津力達顆粒對高糖作用下小鼠胰島β細胞增殖和凋亡的影響

陳偉，王之旸，付友娟，劉子微，樂嶺，

(1.湖北中醫(yī)藥大學第一臨床學院，武漢 430070；2.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院內分泌科，武漢 430070)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是在遺傳和環(huán)境等多因素作用下β細胞功能逐漸衰竭的代謝性疾病，其中糖毒性在胰島β細胞衰竭中起重要作用[1]。改善高糖對β細胞的毒性作用是治療糖尿病的關鍵途徑之一。近年來中藥治療糖尿病的熱點研究發(fā)現(xiàn)，胰島β細胞功能與中醫(yī)脾主運化功能密切相關，根據中醫(yī)辨證論治理論使用益氣健脾養(yǎng)陰中藥可有效治療糖尿病，保護胰島β細胞[2]。津力達顆粒(Jinlidagranules，JLD)有健脾助運、益氣養(yǎng)陰之功，多項研究表明它在降低血糖的同時可改善T2DM患者氣陰兩虛證的癥狀[3-4]，但JLD能否保護胰島β細胞尚不明確。因此，本研究擬通過觀察JLD對體外高糖環(huán)境下的小鼠胰島β細胞增殖、凋亡及胰島素分泌的影響，探討JLD對高糖誘導的胰島β細胞損傷的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 MIN6 細胞(CRL-3237)購自美國菌種保藏中心(ATCC)。JLD(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批準文號：國藥準字Z20050845)。D-葡萄糖分析純(國藥集團化學試劑有限公司，批號 ：WHC2006-0621)；低糖(5.5 mmol·L-1) 達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)(美國Hyclone公司，批號：JM-SH30021.01B)；高糖培養(yǎng)基自配，即稱取D-葡萄糖溶于DMEM培養(yǎng)基，配制成終濃度25.0 mmol·L-1葡萄糖溶液；0.25%胰酶(美國Gibco公司，批號：15050065)；10%胎牛血清(美國Corning公司，批號：35-076-CV)；兔單抗p-Smad2/3、兔抗Smad2/3、兔多抗Bax、兔多抗Bcl-2均購自Cell signaling(批號：8828，8685，50599-2-Ig，12789-1-AP)；兔多抗Caspase-3(武漢三鷹生物技術有限公司，批號：19677-1-AP)；內參(GAPDH)抗體(杭州賢至生物有限公司，批號：AB-P-R 001)； 辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1054)。小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(武漢優(yōu)爾生商貿有限公司，批號：CEA448Mu)；細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物，批號：KGA108)；細胞增殖檢測試劑盒(噻唑藍，MTT)(BIOSHARP公司，批號：0793)；電化學發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)底物液(Thermo，批號：NCI5079)；X光膠片購自柯達(XBT-1)；顯影定影試劑盒(天津市漢中攝影材料廠，D-76，批號：20190309)。倒置顯微鏡(日本OLYMPUS株式會社，IX51)；全自動酶標儀(Thermo scientific，Multiskan MK3)；微型高速離心機(美國Labnet，C2500-R-230 V)；低速離心機(德國Eppendorf公司，5702R)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONE，ICV-450)；流式細胞儀(美國BD公司，BD FACSCalibur)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將MIN6細胞在含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素的 DEME基礎培養(yǎng)基5 mL中培養(yǎng)，置于飽和濕度、溫度37 ℃和5%二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱中，生長至約80%融合時，收集細胞，在原瓶中以1：2至1：3傳代培養(yǎng)。

1.2.2分組及干預 MTT法篩選JLD最佳干預濃度為200 mg·L-1。參考高糖誘導MIN6損傷模型方法[5]，在干預之前，將所有細胞與5.5 mmol·L-1葡萄糖共同孵育24 h，再分別在5.5，25 mmol·L-1葡萄糖加或不加200 mg·L-1JLD繼續(xù)培養(yǎng)48 h。根據不同培養(yǎng)條件分為4組，①正常對照(normal control，NC)組：5.5 mmol·L-1葡萄糖；②JLD組：5.5 mmol·L-1葡萄糖+200 mg·L-1JLD；③高糖(high glucose，HG)組：25 mmol·L-1葡萄糖；④HG+JLD組：25 mmol·L-1葡萄糖+200 mg·L-1JLD。

