OsPM1基因在水稻苗期受非生物脅迫響應(yīng)時(shí)的作用及應(yīng)用

安 碩,姚玲婭,張 鵬,胡 悅,葛曉春

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438;2.復(fù)旦大學(xué)遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200438)

水稻為地球上35億多人口提供主食,其種植遍及全球多個(gè)農(nóng)業(yè)氣候區(qū)[1]。我國地處北溫帶和熱帶,地理跨度大,但是北到黑龍江,南到海南均以水稻為主栽作物。由于各種植區(qū)地理和氣候條件千變?nèi)f化,水稻在其生長過程中可能會(huì)遭受各種環(huán)境因素的脅迫,包括干旱、高鹽、高低溫等,它們均可能對水稻的生長和產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響[2-5]。水稻喜溫卻不耐熱,最佳生長環(huán)境溫度在28～30℃,氣溫如果持續(xù)超過35℃,會(huì)導(dǎo)致大部分品種產(chǎn)量下降而且品質(zhì)變差。隨著全球人口膨脹和工業(yè)化程度的加深,碳排放加劇,從長遠(yuǎn)來看,全球氣溫將處于上升趨勢。對于氣候變暖后果的預(yù)測表明,高溫可能會(huì)嚴(yán)重影響亞洲包括我國的水稻種植,導(dǎo)致水稻的產(chǎn)量大幅下降[6]。我國大部分人口均以水稻為主食,對稻米的需求量尤其巨大,開展水稻抗逆研究,尤其是耐高溫新品種的培育對于國計(jì)民生來說至關(guān)重要。尋找植物抗逆尤其是耐高溫基因,通過分子育種技術(shù)將相關(guān)基因轉(zhuǎn)入水稻栽培品種中,改良水稻的耐逆性,是穩(wěn)定異常氣候條件下糧食作物產(chǎn)量的重要手段。

本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了一個(gè)干旱脅迫響應(yīng)基因OsPM1,該基因編碼一個(gè)細(xì)胞膜蛋白,可以向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)ABA,從而影響氣孔導(dǎo)度,調(diào)控水稻對干旱的耐受能力[7]。過表達(dá)OsPM1的轉(zhuǎn)基因植株顯示出較強(qiáng)的耐旱性[7]。ABA作為植物的逆境激素,在應(yīng)對干旱、高鹽、高溫等多種非生物脅迫的應(yīng)答中都發(fā)揮著重要作用[8-10]。在正常生長條件下,ABA在體內(nèi)的含量較低,PP2Cs磷酸酶與Sn RK2s蛋白激酶結(jié)合并抑制后者的激酶活性,ABA信號(hào)通路被抑制;在脅迫條件下,植物體內(nèi)ABA大幅增多并與ABA受體(PYR/PYL/RACR)結(jié)合,受體發(fā)生構(gòu)象改變,然后與PP2Cs磷酸酶結(jié)合形成三元復(fù)合體,從而釋放出SnRK2s蛋白激酶,使得其活性被激活,SnRK2s激活后磷酸化下游的離子通道或轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)而改變細(xì)胞內(nèi)的離子濃度或調(diào)控下游一系列基因的表達(dá)[9-13]。OsPM1作為ABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,影響了細(xì)胞內(nèi)ABA水平,從而影響植物的逆境響應(yīng),我們在前期工作中僅僅報(bào)道了OsPM1過表達(dá)的抗旱表型和其作用機(jī)理[7],但由于ABA激素的重要性和在逆境響應(yīng)中的廣泛性,我們推測OsPM1過表達(dá)除了增強(qiáng)水稻的耐旱性外,可能還影響了水稻耐受其他非生物逆境的能力,但是否如此需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

