救必應(yīng)對(duì)小腸黏膜損傷模型大鼠的防治作用及其機(jī)制*

梁欣儀，李茹柳，劉乙婷，陳婉霞，曾信平，胡玲

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心、脾胃研究所，廣州 510405)

嶺南中藥救必應(yīng)為冬青科植物鐵冬青(IlexrotundaThunb.)的干燥樹皮，性寒味苦，歸肺、胃、大腸、肝經(jīng)，具有清熱解毒、利濕止痛功效，常用于治療暑濕發(fā)熱、咽喉腫痛、濕熱瀉痢、脘腹脹痛、風(fēng)濕痹痛、濕疹、瘡癤、跌打損傷等[1]，最早記載于《嶺南采藥錄》，也是《中華人民共和國藥典》2010年、2015年、2020年版收錄的品種。救必應(yīng)有調(diào)理脾胃作用，臨床上應(yīng)用廣泛。國醫(yī)大師鄧鐵濤、廣東省名中醫(yī)勞紹賢等嶺南醫(yī)者常用救必應(yīng)配伍其他中藥治療濕熱內(nèi)蘊(yùn)或肝郁內(nèi)熱慢性胃腸疾病，如難治性消化性潰瘍、慢性萎縮性胃炎、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎等[2-4]。另外，含有救必應(yīng)的中成藥腹可安片、飛揚(yáng)腸胃炎膠囊等廣泛用于治療急慢性胃腸炎等。但救必應(yīng)調(diào)理脾胃作用機(jī)制的研究較少，本研究在吲哚美辛致大鼠小腸黏膜損傷模型上，觀察其對(duì)小腸黏膜損傷的防治作用并分析其機(jī)制，檢測指標(biāo)包括腸黏膜屏障功能相關(guān)指標(biāo)(緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1，黏附連接蛋白E-cadherin、α-catenin、β-catenin，腸通透性指標(biāo)血漿D-乳酸)以及腸特異性轉(zhuǎn)錄因子CDX-2，從促進(jìn)腸黏膜損傷修復(fù)角度探討救必應(yīng)調(diào)理脾胃的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物和動(dòng)物 救必應(yīng)為冬青科植物鐵冬青IlexrotundaThunb.的干燥樹皮，購于廣州市三元里杏園春藥店，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室童家赟副教授鑒定藥材性狀符合《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。

SD大鼠，雄性，無特定病原體(SPF)級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證：SCXK(粵)2018-0034；實(shí)驗(yàn)環(huán)境：SPF級(jí)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(粵)2018-0001。大鼠飼養(yǎng)條件：12 h明暗交替、溫度為18～26 ℃，日溫差≤3 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。10%水合氯醛麻醉后取樣及處死。

1.1.2試劑和主要儀器 吲哚美辛(美國Sigma公司，批號(hào)：056M4036V)；通用鏈霉卵白素-生物素法免疫組化試劑盒(SP-9000)、二氨基聯(lián)苯胺(diamino-benzidine，DAB)試劑盒(北京中杉金橋有限公司)； ZO-1抗體(61-7300)，Occludin抗體(40-4700)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白定量試劑盒(凱基生物公司)；D-乳酸試劑盒(cat#13810，lot：2391443)(美國ATT，bioquest公司)；Claudin-1抗體(ab15098)、E-cadherin抗體(ab76055)、β-catenin抗體(ab32572)、α-catenin抗體(ab51032)、CDX-2抗體(ab76541)(英國abcam公司)；二抗：山羊抗兔IgG H&L(HRP，ab205718)，山羊抗小鼠IgG H&L(HRP，ab6789)。

ME204型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，感量：0.1 mg)，ClarityTMwestern ECL substrate、ChemiDocTMXRS+成像儀、TM電泳儀、垂直電泳儀槽(美國BIO-RAD公司)；DNA Expert型多用途微量板檢測儀(奧地利TECAN公司)；HeraousMultifuge X1R離心機(jī)(美國 Thermo Fisher公司)。

1.2方法

1.2.1救必應(yīng)水提物的制備 稱取救必應(yīng)藥材600 g，掰成小塊，12倍體積量純水浸泡2 h，180 ℃煮開，后用120 ℃煮2 h，紗布過濾；濾渣用12倍體積純水煎煮2 h，紗布過濾，合并2次濾液；濾液濃縮至1 g·mL-1(約600 mL)，-60 ℃過夜，次日真空干燥2 d，得救必應(yīng)水提物凍干粉105 g(得率為17.5%)，-20 ℃保存。

