加，而總巰基含量和α–螺旋含量呈下降趨勢. Zhang等[5]同樣發(fā)現(xiàn)了隨著羥自由基對肌原纖維蛋白氧化修飾的增強，羰基和二聚酪氨酸的含量以及表面疏水性指數(shù)均增加，而總巰基含量和色氨酸熒光強度逐漸降低，二硫鍵和其他共價鍵導致蛋白質(zhì)的交聯(lián)和聚集，α–螺旋含量減少，β–折疊含量增加．Dorta等[6]發(fā)現(xiàn)，超氧自由基誘導肌原纖維蛋白氧化修飾形成羰基和二硫鍵，導致蛋白質(zhì)交聯(lián)和聚合．3mmol/L超氧自由基會誘導蛋白質(zhì)交聯(lián)，而5～10mmol/L超氧自由基會誘導肌原纖維蛋白的解折疊和聚集，賴氨酸殘基的消耗也證實了這一點．

Yang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，冷凍過程中形成的冰晶會破壞面團蛋白質(zhì)中的二硫鍵和氫鍵，快速冷凍可以誘導微冰晶的形成，從而減少對蛋白質(zhì)結構造成的破壞；在緩慢冷凍的面團中觀察到更多被破壞的和薄弱的結構，且伴隨著β–折疊含量的增加和α–螺旋含量的減少．Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，冷凍加強了蛋黃蛋白質(zhì)中的二硫鍵、氫鍵和疏水相互作用，促進聚集，導致其粒徑增大；弛豫時間顯示，冷凍使蛋黃中蛋白質(zhì)的固定水含量增加，游離水含量減少；紅外光譜結果表明，冷凍增強了蛋黃內(nèi)的氫鍵；掃描電子顯微鏡結果表明，冷凍促進了蛋黃中蛋白質(zhì)顆粒的解離．

氧化修飾可以使氨基酸殘基側(cè)鏈和蛋白質(zhì)多肽主鏈發(fā)生變化，從而導致蛋白質(zhì)交聯(lián)[9]、斷裂[10-11]、解折疊[12]和構象變化；而蛋白質(zhì)在冷凍過程中，冰晶也會破壞蛋白質(zhì)和水的結合而使蛋白質(zhì)分子間發(fā)生相互作用[13]，從而導致其構象變化[14]．目前文獻僅有單純對蛋白質(zhì)的氧化現(xiàn)象[15]或是冷凍現(xiàn)象[16]的研究，且主要集中于蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的表征[17]和優(yōu)化[18]. 本文將乳清蛋白先進行不同時間的氧化處理，然后再進行不同溫度和時間的冷凍處理，通過測定其羰基含量分析其氧化程度和結構變化，利用傅里葉變換紅外光譜分析其二級結構的變化，利用掃描電子顯微鏡再結合濁度、粒徑、表面疏水性指數(shù)和巰基含量的測定共同表征分析乳清蛋白先氧化再冷凍后的結構和性質(zhì)變化，旨在為含有或是添加乳清蛋白的食品在加工和低溫儲運過程中的品質(zhì)優(yōu)化提供理論參考．

1 材料與方法

1.1 材料

乳清濃縮蛋白(WPC-70)由山東天博食品配料有限公司提供．

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、無水乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)、鹽酸胍，北京鼎國生物技術有限公司；抗壞血酸(Asc)、濃鹽酸、三氯化鐵、過氧化氫，天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；尿素、2–硝基苯甲酸(DTNB)、2，4–二硝基苯肼(DNPH)、甘氨酸、三氯乙酸，美國Sigma公司；8–苯胺–1–萘磺酸鹽(ANS)熒光探針(優(yōu)級純)，上海源葉生物科技有限公司．所有試劑均為分析純試劑．