在植物逆境響應(yīng)過程中,轉(zhuǎn)錄因子可以與下游基因啟動(dòng)子上的順式作用元件結(jié)合,從而激活或者抑制下游基因的表達(dá)。第一個(gè)調(diào)控?zé)崦{迫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子是在酵母中鑒定到的,被命名為熱休克轉(zhuǎn)錄因子(Heat shock transcription factors,Hsfs)[14]。Hsfs在植物的熱應(yīng)激反應(yīng)中具有重要功能,它可以與熱休克蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)基因上游的熱休克元件(Heat Shock Elements,HSEs)結(jié)合[15-22]。除了熱脅迫之外,還有人發(fā)現(xiàn)Hsfs的表達(dá)增強(qiáng)了植物耐受其他非生物脅迫包括氧化、高鹽、冷脅迫的能力[23]。番茄過表達(dá)自身的HsfA1時(shí),具有更強(qiáng)的耐熱性[24]。在擬南芥中過表達(dá)AtHsfA2時(shí),其對熱脅迫和氧化脅迫的耐受性均增強(qiáng)[25]。為了增強(qiáng)水稻的耐熱性,將熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子置于一個(gè)逆境高度響應(yīng)的啟動(dòng)子之后,提高熱脅迫下轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平,并避免其在正常條件下的高表達(dá),則有可能既提高水稻的耐熱性,又不影響其在正常條件下的生長發(fā)育。高粱是禾本科植物中一類耐熱性較強(qiáng)的作物,其熱休克轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)其耐熱性上起重要作用。我們推測,在水稻中異源表達(dá)高粱的Hsfs家族基因,并控制其在正常情況下的表達(dá),很可能獲得具有較高耐熱性的水稻品種。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株與載體

實(shí)驗(yàn)水稻(OryzasativaL.)均為粳稻日本晴,OsPM1及OsPM1::SbHsf03的轉(zhuǎn)基因株系均以日本晴為背景構(gòu)建;大腸桿菌菌株為E.coliDH5α;農(nóng)桿菌菌株為AgrobacteriumEHA105;植物轉(zhuǎn)基因載體為p CAMBIA1301ubi、pCAMBIA1302;雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)載體為p CHF3、p GreenⅡ0800-LUC。

1.2 方法

1.2.1 脅迫處理

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中脅迫處理:水稻種子用3%雙氧水消毒0.5 h,然后用蒸餾水洗3遍,置蒸餾水中,于室溫泡種兩天至露白,將剛剛露白的種子放入底部有孔的96孔板中,每一個(gè)孔放入一粒種子,放在盛有水稻營養(yǎng)液(木村B)的槍頭盒中培養(yǎng)(28℃,16 h光照/8 h黑暗),至三葉期后進(jìn)行不同脅迫處理。分別用20%PEG處理24 h、200 mmol/L NaCl處理24 h、50μmol/L ABA處理12 h、45℃處理4 h、0℃處理4 h,處理結(jié)束后收集水稻葉片,同時(shí)取未處理的水稻葉片作對照,重復(fù)3次取樣。另外,為了觀察OsPM1對熱處理的時(shí)間響應(yīng)曲線,將三葉期幼苗在45℃下熱處理不同時(shí)間后取樣。

OsPM1轉(zhuǎn)基因株系脅迫處理:各株系種子去殼后先用70%的乙醇浸泡1 min,再用50%的次氯酸鈉浸泡20 min,然后用無菌水清洗3次并鋪于濾紙上晾干,清洗過程在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。準(zhǔn)備MS的對照平板、添加了200 mmol/L NaCl的高鹽脅迫平板和添加了5%甘露醇的滲透脅迫平板。將晾干的種子放入各平板中,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d后拍照并測量苗長,比較正常平板上和脅迫平板上的生長差異。熱脅迫處理:將在營養(yǎng)液中生長14 d的水稻放入45℃的高溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 d(RNAi株系)和5 d(過表達(dá)株系)(12 h 45℃光照/12 h 28℃黑暗),觀察植株表型,檢測正常條件下及高溫處理?xiàng)l件下植物的離子泄漏率。

OsPM1::SbHsf03重組基因轉(zhuǎn)基因株系熱脅迫處理:將正常條件下生長兩周的轉(zhuǎn)基因幼苗轉(zhuǎn)入45℃高溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),46 h后觀察植株表型,并統(tǒng)計(jì)卷葉率,檢測處理前及高溫處理后植物的丙二醛(MDA)含量及離子泄漏率。長期熱處理:將正常條件下生長兩周的轉(zhuǎn)基因幼苗轉(zhuǎn)入45℃高溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月(6 h 45℃光照/18 h 28℃黑暗),之后觀察表型。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因植物構(gòu)建

