紅小豆上胞囊線蟲(chóng)的發(fā)育動(dòng)態(tài)研究

李靜，陳井生，郭永霞，3，周園園，3，曹尚

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心；3.黑龍江省作物有害生物互作生物學(xué)及生態(tài)防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.重慶三峽學(xué)院）

大豆胞囊線蟲(chóng)（Soybean cyst nematode，SCN）病，是危害世界大豆生產(chǎn)的最主要病害之一。研究發(fā)現(xiàn)，大豆胞囊線蟲(chóng)的二齡幼蟲(chóng)侵入植物的根系后，會(huì)引起根系組織的機(jī)械損傷和代謝紊亂，感病的大豆會(huì)表現(xiàn)出根系短粗，植株矮化、萎黃和不易結(jié)實(shí)等癥狀[1]。大豆胞囊線蟲(chóng)是一種典型的定居性?xún)?nèi)寄生線蟲(chóng)，對(duì)大豆等重要油料作物危害嚴(yán)重。由于線蟲(chóng)分布廣泛，生存能力強(qiáng)，危害性大等特點(diǎn)，防治相對(duì)困難。大豆胞囊線蟲(chóng)除了對(duì)大豆造成危害外，還可以在其它500多個(gè)作物種類(lèi)上寄生。主要為害的作物是豆科，如：菜豆、兵豆、箭舌豌豆、香豌豆、豌豆等[2]。

紅小豆（Vigna angularis），學(xué)名赤豆，因種皮呈紅色，又名赤小豆、朱豆，是豆科一年生、直立或纏繞草本植物。我國(guó)的紅小豆種植面積和總產(chǎn)量均居世界首位[3]。紅小豆?fàn)I養(yǎng)豐富，富含淀粉、蛋白質(zhì)、鐵、鈣、磷、鉀等礦物質(zhì)元素，脂肪含量低。同時(shí)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，紅小豆對(duì)人體有顯著的抗氧化、護(hù)肝護(hù)腎、抗癌、降血壓降膽固醇、抗菌抗病毒等多種作用。由于紅小豆是醫(yī)食同源作物，且紅小豆的價(jià)格比主要糧食作物高、投入少，對(duì)農(nóng)民來(lái)說(shuō)，紅小豆是重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是欠發(fā)達(dá)地區(qū)脫貧攻堅(jiān)的主要收入來(lái)源。因此，保證紅小豆的產(chǎn)量對(duì)于農(nóng)民來(lái)說(shuō)是非常重要的。近些年，關(guān)于紅小豆的研究開(kāi)始逐漸增多[4]。然而，紅小豆上的病害逐年增加，每年因病害引起的減產(chǎn)問(wèn)題十分嚴(yán)重。紅小豆上的大豆胞囊線蟲(chóng)病也嚴(yán)重影響了小豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。然而，農(nóng)民對(duì)該病缺乏了解，導(dǎo)致未能及時(shí)有效地預(yù)防該病，造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失?，F(xiàn)階段，關(guān)于大豆胞囊線蟲(chóng)對(duì)紅小豆的致病性不明確，在紅小豆根內(nèi)的發(fā)育狀況尚無(wú)報(bào)道，大豆和紅小豆胞囊線蟲(chóng)的侵染差異也尚不清楚。