TG16–WS型高速離心機，長沙湘儀離心機有限公司；SU1510型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；Evolution 300型紫外-可見分光光度計，賽默飛世爾科技公司；iS50型傅里葉變換紅外光譜儀，美國尼高利公司；FD–1A–50型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；RF5301型熒光分光光度計，日本島津公司；BT–2001型激光粒度儀，丹東百特儀器有限公司；DW–40L92型醫(yī)用低溫保存箱，青島海爾特種電器有限公司．

1.2 方法

1.2.1 氧化乳清蛋白的制備及其冷凍條件

文章涉及符號及其含義見表1．

表1 文章涉及符號及其含義 Tab. 1 Symbols in the article and their meanings

乳清蛋白氧化體系參考孔保華等[19]的羥自由基氧化體系(H2O2/FeCl3/Asc)并加以改進．將乳清蛋白置于由20mmol/L H2O2、0.1mmol/L FeCl3和0.1mmol/L Asc組成的氧化體系中，配制成質(zhì)量濃度為20mg/mL的蛋白質(zhì)溶液；用磁力攪拌器混勻后調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為150r/min，在室溫下(23℃)分別氧化2h和4h，結束后加入1mmol/L EDTA終止氧化；10000g離心10min后棄去上清液，再用蒸餾水洗滌沉淀后離心以除去殘余試劑；將沉淀均勻分散在與氧化體系等量的蒸餾水中，分別于-18℃和-40℃下冷凍2d和4d．將乳清蛋白置于35℃水浴中解凍，然后在轉(zhuǎn)速為250r/min的條件下攪拌1h，10000g離心10min，取上清液進行冷凍干燥，4℃干燥環(huán)境中保存.

1.2.2 乳清蛋白的羰基含量測定

測定方法依照Yang等[20]的DNPH比色法并加以改進．將凍干的改性乳清蛋白溶于pH 7的磷酸鹽緩沖液，使其質(zhì)量濃度為5mg/mL；取0.35mL溶液置于2.0mL離心管內(nèi)，加入1mL用2mol/L鹽酸溶解的10mmol DNPH 溶液，室溫避光反應14h；加入0.45mL質(zhì)量分數(shù)為 40%的三氯乙酸溶液反應1h，10000g離心5min，棄去上清液．用1.4mL體積比為1﹕1的乙醇-乙酸乙酯溶液洗滌蛋白質(zhì)沉淀2次，每次10000g離心5min．將沉淀溶解于0.7mL鹽酸胍-磷酸鹽緩沖液(鹽酸胍6mol/L，磷酸鹽緩沖液pH 7)，37℃水浴25min，劇烈振蕩使其溶解，在368nm波長下測定吸光度，每個樣品均用不含DNPH的改性蛋白質(zhì)溶液經(jīng)上述步驟處理作為空白對照，以消除鹽酸等對實驗結果的影響．羰基含量(nmol/mg)按照式(1)計算．

式中：A368為樣品在368nm 波長下的吸光度；ρ為樣品溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；22000為摩爾吸光系數(shù)，L/(mol·cm)．

1.2.3 乳清蛋白的巰基含量測定

乳清蛋白巰基含量的測定采用Ellman試劑法，參考DTNB比色法[21]并加以改進．

將5μL的Ellman試劑〔0.008g DNTB溶于2mL Tris-Gly緩沖液(0.52g Tris、0.345g 甘氨酸和0.06g EDTA溶于50mL pH 7.8的磷酸鹽緩沖液)〕加到0.1mL的5mg/mL乳清蛋白樣品溶液中，在22℃條件下反應50min后于412nm處測定吸光度，以不含乳清蛋白樣品溶液的試劑作為空白對照．巰基含量(nmol/mg)按照式(2)計算．

式中：73.53為1×106/(1.36×104)，其中1.36×104是Ellman試劑的摩爾吸光系數(shù)，L/(mol·cm)；A為除去試劑空白后樣品的吸光度；D為稀釋倍數(shù)，15.1；ρ為樣品溶液質(zhì)量濃度，mg/mL．