OsPM1過表達(dá)株系及RNAi株系由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[7]。

OsPM1::SbHsf03融合基因轉(zhuǎn)基因株系的構(gòu)建:從高粱葉片的總RNA中通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增SbHsf03cDNA全長,連入中間載體PCR-Blunt中,然后將SbHsf03、eGFP基因及OsPM1基因上游2 152 bp長的啟動(dòng)子連接到pCAMBIA1302載體中,測序正確后送武漢伯遠(yuǎn)公司進(jìn)行水稻日本晴轉(zhuǎn)化。

1.2.3 水稻葉片RNA抽提及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用TRIzol法提取水稻葉片總RNA,用PrimeScript RT-PCR Kit with gDNA eraser試劑盒(Ta KaRa,日本)將1μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板用SYBR Green Master Mix試劑盒(YEASEN,中國)進(jìn)行RT-qPCR檢測,OsUBQ5作為內(nèi)參基因,引物見表1。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量測定

取待測水稻葉片0.075 g(植物組織鮮重記為m鮮)放入2 mL離心管中,加入兩顆鋼珠,在液氮中打成粉末。向離心管中加入2 mL 10%TCA(三氯乙酸)(提取液體積記為V)與植物混勻后靜置10 min。靜置后用10 000×g的轉(zhuǎn)速離心15 min。取1 m L上清與1 m L 0.6%硫代巴比妥酸混合后于95℃加熱30 min并立刻于冰上降溫。將冷卻后的反應(yīng)液用10 000×g的轉(zhuǎn)速離心10 min。取上清用分光光度計(jì)測532 nm、600 nm、450 nm吸光度值并分別記為A532、A600、A450,計(jì)算MDA含量。MDA的質(zhì)量摩爾濃度bMDA(μmol/g)=(6.45(A532-A600)-0.56A450)×V/m鮮。每個(gè)株系進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 離子泄漏率檢測

取各株系葉片若干于5 m L離心管中,其中已提前加入4 m L蒸餾水,將葉片浸沒到水中,放置過夜。次日,將離心管上下顛倒幾次,檢測溶液的電導(dǎo)率,記為E0。然后將含有材料的離心管放入100℃的沸水浴中煮15 min。待溶液溫度降到室溫上下顛倒幾次重新檢測其電導(dǎo)率,記為E1。相對離子泄漏率=E0/E1×100%。每個(gè)株系3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測

載體構(gòu)建:將OsPM1的啟動(dòng)子(718 bp)連接到雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)載體p GreenⅡ0800-LUC中;將編碼水稻熱休克轉(zhuǎn)錄因子的基因(OsHsf)連接到pCHF3中。

水稻原生質(zhì)體制備:配制酶解液(1.5%Cellulase R-10、0.5%Macerozyme R-10、0.6 mol/L Mannitol、10 mmol/L MES)后先于55℃水浴10 min,溫度降到室溫后添加1 mmol/L CaCl2、5μmol/Lβ-巰基乙醇、0.1%BSA,然后調(diào)p H至5.7,再用0.45μm的濾膜過濾至錐形瓶中待用。取大小適宜的水稻苗葉鞘部分切成小于1 mm的小段放入酶解液中,真空抽氣20 min兩次,然后放入28℃的搖床中55 r/min避光酶解4 h。酶解結(jié)束后向錐形瓶中加入與酶解液等體積的4℃預(yù)冷的W5反應(yīng)液(154 mmol/L NaCl、125 mmol/L CaCl2、5 mmol/L KCl、2 mmol/L MES,定容后調(diào)p H至5.7,用0.45μm濾膜過濾,4℃保存)輕輕攪拌,攪拌后用專用濾網(wǎng)過濾,然后200×g低溫離心2～3 min。倒去上清后將離心管底部的原生質(zhì)體用W5反應(yīng)液重懸洗滌一次,再將原生質(zhì)體用W5反應(yīng)液稀釋后放在冰上靜置30 min。然后200×g離心3 min,棄上清,用MMG反應(yīng)液(4 mmol/L MES、0.4 mmol/L Mannitol、15 mmol/L MgCl2,定容后調(diào)p H至5.7,用0.45μm濾膜過濾,4℃保存)將原生質(zhì)體的濃度調(diào)至(1～2)×105個(gè)/m L。