1.2.3ELISA法測葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS) 按條件培養(yǎng)MIN6細胞后，棄上清液，分別加入含2.8，16.7 mmol·L-1葡萄糖KRBH緩沖培養(yǎng)液37 ℃孵育0.5 h，收集各組細胞上清液檢測胰島素，每組設3個復孔，同時分別設空白孔、標準孔，采用小鼠胰島素ELISA試劑盒，依照說明書進行檢測：在各孔中依次加入標準品50 μL、抗小鼠胰島素抗體50 μL、HRP標記的親和素100 μL，再加顯色底物 90 μL避光孵育15 min，最后加入終止液50 μL，終止反應，藍色轉黃色，立即用酶標儀在450 nm波長測量各孔的吸光度(A值)，繪制標準曲線計算每組樣品胰島素濃度。

1.2.4MTT法檢測細胞增殖 按照條件培養(yǎng)MIN6細胞，每組3個復孔，每孔加入 MTT10 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h；吸出培養(yǎng)基，加入二甲亞砜150 μL震蕩10 min；于酶標儀波長568 nm處測定各孔A值，取各組平均值后，計算細胞增殖率[細胞增殖率(%)=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%]。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒，依照說明書進行檢測：①加入 緩沖液500 μL，重懸細胞；②AnnexinV-FITC 5 μL，混勻后加入 PI 5 μL，混勻；③室溫避光反應5～15 min(同時設陰性對照，即正常細胞不加AnnexinV-FITC和PI；陽性對照1，以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對照，只加AnnexinV-FITC單標5 μL；陽性對照2，以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對照，只加 PI單標5 μL)。最后在1 h內采用流式細胞儀分析凋亡細胞比例。每組細胞檢測各重復3次，取平均值。

1.2.6免疫印跡法(Western blotting)檢測蛋白表達 終止培養(yǎng)后，收集各組細胞，提取蛋白，通過二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，每組蛋白質樣本40 μg，在沸水下變形10 min，通過凝膠電泳分離，轉移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride，PVDF)。轉膜結束后，室溫下，5%脫脂奶封閉2 h，隨后將PVDF膜浸泡于用封閉稀釋液稀釋的一抗[GADPH、Smad2/3、p-Smad2/3(1：1000)、Bcl-2(1：2000)、Caspase-3(1：600)、Bax(1：3000)]孵育液中，4 ℃孵育過夜，三羥甲基氨甲烷緩沖鹽溶液(trisbuffered saline with tween 20，TBST)充分洗滌PVDF膜，再在37 ℃下用稀釋的HRP(1：50 000)搖床孵育2 h，TBST充分洗滌PVDF膜。電化學發(fā)光顯影，使用BandScan分析膠片灰度值。

2 結果

2.1JLD增加高糖環(huán)境下的MIN6細胞的GSIS 16.7 mmol·L-1葡萄糖刺激的NC組、JLD組、HG組、HG+JLD組GSIS較2.8 mmol·L-1葡萄糖刺激時升高(P<0.01)。在2.8 mmol·L-1葡萄糖刺激下，HG組GSIS低于NC組(P<0.01)，JLD組與正常對照組、HG+JLD組與HG組GSIS相似(P>0.05)。在16.7 mmol·L-1葡萄糖刺激下，HG組GSIS低于NC組(P<0.01)，JLD組與NC組GSIS相似(P>0.05)；HG+JLD組GSIS高于HG組(P<0.01)。見表1。

表1 4組胰島細胞的GSIS比較 Tab.1 Comparison of GSIS from islet cells among four groups

2.2JLD促進高糖作用下的MIN6細胞增殖 NC組、JLD組、HG組和HG+JLD組MIN6細胞增殖率分別為(99.67±2.08)%，(106.33±2.00)%，(68.33±2.08)%和(84.33±4.04)%。 與NC組比較，HG組細胞增殖率降低(t=-14.25，P<0.01)， JLD組細胞增殖率相似(P>0.05)。HG+JLD組較HG組細胞增殖率增高(t=15.31，P<0.01)。