1.2.4 乳清蛋白的傅里葉變換紅外光譜測定

采用KBr壓片法[22]進行測定．將1mg冷凍干燥的乳清蛋白改性產(chǎn)物與150mg KBr結晶混合，快速研磨成均一細粉，在壓片機上以8×107Pa的壓力壓 制30s，取出壓好的透明薄片；以空氣作為采集背景，在傅里葉變換紅外光譜儀中進行全波段掃描(400～4000cm-1)，分辨率為4cm-1，掃描次數(shù)為16次，利用OMNIC軟件對酰胺Ⅰ帶(1600～1700cm-1)的紅外光譜進行分析處理，得到乳清蛋白改性產(chǎn)物二級結構單元含量的變化．

1.2.5 乳清蛋白的粒徑測定

乳清蛋白的粒徑分布采用BT–2001型激光粒度儀測定．取5mg/mL制備的乳清蛋白樣品溶液進行測定，散射角度為90°，測定時間為60s．

1.2.6 乳清蛋白的微觀結構

用導電膠將制備好的乳清蛋白樣品粘在樣品臺上，置于離子濺射儀中，使樣品表面鍍導電金膜，用SU1510型掃描電子顯微鏡觀察．

1.2.7 乳清蛋白的表面疏水性指數(shù)測定

采用ANS熒光探針法[23]測定蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù). 取1mg制備好的乳清蛋白樣品均勻分散在0.01mol/L、pH 7的磷酸鹽緩沖液中使其溶解，分別配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的乳清蛋白待測液；將ANS溶于上述磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度為8mmol/L的ANS溶液．將4mL乳清蛋白待測液和50μL ANS溶液混合，置于黑暗條件下30min使其充分反應；在激發(fā)波長390nm和發(fā)射波長470nm的條件下測定熒光強度，狹縫設置為5，靈敏度設置為2．將熒光強度的測定結果與乳清蛋白質(zhì)量濃度繪制成曲線圖，曲線初始斜率即為乳清蛋白的表面疏水性指數(shù)．

1.2.8 乳清蛋白的濁度測定

將0.05g的乳清蛋白凍干粉溶解在10mL、pH 7的磷酸鹽緩沖液中，在600nm處測定其吸光度，用此吸光度表示濁度．

2 結果與分析

2.1 不同氧化/冷凍條件對乳清蛋白羰基及巰基含量的影響

因羰基含量與蛋白質(zhì)氧化程度相關，實驗中常用其作為表征蛋白質(zhì)受氧化影響程度的標志性常規(guī)指標[24]；而蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基主要以巰基或二硫鍵的狀態(tài)存在，二硫鍵有著穩(wěn)定蛋白質(zhì)天然構象的重要作用，使蛋白質(zhì)肽鏈空間結構更為緊密．已有實驗證明[25]，當?shù)鞍踪|(zhì)的二硫鍵還原成巰基時，蛋白質(zhì)構象變得松散．因此，通過對先氧化后冷凍的乳清蛋白的羰基含量及巰基含量進行分析，輔助表征其結構、性質(zhì)的變化(圖1)．

圖1 氧化/冷凍條件對乳清蛋白羰基及巰基含量的影響Fig. 1 Effect of oxidation/freezing conditions on the carbonyl and sulfydryl content of oxidized whey protein

由圖1可知：乳清蛋白經(jīng)過2h和4h氧化后與空白相比其羰基和巰基的含量均上升，表明氧化使乳清蛋白結構解構．乳清蛋白氧化2h再冷凍2d后，與空白相比其羰基含量減少，其中－40℃冷凍條件下乳清蛋白的羰基含量更少．這可能是由于更低的冷凍溫度使蛋白質(zhì)的聚集程度更大，更多的羰基無法與DNPH結合[25]．繼續(xù)冷凍至第4天時，-18℃條件下乳清蛋白的羰基含量進一步降低，而-40℃條件下其羰基含量略有上升．當乳清蛋白在冷凍之前經(jīng)過更長時間的氧化后，在-18℃和-40℃條件下隨著冷凍時間的增加，羰基含量均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，其中-18℃條件下乳清蛋白羰基含量的變化程度較-40℃條件下的更大．在先氧化再冷凍的情況下，總體來看，無論是-18℃還是-40℃條件下，均是在經(jīng)過氧化4h和冷凍2d處理的羰基含量最低．這可能是由于高度羰基化的蛋白質(zhì)傾向于形成高分子聚集體[26-27]，再經(jīng)過短時間冷凍后進一步聚集，而繼續(xù)長時間冷凍導致蛋白質(zhì)部分解聚[28]．