大豆胞囊線蟲(chóng)（Heterodera glycines Ichinohe）是一種土傳內(nèi)寄生線蟲(chóng)[5]，是危害全球大豆生產(chǎn)的主要病害之一，由俄羅斯植物病理學(xué)家Jaczevski 在中國(guó)東北地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)[6]。大豆胞囊線蟲(chóng)由卵孵化，一齡幼蟲(chóng)（J1）在卵內(nèi)發(fā)育，二齡幼蟲(chóng)（J2）在15~30 ℃開(kāi)始發(fā)育[7]，幼蟲(chóng)侵染大豆根并在根內(nèi)寄生生活[8]，定殖后蟲(chóng)體開(kāi)始膨大，經(jīng)過(guò)蛻皮，三齡、四齡幼蟲(chóng)出現(xiàn)。雌蟲(chóng)與雄蟲(chóng)交配最后一次蛻皮后，蟲(chóng)體發(fā)育為成蟲(chóng)，完成一個(gè)世代的發(fā)育循環(huán)[9]。該病害可使通常會(huì)使中國(guó)東北大豆產(chǎn)量減少5%~100%[10]。隨著大豆種植面積的逐年增加，大豆胞囊線蟲(chóng)病每年給全球造成的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)16.2 億美元[11]。大豆胞囊線蟲(chóng)的世代受溫度和季節(jié)的影響，如果溫度條件適宜，它完成一個(gè)世代大約需要25~30 d 的時(shí)間。由于溫度的影響，在北方地區(qū)，如東北，大豆胞囊線蟲(chóng)一年可發(fā)生3~4 代，第一代歷時(shí)55 d[12]，在南方一年可發(fā)生4~5 代。但是，在不同植物中，其發(fā)育周期略有不同。

研究以大豆和紅小豆為試驗(yàn)材料，在根部接種二齡幼蟲(chóng)。取樣后，用次氯酸鈉-酸性品紅染色法對(duì)根組織中的線蟲(chóng)進(jìn)行染色，并在體視顯微鏡下對(duì)各齡期的根部線蟲(chóng)數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)數(shù)，明確大豆胞囊線蟲(chóng)對(duì)于紅小豆的侵染情況，大豆胞囊線蟲(chóng)在大豆和紅小豆根部的發(fā)育動(dòng)態(tài)揭示了大豆胞囊線蟲(chóng)在紅小豆根部的發(fā)育過(guò)程和完成一個(gè)生活史所需的大致時(shí)間，為大豆胞囊線蟲(chóng)在紅小豆上的有效防治提供了科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試品種

試驗(yàn)所用的大豆品種為合豐50，由黑龍江省農(nóng)科院大慶分院提供；

試驗(yàn)所用的紅小豆種質(zhì)資源為北7，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)作物育種研究室提供。

1.1.2 供試線蟲(chóng)

試驗(yàn)所用到的胞囊為黑龍江省農(nóng)科院大慶分院胞囊線蟲(chóng)發(fā)病土壤分離獲得。胞囊置于自制孵化池中孵化。

大豆胞囊線蟲(chóng)胞囊和J2 的獲得如下：

土壤樣品采集自黑龍江省農(nóng)科院大慶分院實(shí)驗(yàn)基地，采用改良淘洗-過(guò)篩法[13]進(jìn)行胞囊分離。具體方法是：用2 000 mL 燒杯取適量的大豆根際病土，置于淘洗桶中。加入適量水?dāng)嚢杈鶆?。靜置10~20 s 后，依次通過(guò)堆疊的20 目、40 目、60 目、80 目金屬篩，用強(qiáng)水流將金屬篩上的雜物從20 目洗至40 目。再將80 目篩上的殘留物反復(fù)沖洗至水流清為止。于體式顯微鏡下挑取飽滿的胞囊。挑好的胞囊用0.5%NaClO 溶液消毒3~4 min，無(wú)菌水沖洗3 次。干燥后，將胞囊儲(chǔ)存于4 ℃的冰箱中，備用。

大豆胞囊線蟲(chóng)懸液的制備：將胞囊放入自制的滅菌孵化池，將孵化池置于滅菌的培養(yǎng)皿中，向培養(yǎng)皿中加入適量無(wú)菌水，于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵化，期間更換無(wú)菌水，及時(shí)收集孵化出的二齡幼蟲(chóng)（J2），置于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆胞囊線蟲(chóng)感染紅小豆田間驗(yàn)證

試驗(yàn)選紅小豆種質(zhì)資源為北7，播種于黑龍江省農(nóng)科院大慶分院實(shí)驗(yàn)基地田間自然發(fā)病圃，于胞囊顯嚢期，將植株連根挖出，保持根系完整，調(diào)查根上胞囊數(shù)量。