2.3JLD抑制高糖誘導的MIN6細胞凋亡 與NC組比較，JLD組早、晚期細胞凋亡率下降(P<0.05或P<0.01)，HG組細胞早、晚期凋亡率上升(均P<0.01)。HG+JLD組較HG組的早、晚期細胞凋亡率下降(均P<0.01)。見圖1。

A.NC組；B.JLD組；C.HG組；D.HG+JLD組。①與NC組比較，t=-14.28，P<0.05；②與NC組比較，t=7.97，6.06，27.17，P<0.01；③與HG組比較，t=-50.68，-16.86，P<0.01。圖1 4組流式細胞圖 A.NC group；B.JLD group；C.HG group；D.HG+JLD group.①Compared with NC group，t=-14.28，P<0.05；②Compared with NC group，t=7.97，6.06，27.17，P<0.01；③Compared with HG group，t=-50.68，-16.86，P<0.01.Fig.1 Flow cytometry in four groups of cells

2.4JLD抑制高糖環(huán)境下的MIN6細胞p-Smad2/3、Caspase-3-2、Bax蛋白表達、促進Bcl-2蛋白表達 與NC組比較，HG組的p-Smad2/3、Caspase-3-2、Bax蛋白表達顯著上調(均P<0.01)，Bcl-2蛋白表達顯著下調(P<0.01)，Smad2/3、Caspase-3-1的蛋白表達相仿(P>0.05)；JLD組的Smad2/3、p-Smad2/3、Caspase-3-1、Caspase-3-2、Bcl-2、Bax蛋白表達均相似(均P>0.05)。與HG組比較，HG+JLD組p-Smad2/3、Caspase-3-2、Bax蛋白表達均下調(P<0.01或P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著上調(P<0.01)，Smad2/3、Caspase-3-1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

①與NC組比較，t=24.83，22.97，10.61，-10.61，P<0.01；②與HG組比較，t=-17.76，-15.21，7.15，P<0.01；③與HG組比較，t=-7.15，P<0.05。圖2 4組細胞Smad2/3、p-Smad2/3、Caspase-3-1、Caspase-3-2、Bcl-2、Bax相對蛋白水平 ①Compared with NC group，t=24.83，22.97，10.61，-10.61，P<0.01；②Compared with HG group，t=-17.76，-15.21，7.15，P<0.01；③Compared with HG group，t=-7.15，P<0.05.Fig.2 Relative protein levels of Smad2/3，p-Smad2/3，Caspase-3-1，Caspase-3-2，Bcl-2 and Bax in four groups of cells

3 討論

中醫(yī)藥治療糖尿病可協(xié)同降糖、改善癥狀和體征、防治并發(fā)癥及提高生活質量，因其副作用少已成為糖尿病治療的研究熱點。吳以嶺院士的絡病理論認為“脾”是糖尿病病機變化的中心環(huán)節(jié)，發(fā)病基礎關乎脾，渴飲無度害于脾，治療自然應顧及脾。JLD由人參、黃精、蒼術、茯苓、葛根、苦參等17味中藥組成，具有益氣健脾、養(yǎng)陰生津的功效，被《中國2型糖尿病防治指南(2020年版)》推薦用于治療氣陰兩虛型的糖尿病前期和T2DM患者。一項基于15項臨床研究的Meta分析發(fā)現(xiàn)，JLD治療的T2DM病患者與基線時比較胰島素分泌指數(shù)升高、胰島素抵抗指數(shù)降低[6]，提示JLD對胰島素分泌和抵抗均有改善作用。GSIS是評價胰島β細胞分泌功能的重要指標，它主要受磷酸化磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸激酶(phosphoinositide-3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K/AKT)[7]、AKT/糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)[8]、轉化生長因子β/Smad(TGF-β/Smad)[9-10]等信號通路調控。JLD成分中的葛根素、黃精多糖均被證實有促進胰島素分泌的作用。葛根素通過上調胰高糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)受體的表達增強GLP-1刺激胰島素分泌的作用[11]。黃精多糖可降低胰島β細胞對氧化應激的敏感性，減輕胰腺免疫損傷和自由基損傷，從而改善胰島β細胞的分泌功能[12]。本實驗觀察到JLD可改善高糖作用下胰島β細胞GSIS，可能與JLD組分的協(xié)同作用有關。同時觀察到JLD不增加正常環(huán)境下以及低糖刺激時的β細胞的GSIS，考慮JLD對胰島β細胞的刺激可能與葡萄糖濃度有關，JLD對MIN6細胞GSIS是否呈現(xiàn)葡萄糖依賴性，有待進一步研究其作用機制。