經(jīng)過4h氧化和-18℃冷凍處理的乳清蛋白的巰基含量增加最多，這可能是由于二硫鍵的斷裂或蛋白質(zhì)結構松散暴露了內(nèi)部的巰基；而經(jīng)過4h氧化和 -40℃冷凍處理的乳清蛋白的巰基含量變化不大，說明較低的冷凍溫度對蛋白質(zhì)的結構起到保護作用.

綜上所述，氧化后的乳清蛋白再經(jīng)過冷凍處理，其羰基和巰基的含量與空白組相比均增大．

2.2 不同氧化/冷凍條件對乳清蛋白傅里葉變換紅外光譜的影響

在1600～1700cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的酰胺Ⅰ帶在表征蛋白質(zhì)二級結構上應用最為廣泛[29]，用OMNIC軟件對乳清蛋白樣品譜圖的酰胺Ⅰ帶進行傅里葉去卷積、分峰和高斯峰擬合計算，不同氧化/冷凍條件下乳清蛋白的傅里葉變換紅外光譜及二級結構單元含量分別見圖2和表2．

圖2 不同氧化/冷凍條件下乳清蛋白的傅里葉變換紅外光譜 Fig. 2 Fourier transform infrared spectrum of whey proteins with different oxidation/freezing conditions

表2 不同氧化/冷凍條件下乳清蛋白的二級結構單元含量 Tab. 2 Secondary structure unit content of whey proteins with different oxidation/freezing conditions

通過比較經(jīng)過不同時間氧化處理的乳清蛋白及空白組的二級結構單元可知：β–折疊的含量隨氧化時間的增加而增加，而無規(guī)則卷曲、α–螺旋和β–轉(zhuǎn)角的含量均隨氧化時間的增加而減少，說明氧化作用使蛋白質(zhì)部分側(cè)鏈變短．氧化2h的乳清蛋白置于-18℃冷凍2d和置于-40℃冷凍4d后，均出現(xiàn)α–螺旋結構占比增加的現(xiàn)象；而氧化2h的乳清蛋白冷凍4d后，-18℃條件下無規(guī)則卷曲結構向β–轉(zhuǎn)角結構轉(zhuǎn)變，-40℃條件下β–轉(zhuǎn)角結構向無規(guī)則卷曲結構轉(zhuǎn)變．乳清蛋白經(jīng)過4h氧化后再經(jīng)過-18℃冷凍2d，同樣是無規(guī)則卷曲結構向α–螺旋結構轉(zhuǎn)變，但是比氧化2h的變化量少，冷凍至4d時，無規(guī)則卷曲結構數(shù)量明顯增加；而在-40℃條件下冷凍2d后，無規(guī)則卷曲結構向β–轉(zhuǎn)角結構轉(zhuǎn)變，而冷凍至4d時，β–轉(zhuǎn)角結構更大程度地向無規(guī)則卷曲結構轉(zhuǎn)變．

2.3 不同氧化/冷凍條件對乳清蛋白粒徑的影響

通過對蛋白質(zhì)粒徑的測量分析可以對蛋白質(zhì)的結構變化進行輔助表征，冷凍對氧化乳清蛋白粒徑的影響如圖3所示，不同字母表示組間差異顯著(P＜0.05)．