1.2.2動(dòng)物分組、造模和給藥方法 按Excel軟件產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分成正常對(duì)照組6只，模型對(duì)照組及救必應(yīng)小、大劑量(8，16 g·kg-1)組各10只；大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，體質(zhì)量(260±10) g；造模前受試藥組灌胃救必應(yīng)水提物(8，16 g·kg-1)，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組灌胃等體積純水；1 h后，模型對(duì)照組和受試藥組分別皮下注射吲哚美辛5 mg·kg-1造模，正常對(duì)照組皮下注射等體積0.9%氯化鈉溶液。按10 mL·kg-1體積灌胃和皮下注射均為每天1次，共4 d；末次灌胃后禁食不禁水24 h，第5天以10%水合氯醛20 mL·kg-1腹腔注射麻醉大鼠，剖腹，腹主靜脈采血，并取小腸組織剪開；肉眼觀察小腸黏膜損傷情況，按評(píng)分細(xì)則計(jì)算損傷的大體評(píng)分；取損傷最明顯的小腸組織(長約2 cm)置4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下進(jìn)行小腸組織病理評(píng)分；其余小腸冰上刮取黏膜組織，-80 ℃冰箱保存，以備后續(xù)免疫印跡(Western blotting)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3小腸黏膜損傷大體及病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 小腸黏膜損傷大體評(píng)分[5]：按潰瘍和粘連分別評(píng)分，總分為二者之和。潰瘍?cè)u(píng)分：游標(biāo)卡尺測量全小腸的潰瘍長度，每一毫米計(jì)1分，寬度>1 mm計(jì)分加倍，累積評(píng)分。粘連評(píng)分：無粘連為0分；粘連較輕，少許力量即可將小腸與其他組織分開為1分；粘連較重為2分。

小腸黏膜損傷病理評(píng)分[6]，顯微鏡下觀察小腸組織病理變化。0分：腸黏膜絨毛正常；1分：絨毛頂端上皮下出現(xiàn)囊狀間隙，并伴有毛細(xì)血管充血；2分：上皮下間隙擴(kuò)大，中度固有層水腫，中央乳糜管擴(kuò)張；3分：固有層明顯水腫，腸黏膜上皮層細(xì)胞變性、壞死，少數(shù)絨毛頂端脫落；4分：上皮細(xì)胞層變性壞死、脫落，部分絨毛脫落、固有層裸露，毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血；5分：絨毛脫落，固有層崩解，出血或潰瘍形成。

1.2.4免疫組化法檢測小腸組織蛋白表達(dá) 組織切片60 ℃加熱1 h，常規(guī)脫蠟、水化；放進(jìn)0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液(pH值6.0)，微波爐加熱修復(fù)抗原，先中高火9 min，自然冷卻15 min，再高火5 min，自然冷卻1 h；SP法阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，每次5 min；正常山羊血清封閉液封閉15 min；孵育一抗(ZO-11：200，Occludin 1：100，Claudin-1 1：100，E-cadherin 1：100，α-catenin 1：100，β-catenin 1：100，CDX-2 1：100)，4 ℃過夜，37 ℃復(fù)溫45 min，甩去一抗，沖洗，滴加二抗，室溫孵育15 min，沖洗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min，沖洗，擦干，DAB室溫顯色10 min，顯微鏡下控制染色程度(細(xì)胞質(zhì)呈棕色則判為陽性表達(dá)細(xì)胞)；自來水沖洗5 min終止反應(yīng)；蘇木精復(fù)染，自來水沖洗2 min；常規(guī)脫水，中性樹膠封片、鏡檢。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、救必應(yīng)水提物16和8 g·kg-1組全部樣本均進(jìn)行免疫組化檢測，若顯色失敗、染色效果較差時(shí)，則視作脫落樣本不納入統(tǒng)計(jì)。