JLD改善胰島β細胞GSIS亦可能與其促進胰島β細胞增殖、抑制凋亡有關。筆者既往研究[13-14]發(fā)現(xiàn)JLD可促進高糖作用下小鼠胰島微血管內皮細胞及人臍靜脈內皮細胞增殖，抑制高糖誘導的微血管內皮細胞、人臍靜脈內皮細胞、SD大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞凋亡，其機制可能與抑制細胞外信號調節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)[14]信號通路有關。文獻報道葛根素可上調 GLP-1受體激活PI3K/AKT通路，促進高脂飲食模型大鼠β 細胞增殖而減少其凋亡[11]；黃精多糖可通過減少高糖刺激的超氧化物歧化酶發(fā)生非酶糖基化，減輕胰島氧化損傷而減少胰島細胞凋亡[12]。筆者觀察到高糖對MIN6細胞具有抑制增殖和促進凋亡的作用，使用JLD干預后，高糖+JLD組胰島β細胞增殖受到促進，凋亡被抑制。因此認為JLD可能具有促進高糖環(huán)境下胰島β細胞增殖，抑制其凋亡的作用，其機制可能與組方中多個成分有關。

TGF-β/Smad是細胞內重要的信號通路，被認為與增殖和凋亡過程密切相關[15]，以MIN6和小鼠胰島為實驗對象的體外實驗發(fā)現(xiàn)抑制TGFβ信號通路可促進胰島β細胞增殖[9- 10]。Smad是TGF-β通路重要的效應蛋白，TGFβ激活素誘導Smad蛋白磷酸化，p-Smad2和p-Smad3與Smad4形成復合體在細胞核內聚集調節(jié)靶基因轉錄，調控細胞生長、分化、凋亡等過程。JLD組方中葛根、山茱萸可通過上調ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2蛋白表達調節(jié)MIN6細胞增殖與凋亡[16]。人參的多種提取物可通過TGF-β/Smad途徑調節(jié)細胞生長、分化、凋亡等病理生理過程[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)高糖作用下MIN6細胞增殖減少、凋亡增加并伴p-Smad2/3表達上調，加用JLD可下調p-Smad2/3表達，上述作用被阻斷，提示p-Smad2/3可能介導了JLD對高糖作用下MIN6細胞的保護作用。

Caspase-3是凋亡過程中關鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，活化的Caspase-3(Caspase-3-2)因可裂解細胞蛋白質故被認為是細胞凋亡標志物。Bcl家族中的Bcl-2、Bax可控制線粒體通透性并促進細胞色素C的通過。Bax上調、Bcl-2下調可喪失線粒體膜電位并釋放細胞色素C，進而引發(fā) Caspase-3 活化并導致細胞凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)，高糖上調胰島β細胞Caspase-3-2、Bax，下調Bcl-2，細胞凋亡率明顯上升，加入JLD顯著下調Caspase-3-2和Bax，降低凋亡率。提示高糖通過調控Caspase-3-2、Bax、Bcl-2誘導胰島β細胞凋亡[18]，而JLD可改善上述蛋白的異常表達，抑制高糖環(huán)境下的胰島β細胞凋亡。但確切的機制有待更深入的分子生物學和動物、臨床研究證實。

本研究探討了高糖環(huán)境下JLD對胰島β細胞功能的作用，以及對β細胞增殖凋亡的影響和可能機制，還探究了低糖環(huán)境下JLD對胰島β細胞分泌功能的影響，為JLD降糖作用和安全性提供了更多的基礎證據。