由圖3(d)的i、g、k柱形圖可知，乳清蛋白在2h和4h氧化處理后，其平均粒徑逐步增大；再結合圖3(a)可見，隨著氧化時間的增加，其大峰逐步變寬，小峰逐步變矮，表明氧化可能使乳清蛋白發(fā)生解折疊或交聯(lián)[30]．

圖3 冷凍對氧化乳清蛋白粒徑的影響 Fig. 3 Effect of freezing on the particle size of the oxidized whey protein

圖3(b)為不同溫度和時間的冷凍處理對經(jīng)過2h氧化后乳清蛋白粒徑的影響．從冷凍時間來看：乳清蛋白在-18℃下冷凍2d后，其大峰右移變寬，小峰變矮，表明分子可能發(fā)生了解折疊和交聯(lián)；繼續(xù)冷凍至4d時，粒徑主峰左移變窄且由雙峰變?yōu)槿?，根?jù)其小峰積分面積變大可以判斷蛋白質(zhì)分子可能發(fā)生了裂解．在-40℃條件下冷凍2d和4d的乳清蛋白顯示出相同的趨勢，區(qū)別在于冷凍2d后與 -18℃相比其解折疊程度更小，而冷凍4d后其裂解程度更大．從冷凍溫度來看：冷凍2d后的蛋白質(zhì)粒徑均呈現(xiàn)雙峰，冷凍4d后的蛋白質(zhì)粒徑均呈現(xiàn)三峰，且無論是冷凍2d還是4d，-40℃條件下的峰與 -18℃條件下的峰都向左移，表明更低的溫度可能更利于蛋白質(zhì)結構縮聚．

圖3(c)為不同溫度和時間的冷凍處理對經(jīng)過4h氧化后乳清蛋白粒徑的影響．總體來看，與氧化2h相比，其粒徑變化程度更小，且峰均向右移，粒徑變大，說明氧化4h后的乳清蛋白經(jīng)過不同溫度和時間的冷凍處理后其分子構象可能變得松散．氧化4h后在-18℃冷凍2d的乳清蛋白的粒徑增加最多，可能是由于冷凍過程使蛋白質(zhì)在冰-液界面或容器表面吸附，使其部分結構展開，因此導致蛋白質(zhì)聚集[31]．

由圖3(d)可以看出：乳清蛋白經(jīng)過先氧化再冷凍處理后，平均粒徑呈現(xiàn)出增大的趨勢，而經(jīng)過2h氧化處理后再經(jīng)過-18℃冷凍4d的乳清蛋白的平均粒徑增加最多．乳清蛋白粒徑的分散指數(shù)均大于0.25，可以看出其粒徑分布基本是雙峰甚至三峰分布，較為分散．

2.4 不同氧化/冷凍條件對乳清蛋白微觀結構的 影響

用掃描電子顯微鏡可以直觀地從微觀形態(tài)上分析不同氧化/冷凍條件對乳清蛋白的影響(圖4)．由圖4可以看出：未處理的空白組乳清蛋白表面光滑平整，形狀規(guī)則；經(jīng)過氧化后結構形態(tài)明顯改變，并顯 示出不規(guī)則的交聯(lián)；再經(jīng)過冷凍后的蛋白質(zhì)表面呈現(xiàn)出更多的、大小不一的孔洞．總體來看，經(jīng)過氧化后再置于-18℃冷凍的乳清蛋白形態(tài)較-40℃條件下顯示出更大的形變. 這可能是由于更大的溫差使冷凍速率變快，水分子形成更大的、對蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生破壞作用的冰晶更少．

圖4 不同氧化/冷凍條件下乳清蛋白的微觀結構 Fig. 4 Microstructure of whey proteins under different oxidation/freezing conditions

2.5 不同氧化/冷凍條件對乳清蛋白表面疏水性指數(shù)的影響

表面疏水性指數(shù)可以顯示出蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的分布特點，是表征蛋白質(zhì)結構變化的重要指標． 不同氧化/冷凍條件下乳清蛋白的表面疏水性指數(shù)見表3．