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化:將上述構(gòu)建的兩個(gè)質(zhì)粒加入100μL原生質(zhì)體中,加入120μL 40%PEG4000(40%PEG4000、0.2 mmol/L Mannitol、0.1 mmol/L CaCl2),混勻,放入28℃烘箱中黑暗靜置15 min。靜置后加入480μL W5反應(yīng)液混勻并用200×g的轉(zhuǎn)速離心3 min,吸走上清后用1 m L W5反應(yīng)液洗滌一次,洗滌后的原生質(zhì)體用100μL W5反應(yīng)液重懸并轉(zhuǎn)移到已經(jīng)加入900μL W5反應(yīng)液的細(xì)胞板中,28℃黑暗培養(yǎng)過夜(12～16 h)。

熒光強(qiáng)度檢測:次日,將細(xì)胞板中的原生質(zhì)體移至2 m L離心管中并用200×g的轉(zhuǎn)速離心3 min,吸走上清。然后用Dual-Luciferase?Reporter Assay System(Promega,美國)試劑盒檢測。加入LARII后檢測Luminescence發(fā)光值記為LUC,加入Stop&Glo Reagent后檢測Luminescence發(fā)光值記為REN,LUC/REN的比值代表OsPM1啟動(dòng)子的相對轉(zhuǎn)錄活性。以不連接OsHsf的空載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化連接OsPM1啟動(dòng)子(718 bp)的雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)載體質(zhì)粒組為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsPM1受各種非生物脅迫的誘導(dǎo)并能夠被熱休克轉(zhuǎn)錄因子激活

為了探究OsPM1在水稻各種非生物脅迫中是否發(fā)揮功能,我們首先觀察了各種脅迫處理后OsPM1在水稻葉片中的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)除冷脅迫處理(0℃)外,干旱、滲透、高鹽、高溫這些非生物脅迫均可以誘導(dǎo)OsPM1在水稻葉片中的表達(dá),最高可達(dá)1 000倍以上(圖1(a)),暗示OsPM1很可能也在除干旱外的其他非生物脅迫中發(fā)揮功能。利用45℃處理生長到三葉期的幼苗不同時(shí)間,發(fā)現(xiàn)熱處理后4 h,OsPM1的表達(dá)水平可以達(dá)到處理前的300倍以上,其他時(shí)間點(diǎn)也有一定倍數(shù)的誘導(dǎo)表達(dá)(圖1(b)),表明OsPM1與水稻熱脅迫有關(guān)。為了研究OsPM1在水稻熱脅迫中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,將OsPM1的啟動(dòng)子(718 bp)連接到雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)載體p GreenⅡ0800-LUC中,將其與35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)編碼水稻熱休克轉(zhuǎn)錄因子基因(OsHsf)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體(圖1(c)),然后用雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測OsPM1的相對轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示,Os Hsf A2b、Os Hsf A2e、Os Hsf A3均可在一定程度上激活OsPM1的轉(zhuǎn)錄,其中Os Hsf A3對OsPM1的轉(zhuǎn)錄激活高達(dá)11倍(圖1(d))。說明OsPM1受熱脅迫誘導(dǎo)可能是通過熱休克轉(zhuǎn)錄因子的直接或間接激活實(shí)現(xiàn)的。

圖1 各種脅迫處理后OsPM1在水稻葉片中的表達(dá)變化及熱休克轉(zhuǎn)錄因子對OsPM1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控Fig.1 Expression of OsPM1 in rice leaves under various stress treatments and transcriptional regulation of Hsfs on OsPM1

2.2 過表達(dá)OsPM1能夠提高水稻耐受滲透脅迫和高鹽脅迫的能力

進(jìn)一步對OsPM1的過表達(dá)株系OE-2、OE-13、OE-15和RNAi株系RNAi-1,RNAi-3和RNAi-12進(jìn)行滲透脅迫(5%甘露醇)和高鹽脅迫(200 mmol/L NaCl)。結(jié)果如圖2所示,在正常培養(yǎng)基上各株系長勢一致;在含有5%甘露醇的滲透脅迫培養(yǎng)基上生長,過表達(dá)株系相比于野生型苗長更長,RNAi株系最短;在200 mmol/L NaCl培養(yǎng)基上RNAi株系生長也慢于野生型。該結(jié)果表明,OsPM1在水稻抵御滲透和高鹽脅迫過程中也發(fā)揮重要功能,過表達(dá)OsPM1能夠提高水稻耐受滲透脅迫和高鹽脅迫的能力。

