β-連環(huán)蛋白、賴氨酰氧化酶樣蛋白2在骨肉瘤組織中表達的相關性及生物學意義

阿不都賽麥提·麥麥吐遜，艾克白爾·吐遜，阿不都拉·阿不都克依木，麥合木提江·穆海麥提，艾尼·買買提

骨肉瘤是臨床常見的原發(fā)性惡性腫瘤，多見于青少年，具有惡性程度高、容易早期發(fā)生遠處轉移、整體預后情況不佳、5年生存率低等特點[1-2]。近些年，骨肉瘤發(fā)病機制的研究越來越多，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是經典Wnt通路中的核心分子，該通路激活后引起β-catenin表達增加并移位進入細胞核，進而調控多種增殖、遷移相關基因的表達，促進細胞的增殖和遷移。一項關于骨肉瘤的臨床研究[3]顯示，骨肉瘤組織中β-catenin的表達水平增加與疾病的預后有關。另有一項研究[4-5]顯示，Wnt通路抑制劑對骨肉瘤細胞的增殖和遷移具有明顯的抑制作用。但是，目前β-catenin表達與骨肉瘤預后的關系尚缺乏國內的臨床證據及相關報道，在骨肉瘤發(fā)病過程中β-catenin的上游調控機制也不十分明確。賴氨酰氧化酶樣蛋白2(LOXL2)是LOX家族中參與癌細胞惡性生物學行為調控的成員，已有研究[6]證實其在卵巢癌細胞的增殖、侵襲過程中對Wnt/β-catenin 通路具有激活作用，但LOXL2在骨肉瘤發(fā)病中是否參與β-catenin的調控尚不清楚。本研究回顧性分析2012年1月～2017年12月我院82例診斷為骨肉瘤患者的資料，以骨肉瘤細胞株為觀察對象，分析β-catenin及LOXL2在骨肉瘤組織中表達的相關性及生物學意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料骨肉瘤患者納入標準：① 接受手術切除并經術后病理診斷為骨肉瘤；② 術后均接受輔助化療；③ Enneking分期Ⅱ、Ⅲ期；④ 臨床病理資料完整；⑤ 隨訪資料完整。排除標準：① 術前接受過放、化療；② 既往有其他惡性腫瘤病史。本研究納入骨肉瘤患者82例，男54例，女28例，年齡7～51(28.67±6.23)歲。另選擇同期在我院接受手術切除并經術后病理診斷為骨軟骨瘤的52例患者作為對照，男34例，女18例，年齡9～48(30.11±8.93)歲。骨肉瘤與骨軟骨瘤患者的性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 β-catenin、LOXL2表達的Western blot檢測取骨肉瘤及骨軟骨瘤組織各約30 mg，加入組織裂解液進行勻漿，勻漿液在4 ℃離心機中12 000g離心10 min，收集上清液進行蛋白表達水平的Western blot檢測。將蛋白樣本與上樣緩沖液混合，100 ℃高溫變性5 min后加入聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，然后電轉至硝酸纖維素(NC)膜，用5%脫脂牛奶對NC膜進行室溫封閉1 h，用β-catenin一抗(1∶1 000稀釋,Abcam公司)、LOXL2一抗(1∶1 000 稀釋,Abcam公司)或β-actin一抗(1∶5 000稀釋,Abcam公司)對NC膜進行4 ℃孵育過夜，次日室溫孵育辣根過氧化物酶(HRP)二抗1 h，最后采用增強型化學發(fā)光(ECL)試劑盒在凝膠成像系統(tǒng)中進行蛋白顯影，得到蛋白條帶及灰度值，以β-actin為內參計算β-catenin、LOXL2的表達水平。

1.3 骨肉瘤患者臨床資料的收集① 臨床資料：性別、年齡、組織類型、病變部位、腫瘤體積、Enneking分期、遠處轉移。② 隨訪資料：采用定期復查、電話回訪等方式隨訪患者的生存情況，以死亡或末次隨訪時間記為總生存期，隨訪截止日期為2020年3月31日。

1.4 細胞實驗培養(yǎng)骨肉瘤細胞株SAOS2，接種在培養(yǎng)板后進行分組：轉染NC siRNA為si-NC組，轉染LOXL2 siRNA為si-LOXL2組。SAOS2細胞接種在12孔培養(yǎng)板內，分組轉染24 h后采用Western blot檢測細胞中LOXL2、β-catenin的表達水平；細胞接種在96孔培養(yǎng)板內，分組轉染24 h后采用MTS法試劑盒(Promega公司)檢測細胞的增殖，染色后在酶標儀上檢測490 nm波長處的吸光值(A490 nm)水平；另取轉染后24 h的細胞，用不含血清的培養(yǎng)基接種在Transwell的上層小室內，下層小室內加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，趨化細胞侵襲12 h后取出上層小室，用結晶紫進行染色并在顯微鏡下觀察，對侵襲細胞進行計數。

2 結果

2.1 骨肉瘤與骨軟骨瘤組織中β-catenin、LOXL2表達水平的比較骨肉瘤組織中β-catenin、LOXL2的平均表達水平明顯高于骨軟骨瘤組織(P<0.05)，見圖1。骨肉瘤組織中β-catenin的表達水平與LOXL2的表達水平呈正相關，相關系數r=0.633，相關性分析的散點圖見圖2。

圖1 骨軟骨瘤與骨肉瘤組織中β-catenin、LOXL2表達水平的比較 與骨軟骨瘤組織比較：*P<0.05 A.β-catenin、LOXL2的電泳圖；B.LOXL2的表達;C.β-catenin的表達