組織切片鏡檢方法及圖片數(shù)據(jù)化：顯微鏡下所見棕黃色顆粒即為所測蛋白陽性表達(dá)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野(×200)進(jìn)行評(píng)分，該5個(gè)視野再選取重點(diǎn)部位顯微鏡下(×400)觀察該蛋白表達(dá)。ImageJ軟件及IHC-Profiler插件處理圖片，軟件自動(dòng)分離棕黃色部分(目標(biāo)蛋白)進(jìn)行測量，并得出“Negative，Low positive，Positive，and High positive”[7]。將軟件所得結(jié)果量化，Negative為0分，Low positive為1分，Positive為2分，High positive為3分，計(jì)算每張切片5個(gè)視野的平均陽性得分，即為該蛋白表達(dá)的半定量結(jié)果。

1.2.5Western blotting法檢測小腸黏膜蛋白表達(dá) 總蛋白提取及蛋白樣品準(zhǔn)備，勻漿：小腸黏膜組織每50 mg加裂解液1 mL，低溫快速電動(dòng)勻漿。12000×g離心，4 ℃，15 min，冰上靜置30 min。取少量上清液進(jìn)行定量，用BCA試劑盒進(jìn)行測定。將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合加5倍緩沖液，100 ℃變性10 min，冰上30 s冷卻，上樣，余下樣品-20 ℃保存。正常對(duì)照組、救必應(yīng)水提物16 g·kg-1組全部樣本進(jìn)行Western blotting檢測，模型對(duì)照組和救必應(yīng)水提物8 g·kg-1組按隨機(jī)數(shù)字表各取6個(gè)樣本進(jìn)行Western blotting檢測。

蛋白質(zhì)免疫印跡，制膠：按照伯樂快速制膠試劑盒說明書配制。電泳：所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，先用恒壓80 V，當(dāng)跑至分離膠后改為200 V。轉(zhuǎn)膜：恒流250 mA電轉(zhuǎn)1.5～2 h。封閉：取膜，TBST洗5 min，3次，用5%脫脂奶粉封閉1.5 h。孵育一抗：TBST洗膜，切膜，并放于對(duì)應(yīng)的稀釋后的一抗4 ℃過夜(ZO-1 1：500，Occludin 1：500，Claudin-1 1：500，E-cadherin 1：1000，α-catenin 1：1000，β-catenin 1：1000，CDX-2 1：500)。室溫復(fù)溫20 min。孵育二抗：TBST洗膜，放入對(duì)應(yīng)的稀釋好的二抗1 h(鼠二抗及兔二抗1：5000)。顯影：TBST洗膜，顯影液浸泡30 s后顯影。圖像處理：用ImageJ軟件處理得到所對(duì)應(yīng)的吸光度(A值)。

1.2.6Amplite熒光法測血漿D-乳酸 按D-乳酸測定試劑盒說明書步驟，用DNA Expert型多用途微量板檢測儀檢測，發(fā)射波長/激光波長=532/590 nm，讀取吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血漿D-乳酸濃度。

2 結(jié)果

2.1救必應(yīng)水提物對(duì)大鼠小腸黏膜損傷的影響(大體評(píng)分) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)模型對(duì)照組和救必應(yīng)小劑量組動(dòng)物死亡各2只(2/10)，救必應(yīng)大劑量組死亡4只(4/10)，動(dòng)物死亡原因均為造模所致小腸穿孔，4組死亡數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

對(duì)各組存活大鼠進(jìn)行小腸黏膜損傷大體評(píng)分，結(jié)果見表1。正常對(duì)照組大鼠小腸黏膜無粘連，黏膜未見明顯異常；模型對(duì)照組大鼠小腸腸管可見不同程度粘連，小腸黏膜均可見充血、糜爛、多發(fā)潰瘍?cè)罴按┛?，潰瘍?cè)畛始t褐色，大體評(píng)分較正常對(duì)照組明顯增高(P<0.01，死亡大鼠不納入統(tǒng)計(jì)，下同)，提示造模成功。救必應(yīng)水提物小劑量組可見小腸粘連，但程度輕于模型對(duì)照組，小腸腸管內(nèi)可見多處潰瘍?cè)?，但潰瘍總長度及總面積較模型對(duì)照組小，大體評(píng)分較模型對(duì)照組低(P<0.05)；救必應(yīng)大劑量組大鼠小腸見少量粘連，小腸腸管內(nèi)可見多處潰瘍?cè)?，但潰瘍總長度及總面積較模型對(duì)照組減小(圖1)，大體評(píng)分較模型對(duì)照組低(P<0.01)。表明救必應(yīng)水提物對(duì)吲哚美辛大鼠小腸黏膜損傷有防治作用。