1.2.2 大豆胞囊線蟲(chóng)接種

采用盆栽試驗(yàn)，用0.5% NaClO 對(duì)供試大豆和小豆種子進(jìn)行表面滅菌3 min，并用無(wú)菌水沖洗。將供試大豆種子和紅小豆種子用濕潤(rùn)的醫(yī)用紗布包裹，置于培養(yǎng)皿中，30 ℃條件下催芽，期間及時(shí)換水。待種子芽長(zhǎng)2~3 cm 左右時(shí)，將種子播種于裝有經(jīng)過(guò)高溫滅菌砂土（體積比1∶2）的黑色塑料缽中。待植株長(zhǎng)至兩葉期，分別在幼苗根部接種J2 懸浮液約（600 條·mL-1）1 mL。接種后每3 d 取一次樣，每次取5 株，進(jìn)行根組織染色并計(jì)數(shù)。

1.2.3 植物根組織中線蟲(chóng)的染色并計(jì)數(shù)

參照劉維志[14]方法，采用NaClO-酸性品紅對(duì)侵入根組織內(nèi)的線蟲(chóng)進(jìn)行染色，將洗凈的植株根系置于1.5%NaClO 溶液中浸泡5 min 后，用清水沖洗30 s以便去除根系表面殘留的NaClO，于蒸餾水中浸泡15 min。將根系轉(zhuǎn)入盛有酸性品紅的100 mL 的燒杯中，煮沸1~5 min，冷卻后用自來(lái)水沖洗根系表面的殘留的品紅，然后轉(zhuǎn)移到盛有100 mL 酸性甘油（甘油中加幾滴5 mol·L-1HCl）的燒杯中加熱褪色1~5 min，于體視解剖鏡下鏡檢大豆和紅小豆根內(nèi)線蟲(chóng)的數(shù)量及發(fā)育動(dòng)態(tài)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

分別計(jì)算每顆大豆根組織和紅小豆根組織中的各蟲(chóng)態(tài)數(shù)量，即群體密度；統(tǒng)計(jì)各取樣時(shí)期各蟲(chóng)態(tài)的平均群體密度，并利用origin 2018 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果分析

2.1 紅小豆外部癥狀

大豆胞囊線蟲(chóng)侵染紅小豆后紅小豆的整株癥狀和地下部癥狀見(jiàn)圖1，可以看到大豆胞囊線蟲(chóng)侵染紅小豆后，紅小豆地上部葉片缺綠，植株矮小，根系發(fā)育不良，主根長(zhǎng)勢(shì)弱，根部著生大量白色胞囊。

圖1 大豆胞囊線蟲(chóng)危害紅小豆植株的癥狀Fig.1 Symptoms of soybean cyst nematode endangering adzuki bean plants

2.2 紅小豆根組織染色觀察結(jié)果

圖2 是紅小豆根內(nèi)不同齡期線蟲(chóng)，圖A 為接種后5 d 時(shí)紅小豆根內(nèi)的二齡幼蟲(chóng)（J2），蟲(chóng)體細(xì)長(zhǎng)線條狀，寄生在紅小豆根內(nèi)維管束中；圖B 為接種后10 d時(shí)紅小豆根內(nèi)的三齡幼蟲(chóng)（J3），蟲(chóng)體逐漸膨脹呈臘腸狀；圖C 為接種后20 d 時(shí)紅小豆根內(nèi)的四齡幼蟲(chóng)（J4），蟲(chóng)體繼續(xù)膨大，呈豆莢狀；圖D 和E 接種后28 d 時(shí)紅小豆根內(nèi)的雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)，雌雄蟲(chóng)形態(tài)不同，雌蟲(chóng)呈檸檬形或近圓形，雄蟲(chóng)呈細(xì)長(zhǎng)蠕蟲(chóng)狀，彎曲盤(pán)繞在紅小豆根組織內(nèi)。