圖2 滲透及高鹽脅迫處理下各轉(zhuǎn)基因水稻株系表型分析Fig.2 Phenotype analysis of transgenic rice lines under osmotic and high salt stress

2.3 過表達(dá)OsPM1能夠提高水稻耐高溫能力

將三葉期的野生型、OsPM1過表達(dá)(OE-2、OE-13)和RNAi(RNAi-1、RNAi-3)水稻苗高溫處理后觀察植株表型,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)植株的葉片比野生型綠而RNAi植株的葉片則比野生型更黃(圖3(a),見第390頁),同時(shí)檢測了正常條件下及高溫處理?xiàng)l件下各株系植物的離子泄漏率,結(jié)果顯示:相較野生型,過表達(dá)株系的離子泄漏率較低,而RNAi株系的則較高(圖3(b),見第390頁)。上述結(jié)果說明OsPM1也參與了水稻抗高溫反應(yīng),過表達(dá)OsPM1可以增強(qiáng)水稻的耐熱性。因此,OsPM1基因在改善作物耐熱性上具有很好的應(yīng)用前景。

圖3 高溫脅迫處理下各轉(zhuǎn)基因水稻株系表型分析Fig.3 Phenotype analysis of rice transgenic lines under high temperature

2.4 OsPM1::Sb Hsf03融合基因轉(zhuǎn)基因株系的構(gòu)建

OsPM1啟動(dòng)子是一個(gè)脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,在面臨干旱、高溫等逆境時(shí),其活性常常提高幾百倍以上,而在正常生長條件下,該啟動(dòng)子的活性則很低。高粱是禾本科植物中一類耐熱性較強(qiáng)的作物,其熱休克轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)其耐熱性上起重要作用。因此,我們將OsPM1啟動(dòng)子與高粱熱休克轉(zhuǎn)錄因子基因融合,轉(zhuǎn)化到對熱敏感的粳稻日本晴中并檢測轉(zhuǎn)基因株系的耐高溫能力。

我們從高粱葉片的總cDNA中擴(kuò)增到SbHsf03基因(LOC8085952)的cDNA全長,然后通過基因融合技術(shù)將SbHsf03與OsPM1基因上游2 152 bp長度的啟動(dòng)子融合,轉(zhuǎn)化水稻日本晴。圖4(a)、(b)分別為高粱熱休克轉(zhuǎn)錄因子Sb Hsf03的蛋白結(jié)構(gòu)域示意簡圖及OsPM1::SbHsf03融合基因轉(zhuǎn)基因載體示意圖。

圖4 Sb Hsf03蛋白結(jié)構(gòu)域示意簡圖及OsPM1::Sb Hsf03融合基因轉(zhuǎn)基因載體示意圖Fig.4 Schematic diagrams of Sb Hsf03 protein and the transgenic vector of OsPM1::Sb Hsf03

2.5 OsPM1::Sb Hsf03融合基因轉(zhuǎn)基因株系耐高溫能力鑒定

利用PCR的方法對2.4節(jié)描述的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示3個(gè)株系均轉(zhuǎn)基因成功(圖5(a))。將生長兩周的野生型及OsPM1::SbHsf03融合基因的轉(zhuǎn)基因株系E452-1、E452-2、E452-3的水稻苗放入45℃的培養(yǎng)箱中處理46 h后觀察植株表型,發(fā)現(xiàn)OsPM1::SbHsf03融合基因的轉(zhuǎn)基因株系較野生型卷葉更少(圖5(b,c)),同時(shí)檢測了處理前及高溫處理后植物的丙二醛含量及離子泄漏率,結(jié)果表明:高溫處理后,OsPM1::SbHsf03融合基因轉(zhuǎn)基因株系的丙二醛含量及離子泄漏率都低于野生型,而處理前各株系的丙二醛含量和離子泄漏率均沒有顯著差異(圖5(d,e)),說明在水稻中表達(dá)OsPM1::SbHsf03融合基因可以增強(qiáng)其耐熱性,且對苗期正常情況下水稻的生長沒有影響。