由圖1及表1可見，正常對(duì)照組大鼠小腸可見輕微的黏膜層絨毛上皮細(xì)胞脫落，考慮跟飼養(yǎng)環(huán)境及動(dòng)物批次有關(guān)；模型對(duì)照組大鼠可見小腸黏膜損傷形成，黏膜層絨毛及腸腺完全壞死，肌層肌細(xì)胞壞死，漿膜層及脂肪組織見結(jié)締組織增生，病理評(píng)分較正常對(duì)照組明顯增高(P<0.01)；救必應(yīng)大劑量組也可見小腸黏膜損傷，部分為固有層裸露或充血水腫，病理評(píng)分較模型對(duì)照組降低(P<0.01)；救必應(yīng)小劑量組損傷較模型對(duì)照組有所減輕，絨毛表面上皮細(xì)胞脫落，固有層崩解，但與模型對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本結(jié)果從病理評(píng)分角度表明救必應(yīng)水提物對(duì)吲哚美辛所致大鼠小腸黏膜損傷有改善作用。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.救必應(yīng)小劑量組；D.救必應(yīng)大劑量組。圖1 4組大鼠小腸黏膜組織病理變化(HE，×200) A.normal control group；B.model control group；C.Ilex rotunda Thunb. low dose group；D.Ilex rotunda Thunb. high dose group.Fig.1 Histopathological changes of small intestinal mucosa in four groups of rats(HE，×200)

表1 4組大鼠小腸黏膜損傷大體及病理評(píng)分比較 Tab.1 Comparison of gross and pathological scores of small intestinal mucosal injury among four groups of rats

2.2救必應(yīng)水提物對(duì)造模大鼠小腸黏膜緊密連接蛋白表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果見圖2，正常對(duì)照組緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1在小腸黏膜絨毛和隱窩可見表達(dá)；與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小腸黏膜ZO-1、Occludin和Claudin-1表達(dá)均下降(均P<0.05)，提示吲哚美辛誘導(dǎo)小腸黏膜損傷可致緊密連接蛋白表達(dá)下降；與模型對(duì)照組比較，救必應(yīng)小、大劑量組大鼠ZO-1、Occludin和Claudin-1表達(dá)升高(P<0.05或P<0.01)。圖2顯示(由于技術(shù)原因未取得ZO-1的 Western blotting結(jié)果)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組緊密連接蛋白Occludin、Claudin-1表達(dá)降低(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，救必應(yīng)小、大劑量組大鼠Occludin和Claudin-1表達(dá)升高(P<0.05或P<0.01)。表明救必應(yīng)水提物防治大鼠小腸黏膜損傷的作用與其提高小腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1表達(dá)有關(guān)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.救必應(yīng)小劑量組；D.救必應(yīng)大劑量組；①與正常對(duì)照組比較，χ2=-2.863～-2.674(IHC)，t=0.003～0.798(WB)，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，χ2=-3.253～-2.650(IHC)，P<0.05；③與模型對(duì)照組比較，t=-0.129～0.644(WB)，P<0.01。圖2 免疫組化法(IHC)和免疫印跡法(WB)檢測4組大鼠ZO-1、Occludin和Claudin-1水平及其半定量分析結(jié)果(×200) A.normal control group；B.model control group；C.Ilex rotunda Thunb.low dose group ；D.Ilex rotunda Thunb.high dose group.①Compared with normal control group，χ2=-2.863—-2.674(IHC)，t=0.003-0.798(WB)，P<0.05；②Compared with model control group，χ2=-3.253—-2.650(IHC)，P<0.05； ③Compared with model control group，t=-0.129—0.644(WB)，P< 0.01.Fig.2 ZO-1，Occludin and Claudin-1 detected by immunohistochemistry(IHC)，Western blotting(WB) and their semi-quantitative analysis results in four groups of rats(×200)

2.3救必應(yīng)水提物對(duì)造模大鼠小腸黏膜粘附連接蛋白表達(dá)的影響 免疫組化和免疫印跡檢測結(jié)果見圖3，正常對(duì)照組粘附連接蛋白E-cadherin、α-catenin和β-catenin在小腸黏膜絨毛和隱窩可見表達(dá)；與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小腸黏膜E-cadherin、α-catenin和β-catenin表達(dá)下降(均P<0.05或P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，救必應(yīng)小、大劑量組大鼠E-cadherin、α-catenin和β-catenin表達(dá)升高(P<0.05或P<0.01)。表明救必應(yīng)水提物防治大鼠小腸黏膜損傷的作用與其提高小腸黏膜緊密連接蛋白E-cadherin、α-catenin和β-catenin表達(dá)有關(guān)。