圖2 不同齡期線蟲(chóng)在紅小豆根內(nèi)發(fā)育情況Fig.2 The development of nematodes at different ages in the roots of Adzuki bean

2.3 大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲(chóng)的群體動(dòng)態(tài)

大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲(chóng)J2、J3、J4的群體密度變化見(jiàn)圖3。由圖3（a）可知，在3 d 時(shí)，在大豆和紅小豆根組織中均已出現(xiàn)二齡幼蟲(chóng)，根內(nèi)侵染的線蟲(chóng)數(shù)量分別為25.8 條·株-1和20.0 條·株-1。在大豆的根組織內(nèi)，J2 群體密度在第9 天時(shí)出現(xiàn)高峰，為55.4 條·株-1，此后J2 數(shù)量開(kāi)始減少，18 d 時(shí)最少。而在紅小豆根組織中，J2 群體密度在第12 天時(shí)最大，為87.6 條·株-1，此后數(shù)量逐漸減少，18 d 時(shí)數(shù)量最少。

由圖3（b）可知，J3 在大豆和紅小豆根組織中都最早出現(xiàn)在第6 天，侵染數(shù)量分別為0.2 條·株-1和1.4 條·株-1。在大豆根組織中，J3 群體密度在第12 天時(shí)達(dá)到高峰，侵染數(shù)量為60.4 條·株-1；此后J3 數(shù)量減少，持續(xù)到第27 天。在紅小豆根組織中，J3 群體密度在第18 天時(shí)出現(xiàn)高峰，數(shù)量為49.8 條·株-1，此后J3 數(shù)量減少，持續(xù)到第27 天。

由圖3（c）可知，大豆和紅小豆根組織中的J4 都出現(xiàn)在18 d，侵染數(shù)量分別為2.4 條·株-1和5.4 條·株-1。在大豆的根組織中，J4 群體密度在第24 天時(shí)出現(xiàn)高峰，為35 條·株-1；此后J4 數(shù)量開(kāi)始減少，至30 d 為8.2 條·株-1。在紅小豆根組織內(nèi)，J4 群體密度在第24 天出現(xiàn)高峰，為32 條·株-1；此后數(shù)量開(kāi)始減少，至30 d為2.4 條·株-1。

圖3 大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲(chóng)的群體動(dòng)態(tài)Fig.3 Population dynamics of soybean cell cystic worms in soybean and Adzuki bean root tissue

2.4 大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲(chóng)的發(fā)育動(dòng)態(tài)

大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲(chóng)J2、J3、J4的發(fā)育動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖4。大豆和紅小豆根內(nèi)線蟲(chóng)在接種3 d 后開(kāi)始侵入，均為J2 幼蟲(chóng)。接種6 d 后，大豆和紅小豆根內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)J3，但仍以J2 幼蟲(chóng)為主。接種9 d 后，大豆根內(nèi)J2 的數(shù)量達(dá)到了峰值，為55.4 條·株-1。接種12 d 后，紅小豆根內(nèi)J2 幼蟲(chóng)最多，為87.6 條·株-1，大豆根內(nèi)的J2 幼蟲(chóng)開(kāi)始減少，J3 幼蟲(chóng)數(shù)量增加并且達(dá)到高峰，數(shù)量為60.4 條·株-1。

從圖4 可以看到，9 d 后大豆根內(nèi)和紅小豆根內(nèi)J2 的數(shù)量開(kāi)始減少，并且都是在接種后第6 d 檢測(cè)到J3，18 d 檢測(cè)到J4，說(shuō)明從J3 發(fā)育到J4 約9 d。但是在大豆根組織內(nèi)J3 在第12 d 達(dá)到發(fā)育高峰，J4 在24 d 時(shí)達(dá)到高峰，在大豆根組織中J3 發(fā)育高峰到J4 發(fā)育高峰歷經(jīng)12 d；在紅小豆根內(nèi)J3 在第18 d時(shí)達(dá)到高峰；J4 的發(fā)育高峰在24 d，在紅小豆根組織中J3 發(fā)育高峰到J4 發(fā)育高峰歷經(jīng)6 d?？梢钥闯黾t小豆根組織中J3 到J4 的發(fā)育時(shí)間較短，大豆根內(nèi)大豆胞囊線蟲(chóng)的發(fā)育進(jìn)程要長(zhǎng)于紅小豆根內(nèi)的大豆胞囊線蟲(chóng)。