表3 不同氧化/冷凍條件下乳清蛋白的表面疏水性指數(shù)Tab. 3 Surface hydrophobicity index of whey protein under different oxidation/freezing conditions

氧化后再置于-18℃下冷凍2d后的乳清蛋白表面疏水性指數(shù)增加較多，結合其粒徑大幅度的增加進行分析，可能是乳清蛋白經(jīng)過氧化后再置于-18℃下冷凍2d使其結構松散舒展，內(nèi)部疏水基團暴露更 多[32]. 而其冷凍至4d或是置于-40℃處理后的蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)降低，結合其粒徑減小進行分析，可能是更長時間和更低溫度的冷凍使蛋白質(zhì)結構縮緊變得更加致密[33]，從而減少了表面的疏水基團．

2.6 不同氧化/冷凍條件對乳清蛋白濁度的影響

濁度取決于溶液中不溶性聚集體的含量和大小，可以在一定程度上反映蛋白質(zhì)分子的聚集情況[34]. 不同氧化/冷凍條件對乳清蛋白濁度的影響如圖5 所示.

由圖5可知，乳清蛋白經(jīng)過先氧化再冷凍處理后，濁度均有不同程度的增加．乳清蛋白經(jīng)過氧化2h或4h處理后，濁度略有下降，結合粒徑和表面疏水性指數(shù)分析，可能是由于長時間的氧化導致蛋白質(zhì)分子結構的變化，其粒徑更小、表面疏水性指數(shù)更低，使蛋白質(zhì)溶解性增強，進而顯示出更低的濁度[35]. 乳清蛋白經(jīng)過2h氧化處理再置于-18℃冷凍2d后濁度升高，而在同樣條件下-40℃冷凍的蛋白質(zhì)溶液濁度降低，這個變化與表面疏水性指數(shù)變化一致，隨著蛋白質(zhì)分子表面親水基團和疏水基團數(shù)量的變化而變化；當繼續(xù)冷凍至4d時，濁度隨著冷凍溫度的降低而降低，這可能是由于冷凍引發(fā)分子聚集效 應[36]，從而對光線表現(xiàn)出更多的散射作用．乳清蛋白經(jīng)過4h氧化處理后再置于-18℃和-40℃冷凍2d后，濁度變化不大；繼續(xù)冷凍至4d時，濁度明顯增加．其中-18℃條件下的蛋白質(zhì)濁度大幅度上升，表明此條件處理后的乳清蛋白結構可能發(fā)生了較大改變. 總體來看，-18℃比-40℃對蛋白質(zhì)濁度的影響更大. 結合上述實驗結果可以證實，-18℃的冷凍條件比-40℃對乳清蛋白結構的影響更大，使其分子結構的打開度更大．

圖5 不同氧化/冷凍條件對乳清蛋白濁度的影響 Fig. 5 Effect of turbidity of whey proteins under different oxidation/freezing conditions

3 結 論

通過對不同氧化/冷凍條件下的乳清蛋白進行結構表征和分析發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白經(jīng)過先氧化再冷凍處理，其羰基含量、巰基含量和濁度均有所增加，且粒徑變大；再結合粒徑和表面疏水性指數(shù)的結果可知：經(jīng)過4h氧化再置于-18℃冷凍2d后的處理對乳清蛋白結構的改變最為嚴重；紅外光譜結果顯示，此條件處理后的乳清蛋白二級結構中的無規(guī)則卷曲結構向β-折疊結構轉(zhuǎn)變．掃描電子顯微鏡結果顯示，經(jīng)過氧化再置于-18℃冷凍的乳清蛋白形態(tài)較-40℃條件下發(fā)生了更大的形變；同樣，-18℃條件下乳清蛋白的濁度也較-40℃條件下更大．這說明緩慢冷凍時，冰晶對蛋白質(zhì)結構的破壞更易導致乳清蛋白結構的打開.