2.4救必應(yīng)水提物對(duì)造模大鼠小腸黏膜CDX-2表達(dá)的影響 免疫組化和免疫印跡檢測結(jié)果見圖4，正常對(duì)照組CDX-2在小腸黏膜絨毛和隱窩可見表達(dá)；與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小腸黏膜CDX-2表達(dá)下降(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，救必應(yīng)小、大劑量組大鼠小腸黏膜CDX-2表達(dá)升高(P<0.01或P<0.05)。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組CDX-2表達(dá)下降(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，救必應(yīng)小、大劑量組大鼠小腸黏膜CDX-2表達(dá)升高(P<0.05或P<0.01)。表明救必應(yīng)水提物能提高吲哚美辛造模大鼠小腸黏膜CDX-2表達(dá)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.救必應(yīng)小劑量組；D.救必應(yīng)大劑量組。①與正常對(duì)照組比較，χ2=-2.806～-2.749(IHC)，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較， χ2=-3.318～-2.693(IHC)，P<0.05；③與正常對(duì)照組比較，t=-1.731～ 1.773(WB)，P<0.01；④與模型對(duì)照組比較，t=-0.652～ 1.680(WB)，P<0.01。圖3 免疫組化法(IHC)和免疫印跡法(WB)檢測4組大鼠E-cadherin、α-catenin和β-catenin蛋白水平及其半定量分析結(jié)果(×200) A.normal control group；B.model control group；C.Ilex rotunda Thunb.low dose group ；D.Ilex rotunda Thunb.high dose group.①Compared with normal control group，χ2=-2.806—-2.749(IHC)，P<0.05； ②Compared with model control group，χ2=-3.318—-2.693(IHC)，P<0.05； ③Compared with normal control group，t=-1.731—1.773(WB)，P< 0.01；④ Compared with model control group，t=-0.652—1.680(WB)，P< 0.01.Fig.3 E-cadherin，α-catenin and β-catenin detected by immunohistochemistry(IHC)，Western blotting(WB) and their semi-quantitative analysis results in four groups of rats(×200)

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.救必應(yīng)小劑量組；D.救必應(yīng)大劑量組。①與正常對(duì)照組比較，χ2=-2.680(IHC)，t=0.106(WB)，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，χ2=-3.385(IHC)，t=1.276(WB)，P<0.01；③與模型對(duì)照組比較，χ2=-2.765(IHC)，t=0.098(WB)，P<0.05。圖4 免疫組化法(IHC)和免疫印跡法(WB)檢測4組大鼠CDX-2蛋白水平及其半定量分析結(jié)果(×200) A.normal control group；B.model control group；C.Ilex rotunda Thunb.low dose group ；D.Ilex rotunda Thunb.high dose group.①Compared with normal control group，χ2=-2.680(IHC)，t=0.106(WB)，P<0.05； ②Compared with model control group，χ2=-3.385(IHC)，t=1.276(WB)，P<0.01； ③Compared with model control group，χ2=-2.765(IHC)，t=0.098(WB)，P<0.05.Fig.4 CDX-2 detected by immunohistochemistry(IHC)，Western blotting(WB) and their semi-quantitative analysis results in four groups of rats(×200)

2.5救必應(yīng)水提物對(duì)造模大鼠血漿D-乳酸的影響 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和救必應(yīng)小、大劑量組血漿D-乳酸分別為(22.100±8.084)，(44.715±13.809)，(30.565±6.590)，(26.284±8.702) μmol·L-1。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血漿D-乳酸升高(t=-9.063，P<0.01)，提示造模大鼠腸通透性增加，腸黏膜屏障受損；與模型對(duì)照組比較，救必應(yīng)小、大劑量組血漿D-乳酸降低(t=-31.983，P<0.05；t=-1.544，P<0.01)。表明救必應(yīng)水提物能抑制吲哚美辛所致的腸通透性增高，有助于恢復(fù)腸屏障功能，促進(jìn)腸黏膜損傷修復(fù)。