圖4 大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲(chóng)的發(fā)育動(dòng)態(tài)Fig.4 The developmental dynamics of soybean cell cystic worms in soybean and Adzuki bean root tissue

2.5 大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲(chóng)發(fā)育時(shí)間的確定

由圖3（d）可知，大豆在接種后21，24，27，30 d檢測(cè)到成熟雌蟲(chóng)，且在30 d 是部分大豆根組織內(nèi)還有未發(fā)育完成的雌蟲(chóng)。紅小豆在接種后21，24，27 d檢測(cè)到成熟雌蟲(chóng)，在第30 天時(shí)部分紅小豆根組織內(nèi)已無(wú)成熟雌蟲(chóng)。說(shuō)明在研究中，在大豆根組織內(nèi)，大豆胞囊線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)發(fā)育為成熟雌蟲(chóng)大約需要21~30 d 以上的時(shí)間，而在紅小豆根組織內(nèi)，大豆胞囊線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)發(fā)育為成熟雌蟲(chóng)大約需要21~27 d 的時(shí)間。但這只代表部分發(fā)育較快線蟲(chóng)完成其生活史所需要的時(shí)間，不能代表線蟲(chóng)的一個(gè)發(fā)生世代。

3 討論

大豆胞囊線蟲(chóng)病是危害大豆產(chǎn)量的一個(gè)重要因素，大豆胞囊線蟲(chóng)侵染大豆根系引起病害，導(dǎo)致大豆植株矮化發(fā)黃，影響產(chǎn)量[15]。研究表明，大豆胞囊線蟲(chóng)寄主范圍廣，能侵染大部分豆科植物以及一些豆區(qū)不常見(jiàn)植物[11]，研究通過(guò)對(duì)大豆和紅小豆上大豆胞囊線蟲(chóng)侵染情況進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲(chóng)的群體動(dòng)態(tài)不同，紅小豆上J2的群體密度高峰大于大豆上的J2 的群體密度，且在紅小豆根系中大豆胞囊線蟲(chóng)各蟲(chóng)態(tài)發(fā)生量均明顯較高，因此，在條件適宜的情況下，大豆胞囊線蟲(chóng)在紅小豆上的發(fā)病程度不次于大豆。紅小豆種植面積不斷加大，線蟲(chóng)病害發(fā)生日趨嚴(yán)重，但該病害發(fā)生于植株根部，常常被人們忽視，因此，對(duì)該病害的有效防治也越來(lái)越重要。

在中國(guó)，大豆胞囊線蟲(chóng)在大豆上1 年發(fā)生3~4或6 代。在美國(guó)明尼蘇達(dá)州南部大豆上大豆胞囊線蟲(chóng)能夠完成3~4 代[16]。在研究中，從大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲(chóng)J2、J3、J4 的發(fā)育動(dòng)態(tài)變化可以看到，J2、J3 在紅小豆中的出現(xiàn)高峰都比大豆要晚，而J4 出現(xiàn)的高峰要早?？芍t小豆中J3 到J4 的發(fā)育時(shí)間較短。究其原因，大豆胞囊線蟲(chóng)對(duì)不同寄主的適合性和致病性存在差異[17]，研究中，大豆胞囊線蟲(chóng)對(duì)紅小豆侵染這方面的探討未見(jiàn)報(bào)道，大豆胞囊線蟲(chóng)對(duì)大豆和紅小豆的侵染存在一定的差異，適宜條件下，紅小豆內(nèi)的大豆胞囊線蟲(chóng)發(fā)育更快，更快的出現(xiàn)雌蟲(chóng)，并進(jìn)入下一個(gè)侵染循環(huán)。