圖5 OsPM1::Sb Hsf03融合基因轉(zhuǎn)基因株系耐高溫能力鑒定Fig.5 Characterization of the heat tolerance of OsPM1::Sb Hsf03 transgenic lines

2.6 OsPM1::Sb Hsf03融合基因轉(zhuǎn)基因植株在長時(shí)間高溫脅迫后具有更高的存活率

將野生型及OsPM1::SbHsf03融合基因的轉(zhuǎn)基因植株E452的幼苗放入45℃的培養(yǎng)箱中處理1個(gè)月后觀察植株表型,發(fā)現(xiàn)野生型植株幾乎全部死亡(存活率:3.1%),OsPM1::SbHsf03融合基因的轉(zhuǎn)基因植株全部存活(存活率:100%)(圖6),進(jìn)一步說明在水稻中表達(dá)OsPM1::SbHsf03融合基因可以增強(qiáng)植物的耐熱性。

圖6 熱脅迫1個(gè)月后野生型及OsPM1::Sb Hsf03轉(zhuǎn)基因植株E452的表型Fig.6 Phenotype of wild type and OsPM1::Sb Hsf03 transgenic plant E452 after 1 month of heat stress treatment

3 討 論

環(huán)境逆境是造成作物產(chǎn)量下降的一個(gè)主要因素,因此培育抗逆性強(qiáng)的作物是穩(wěn)定作物產(chǎn)量的必經(jīng)之路。然而,培育對單一脅迫(如干旱、鹽堿、病原體等)耐受性增強(qiáng)的植物可能存在一定的風(fēng)險(xiǎn),因?yàn)橹参飳Σ煌拿{迫有獨(dú)特的反應(yīng),增加對一種脅迫的耐受性可能以犧牲對另一種脅迫的耐受性為代價(jià)[26-27]。例如,一個(gè)耐旱性強(qiáng)的好氧水稻品種能夠適應(yīng)缺水環(huán)境,但是這個(gè)品種對根結(jié)線蟲感染特別敏感,導(dǎo)致產(chǎn)量嚴(yán)重下降[28]。隨著氣候變化,越來越多的極端天氣事件增加了植物在田間遭受多種脅迫的可能性。因此,有必要尋找能夠同時(shí)響應(yīng)多種脅迫的基因,進(jìn)而培育能夠同時(shí)抵御多種極端環(huán)境的作物品種。如水稻NAC家族轉(zhuǎn)錄因子Os NAC2的RNA干擾株系同時(shí)具有對干旱脅迫和高鹽脅迫的耐受性[29];而在番茄中過表達(dá)自身的SIAREB1基因則能同時(shí)增強(qiáng)番茄對鹽和干旱脅迫的耐受性[30]。OsPM1作為編碼一種ABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能基因,過表達(dá)能夠增強(qiáng)水稻的干旱耐受能力[7]。本文對OsPM1在抵御非生物脅迫中的作用進(jìn)行了進(jìn)一步研究,發(fā)現(xiàn)該基因還受滲透、高鹽以及高溫脅迫的誘導(dǎo),并且過表達(dá)OsPM1后,水稻抵御滲透脅迫、高鹽脅迫、高溫脅迫的能力都得到了增強(qiáng)。因此,該基因作為一個(gè)能夠在多種脅迫反應(yīng)中發(fā)揮功能的基因,具有可用于培育兼具多種抗逆性的水稻品種的潛力。然而,由于本研究均為在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下模擬單一脅迫,至于在多種脅迫并存時(shí)尤其是在野外環(huán)境下OsPM1的轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)如何,還有待進(jìn)一步研究。

在本研究中我們還發(fā)現(xiàn),水稻熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子Os Hsf A2b、Os Hsf A2e、Os Hsf A3都對OsPM1有一定的轉(zhuǎn)錄激活作用。因此我們推測,OsPM1在水稻熱脅迫響應(yīng)中的功能很可能是通過Os Hsfs的直接或間接激活實(shí)現(xiàn)的,而OsPM1在各種非生物脅迫中更加詳細(xì)的作用機(jī)制還需更深入的研究。