3 討論

胃腸黏膜損傷是臨床常見病變，其中非甾體抗炎藥是導(dǎo)致胃腸黏膜損傷的常見因素。報(bào)道顯示，在膠囊內(nèi)窺鏡檢查者中76.3%服用非甾體抗炎藥的受試者發(fā)現(xiàn)了小腸黏膜的糜爛或潰瘍性病變[8]。救必應(yīng)在嶺南地區(qū)廣泛用于治療胃腸病變，但其作用機(jī)制特別是對(duì)小腸病變的干預(yù)作用研究較少，本研究在非甾體抗炎藥吲哚美辛所致大鼠小腸黏膜損傷模型上，觀察救必應(yīng)防治腸黏膜損傷的作用及機(jī)制。

細(xì)胞間連接(緊密連接、粘附連接、縫隙連接和橋粒等)是維持腸黏膜屏障的關(guān)鍵因素，其中緊密連接和粘附連接對(duì)維護(hù)腸黏膜屏障的作用尤為突出。細(xì)胞間連接控制著細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的通透性，從而調(diào)節(jié)腸道屏障通透性[9-10]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性腸病患者在活動(dòng)期緊密連接功能下調(diào)，其超微結(jié)構(gòu)和蛋白組成被改變，并引起腸道通透性增加[11]。本研究結(jié)果表明，救必應(yīng)水提物對(duì)吲哚美辛所致大鼠小腸黏膜損傷有防治作用，作用機(jī)制與其提高造模大鼠小腸黏膜緊密連接蛋白(ZO-1、Occludin和Claudin-1)和黏附連接蛋白(E-cadherin、α-catenin和β-catenin)表達(dá)有關(guān)；川陳皮素、廣藿香提取物等有效組分能通過調(diào)節(jié)緊密蛋白的功能維持腸上皮屏障的完整性和通透性，從而減輕潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀[12]，本研究結(jié)果與之有相似之處，提示細(xì)胞間連接蛋白是調(diào)理脾胃中藥的作用靶點(diǎn)之一。

血漿D-乳酸是反映腸道通透性的指標(biāo)，其在克羅恩病、缺血性腸病等多種消化系統(tǒng)疾病均升高[13]。緊密連接蛋白能反映腸道屏障完整性。結(jié)合腸通透性指標(biāo)血漿D-乳酸能更好反映腸屏障功能。本研究結(jié)果表明，吲哚美辛誘導(dǎo)的大鼠小腸黏膜損傷模型不但導(dǎo)致黏膜細(xì)胞連接蛋白表達(dá)下降，還可致血漿D-乳酸升高，臨床胃腸病變患者也有類似表現(xiàn)[14]；救必應(yīng)不但能提高造模大鼠小腸黏膜細(xì)胞連接蛋白表達(dá)，還能降低造模大鼠血漿D-乳酸水平，表明救必應(yīng)可通過改善腸屏障功能而起腸黏膜保護(hù)作用。

CDX-2為腸特異性轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)節(jié)Rho-GEFs轉(zhuǎn)錄從而激活Rho信號(hào)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組和粘附連接的增強(qiáng)[15]。腸上皮特異性缺乏CDX-2的小鼠出現(xiàn)巨噬細(xì)胞浸潤和促炎級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)[16]。本研究結(jié)果表明，吲哚美辛誘導(dǎo)的大鼠小腸黏膜損傷模型黏膜CDX-2表達(dá)下降，而救必應(yīng)能提高造模大鼠小腸黏膜CDX-2表達(dá)，且有研究報(bào)道黃芩素、黃芩苷等清熱解毒中藥成分通過激活CDX-2而間接激活孕烷X受體，減輕小鼠實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎[17]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之有相似之處。

本研究表明，救必應(yīng)可通過作用于小腸黏膜緊密連接蛋白(ZO-1、Occludin和Claudin-1)和粘附連接蛋白(E-cadherin、α-catenin和β-catenin)、腸特異性轉(zhuǎn)錄因子CDX-2、腸通透性指標(biāo)(血漿D-乳酸)等而防治小腸黏膜損傷，為探討救必應(yīng)腸黏膜損傷修復(fù)作用及機(jī)制提供了參考，也豐富了對(duì)嶺南中藥救必應(yīng)的認(rèn)識(shí)。本研究僅對(duì)救必應(yīng)水提物進(jìn)行動(dòng)物水平的初步機(jī)制研究，后續(xù)可考慮對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)等其他方面開展研究。