在22~23 ℃下，SCN 完成1 個(gè)世代需要21~27 d[18]，Niblack 等[19]指出，理論上大豆胞囊線蟲(chóng)在1 個(gè)大豆生長(zhǎng)季可以完成6 代，具體代數(shù)主要取決于寄主適合性、播種時(shí)間、雜草寄主狀況和土壤溫度等條件。試驗(yàn)對(duì)大豆和紅小豆根組織中線蟲(chóng)染色，鏡檢各齡期線蟲(chóng)數(shù)量發(fā)現(xiàn)，大豆內(nèi)的大豆胞囊線蟲(chóng)完成第一個(gè)生活史大概需要21~30 d。這與已報(bào)道的大豆胞囊線蟲(chóng)完成一個(gè)世代為21~27 d 的結(jié)論一致[20]。研究表明，在接種J2 后21、24、27 d，在紅小豆中檢測(cè)到成熟雌蟲(chóng)，而在紅小豆根組織內(nèi)，大豆胞囊線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)發(fā)育為成熟雌蟲(chóng)大約需要21~27 d 的時(shí)間。因此，適宜條件下，紅小豆內(nèi)的部分發(fā)育較快的大豆胞囊。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于大豆上大豆胞囊線蟲(chóng)的侵染、發(fā)育動(dòng)態(tài)、發(fā)生世代的報(bào)道有很多，人們知道大豆胞囊線蟲(chóng)是如何侵染大豆、線蟲(chóng)的發(fā)生世代以及對(duì)于大豆上大豆胞囊線蟲(chóng)的防治方法[21]。但是對(duì)于紅小豆上的大豆胞囊線蟲(chóng)的侵染、發(fā)育動(dòng)態(tài)的研究未見(jiàn)報(bào)道。研究明確了大豆胞囊線蟲(chóng)對(duì)于紅小豆的侵染情況，并根據(jù)大豆胞囊線蟲(chóng)在大豆和紅小豆根內(nèi)的發(fā)育動(dòng)態(tài)，明確了紅小豆根內(nèi)線蟲(chóng)的發(fā)育進(jìn)程，為有效防治紅小豆上的大豆胞囊線蟲(chóng)病提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

紅小豆上的大豆胞囊線蟲(chóng)的研究國(guó)內(nèi)一直未見(jiàn)報(bào)道，說(shuō)明農(nóng)民對(duì)于紅小豆上大豆胞囊線蟲(chóng)的危害并不清楚，研究證明了大豆胞囊線蟲(chóng)會(huì)造成紅小豆地上部葉片缺綠，植株矮小，根系發(fā)育不良，主根長(zhǎng)勢(shì)弱。因此，對(duì)于紅小豆上大豆胞囊線蟲(chóng)病的防治不可忽視。藥劑防治大豆胞囊線蟲(chóng)時(shí)，要結(jié)合線蟲(chóng)各齡期的發(fā)育情況。掌握好使用藥劑的時(shí)間，才能達(dá)到理想的防治效果[20]。控制大豆胞囊線蟲(chóng)蟲(chóng)口密度的關(guān)鍵時(shí)期是在線蟲(chóng)侵染第一個(gè)高峰期出現(xiàn)時(shí)[22]，根據(jù)研究數(shù)據(jù)表明，線蟲(chóng)侵染紅小豆的第12 d 是J2 數(shù)量的高峰，由于試驗(yàn)接種的是已經(jīng)孵化出的二齡幼蟲(chóng)。因此，田間防治紅小豆上的大豆胞囊線蟲(chóng)病時(shí)，應(yīng)在紅小豆出苗后及時(shí)調(diào)查，加強(qiáng)防治，以保證防治達(dá)到理想效果。