高溫會(huì)嚴(yán)重降低水稻的產(chǎn)量。亞洲栽培稻分為秈亞種和粳亞種,其中秈稻耐熱性強(qiáng),而粳稻喜溫卻不耐熱,因其各自適宜的生長環(huán)境不同在我國形成了“南秈北粳”的水稻種植格局[31]。相較于秈稻而言,粳稻米粒黏性更強(qiáng),適口性好,因此也更受大眾歡迎。南方的粳稻種植面積隨著近年來“秈改粳”的不斷推進(jìn)展現(xiàn)出逐漸增加的態(tài)勢,但粳稻耐熱性差,導(dǎo)致其在高溫年份嚴(yán)重減產(chǎn)。我國長江以南地區(qū)夏季溫度經(jīng)常在37℃以上,提高粳稻耐熱性便尤為重要。因此我們以口感好但不耐熱的粳稻日本晴為背景進(jìn)行轉(zhuǎn)基因,以獲得兼具優(yōu)質(zhì)口感和耐熱性的水稻品系。

目前已經(jīng)有一些基因在水稻中過表達(dá)能夠提高其耐熱性。例如,將OsWRKY11與水稻HSP101啟動(dòng)子融合后轉(zhuǎn)入水稻品種Sasanishiki中,其耐熱性和耐旱性均得到增強(qiáng)[32];在亞洲水稻品種“長優(yōu)1號(hào)”中異源表達(dá)擬南芥的AtPLC9基因后,其耐熱性也顯著增強(qiáng)[33]。在本研究中,我們選用了耐熱性較強(qiáng)的禾本科植物高粱的熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子Sb Hsf03,將其編碼基因在粳稻品種日本晴中異源表達(dá),獲得的轉(zhuǎn)基因植物耐熱性顯著增強(qiáng),45℃處理1個(gè)月后其存活率仍為100%。

在以往的研究中,有一些轉(zhuǎn)基因植物在轉(zhuǎn)入抗逆轉(zhuǎn)錄因子后,雖然抗逆性得到了顯著提高,但植物出現(xiàn)了生長缺陷。例如,向水稻中轉(zhuǎn)入玉米泛素啟動(dòng)子(Ubi-1)驅(qū)動(dòng)的WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子WRKY45的編碼基因后,轉(zhuǎn)基因水稻對稻瘟病菌的抗性增強(qiáng),但植株生長遲緩[34];CaMV35s啟動(dòng)子或玉米泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的水稻OsDREB1或擬南芥DREB1轉(zhuǎn)入水稻后,轉(zhuǎn)基因株系對干旱、高鹽和低溫脅迫的耐受性均增強(qiáng),但在無脅迫的正常生長條件下也表現(xiàn)出生長遲緩[35]。有研究表明,將組成型啟動(dòng)子換為脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能夠在很大程度上減小過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子給轉(zhuǎn)基因植株正常生長帶來的不良影響。在擬南芥中過表達(dá)DREB1A激活了許多抗逆基因的表達(dá),從而提高了植株對干旱、高鹽和凍害的耐受性,但在正常生長條件下,使用CaMV35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)DREB1A的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出嚴(yán)重的生長遲緩,相比之下,DREB1A在脅迫誘導(dǎo)型rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下對植物生長的影響很小,而且轉(zhuǎn)基因植物的逆境耐受性比CaMV35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)DREB1A的轉(zhuǎn)基因植物更強(qiáng)[36]。在本研究中,我們利用OsPM1的脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)高粱熱休克轉(zhuǎn)錄因子Sb Hsf03的編碼基因,轉(zhuǎn)化不耐熱的粳稻日本晴,獲得了既具有很強(qiáng)耐高溫能力又不影響植株正常生長的粳稻品系。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,熱脅迫對水稻的影響主要在生殖生長期,生殖生長期高溫會(huì)嚴(yán)重影響水稻的育性。本文主要鑒定了轉(zhuǎn)基因品系在營養(yǎng)期的耐高溫能力,為后續(xù)的耐熱性鑒定奠定了基礎(chǔ),今后也將進(jìn)一步觀察該品系在生殖期高溫天氣下的結(jié)實(shí)率及耐熱性變化。