圖2 骨肉瘤組織中β-catenin與LOXL2表達水平的相關性

2.2 β-catenin、LOXL2在不同臨床特征骨肉瘤患者中的表達水平比較見表1。骨肉瘤組織中β-catenin、LOXL2表達水平：不同性別、年齡、組織類型、病變部位患者比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；不同腫瘤體積、Enneking分期、遠處轉移患者比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 不同臨床特征骨肉瘤患者中β-catenin、LOXL2表達水平的比較

2.3 不同β-catenin、LOXL2表達水平的骨肉瘤患者總生存情況的比較根據骨肉瘤組織中β-catenin、LOXL2的表達水平不同將患者分為高表達組(≥中位數，n=41)、低表達組(<中位數，n=41)，其總生存率的Kaplan-Meier曲線見圖3。經Log-Rank檢驗，骨肉瘤患者中位生存期β-catenin、LOXL2高表達組明顯低于低表達組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

圖3 不同β-catenin、LOXL2表達水平的骨肉瘤患者總生存率的Kaplan-Meier曲線 A.β-catenin的表達；B.LOXL2的表達

表2 不同β-catenin、LOXL2表達水平的骨肉瘤患者中位生存期的比較

2.4 骨肉瘤細胞株SAOS2中LOXL2靶向調控β-catenin作用的驗證見圖4。骨肉瘤細胞株SAOS2中LOXL2、β-catenin的表達水平及細胞增殖的A490 nm水平、侵襲細胞的數目si-LOXL2組均明顯低(少)于si-NC組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖4 兩組骨肉瘤細胞株SAOS2中LOXL2、β-catenin表達水平及增殖、侵襲的比較 與si-NC組比較：*P<0.05 A.LOXL2、β-catenin的電泳圖;B.LOXL2的表達水平；C.β-catenin的表達水平；D.侵襲細胞的結晶紫染色結果(×400)；E.A490 nm的水平；F.侵襲細胞數目的結果

3 討論

臨床治療骨肉瘤的主要方式是手術切除聯(lián)合術后輔助化療，但患者的整體預后情況并不理想，文獻[1-2,7-8]顯示骨肉瘤的5年生存率為20%～40%。而且骨肉瘤容易發(fā)生早期遠處轉移，與之相關的生物學行為包括腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等。近些年，越來越多的基礎研究[9-12]發(fā)現(xiàn)了多種不同的骨肉瘤細胞惡性生物學行為調控分子，這些調控分子與骨肉瘤的預后密切相關。

3.1 β-catenin與LOXL2在骨肉瘤組織中表達的臨床意義及生物學意義經典Wnt通路是在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用的信號通路，上游Wnt分子與細胞膜受體Frizzled結合后抑制axin/GSK-3β/APC復合體對β-catenin的降解作用，進而引起β-catenin表達增多并進入細胞核，促進多種增殖、遷移相關基因的表達并改變細胞的生物學行為[13-15]。研究[3-5]顯示，Wnt通路抑制劑對骨肉瘤細胞的增殖、遷移均具有抑制作用且β-catenin在骨肉瘤組織中呈高表達趨勢。本研究也觀察到β-catenin的表達水平骨肉瘤組織明顯高于骨軟骨瘤組織，提示β-catenin可能參與了骨肉瘤的發(fā)生。進一步分析可知，隨著腫瘤體積增大、Enneking分期增加、遠處轉移的發(fā)生，骨肉瘤組織中β-catenin的表達水平明顯增加，提示β-catenin的高表達促進了骨肉瘤的病理進展。雖然目前β-catenin在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用明確，但調控β-catenin的上游機制尚不明確。LOXL2在食管癌、結直腸癌、肝癌等多種惡性腫瘤組織中表達增加[16-18]，且馮珊珊 等[6]研究證實卵巢癌中LOXL2是β-catenin的上游調控分子。本研究結果顯示，LOXL2的表達水平骨肉瘤組織明顯高于骨軟骨瘤組織，且骨肉瘤組織中LOXL2與β-catenin的表達呈正相關，提示LOXL2與β-catenin可能在骨肉瘤的發(fā)病過程中存在調控的關系。進一步分析可知，隨著腫瘤體積增大、Enneking分期增加、遠處轉移的發(fā)生，骨肉瘤組織中LOXL2的表達水平明顯增加。在此基礎上通過細胞實驗進行驗證，在轉染siRNA敲低骨肉瘤組織中LOXL2的表達后，組織中β-catenin的表達水平降低，同時細胞增殖及侵襲均受到抑制，提示LOXL2在骨肉瘤組織中對β-catenin具有調控作用，也對骨肉瘤細胞的增殖和侵襲具有調控作用。

3.2 骨肉瘤組織中β-catenin、LOXL2表達與遠期預后的關系骨肉瘤病理特征的惡化及腫瘤細胞異常的增殖和侵襲是遠期生存期縮短的重要影響因素。研究[19]顯示,腫瘤體積、遠處轉移是骨肉瘤患者預后的影響因素。另有一項研究[3]表明，β-catenin的高表達是骨肉瘤預后的影響因素。另外，學者們[20-22]發(fā)現(xiàn)，腎癌、食管癌、乳腺癌中β-catenin是預后的影響因素。但目前國內缺少β-catenin與骨肉瘤預后關系的臨床證據。本研究采用Kaplan-Meier曲線分析了不同β-catenin、LOXL2表達水平與骨肉瘤患者總生存率的關系，結果發(fā)現(xiàn)β-catenin、LOXL2的高表達會造成總生存率降低，說明β-catenin、LOXL2在骨肉瘤的預后中發(fā)揮作用。

綜上所述，骨肉瘤組織中β-catenin、LOXL2表達增加，與病理進展、預后不良有關；LOXL2在骨肉瘤組織中可能靶向調控β-catenin。