糞菌移植對(duì)腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠腦-腸軸中5-HT信號(hào)通路的影響

歐陽勇文，李兆滔，呂 晉，趙光華，王藝霖，崔西玉△

佛山市第一人民醫(yī)院：1.消化內(nèi)科；2.病理科；3.檢驗(yàn)科，廣東佛山 528000

腸易激綜合征(IBS)是一種間歇性或持續(xù)性發(fā)作、以腹痛、便秘、腹瀉為主要特征的腸功能紊亂性疾病[1-2]。根據(jù)IBS的癥狀表現(xiàn)，可分為便秘型、腹瀉型(IBS-D)、不定型及混合型，其中IBS-D發(fā)病率最高[3-4]。由于其頻繁、持續(xù)的發(fā)作，給患者帶來嚴(yán)重的心理障礙、精神異常及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前研究認(rèn)為，IBS-D致病原因主要包括腸道菌落失衡、飲食不規(guī)律、內(nèi)臟高敏感性、感染及腦-腸互動(dòng)異常等多種因素，其中腸道菌群失衡是IBS-D發(fā)生的關(guān)鍵因素之一[5-7]。有研究顯示，IBS-D患者與健康人群的糞便菌群存在明顯的差異，且菌群分布及功能呈現(xiàn)紊亂狀態(tài)。因此，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡成為治療IBS-D的重要研究方向[8]。糞菌移植(FMT)是指將健康供體的糞便菌液通過一定的方式處理后，移植到患者的胃腸道中，通過調(diào)節(jié)其患者腸道內(nèi)腸道菌落，重建正常微生態(tài)平衡，從而達(dá)到治療作用[9-10]。目前已有研究證實(shí)，糞菌移植在改善IBS-D患者癥狀中具有明顯的治療效果[11]，但其作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過構(gòu)建IBS-D模型大鼠，圍繞腦-腸軸5-HT信號(hào)通路，探討糞菌移植的作用機(jī)制，為臨床糞便移植的推廣使用及新藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠45只，體重(130±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)[SCXK(京)2018-0002]，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在溫度(23±3)℃，光暗12 h/12 h條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)。

1.2試劑 SERT抗體(美國(guó)CST公司，批號(hào)：7473218)、TPH1抗體(美國(guó)CST公司，批號(hào)：6802487)、5-HT3R抗體(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab13897)、5-HT4R抗體(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab60359)，5-HT和SP酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海康朗生物科技有限公司，批號(hào)：607783、789981)；辣根酶標(biāo)記熒光二抗(福麥斯有限公司，批號(hào)：1125854)，3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑及電泳液等(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3糞菌液的制備 參考陳夢(mèng)等[12]制備方法，收集健康大鼠新鮮糞便，置于無菌管中，按照質(zhì)量/體積1∶5的比例加入生理鹽水，充分混合搖勻后，在濾網(wǎng)中過濾，除去大顆粒物質(zhì)，將濾液3 000 r/min離心10 min，棄上清，再次加入生理鹽水，重復(fù)上述步驟3次，收集沉淀物，加入生理鹽水重懸，即獲得糞菌液。

1.4動(dòng)物分組及模型的制備 將SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成3組，正常組、模型組及糞菌移植組，每組15只。除正常組外，其他組均進(jìn)行造模。造模方法如下：采用番瀉葉(20 mg/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃，每天2次，同時(shí)在每次灌胃后1 h，將大鼠的胸部、前肢及肩部采用透明膠帶進(jìn)行束縛，使其不能行動(dòng)，誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)躁狂的狀態(tài)，從而對(duì)大鼠造成一定程度的應(yīng)激刺激，每次束縛2 h，造模時(shí)間為連續(xù)14 d。造模完成后，采用腹壁撤離反射(AWR)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)分達(dá)到3分即表示造模成功。造模完成后，對(duì)糞菌移植組大鼠采用預(yù)先制備好的糞菌液灌腸處理，每次灌腸體積2 mL，對(duì)照組和模型組均采用同樣的灌腸方法給予灌腸生理鹽水，連續(xù)灌腸治療10 d。

1.5標(biāo)本采集 于大鼠末次糞菌移植治療后，禁食12 h，乙醚麻醉，股動(dòng)脈取血，頸椎脫臼法處死，待血液靜置30 min后，3 000 r/min離心5 min，分離血清，分裝后置于-80 ℃冰箱中備用。同時(shí)迅速取出大鼠腦組織和距離肛門3～5 cm 處的新鮮結(jié)腸組織(長(zhǎng)度1～2 cm)，生理鹽水沖洗干凈后，一部分置于10%甲醛溶液中固定，其他部分置于-80 ℃冰箱中備用。

1.6觀察指標(biāo)

1.6.1基本情況 觀察SD大鼠在治療期間糞便顏色、氣味、性狀、腹瀉程度、精神狀態(tài)及進(jìn)食狀況等。

1.6.2糞便含水量 采集同時(shí)間段各組大鼠的糞便，稱質(zhì)量后記作濕重，干燥后再稱質(zhì)量記為干重，計(jì)算治療前后各組大鼠糞便含水量的變化。糞便含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6.3大鼠腦組織及血清5-HT和SP表達(dá)水平 取部分大鼠腦組織，按照一定比例加入生理鹽水，在冰上研磨，制成勻漿，3 000 r/min離心3 min，收集上清備用。從冰箱中取出大鼠血清，復(fù)溫，采用ELISA檢測(cè)大鼠腦組織及血清5-HT和SP表達(dá)水平，檢測(cè)步驟嚴(yán)格依據(jù)ELISA試劑盒說明書開展。

1.6.4大鼠結(jié)腸組織及腦組織SERT蛋白表達(dá)水平 采用免疫組化法檢測(cè)大鼠結(jié)腸及腦組織SERT蛋白表達(dá)水平。取出于甲醛溶液中固定好的大鼠結(jié)腸組織和腦組織，將其制作成蠟塊，切片，將切片置于二甲苯溶液中脫蠟，在不同濃度梯度的乙醇溶液中水化，取出切片后，置于檸檬酸緩沖液中10 min進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加H2O2溶液封閉，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗 3次，每次1 min，加入抗體(1∶100)，于4 ℃搖床條件下孵育過夜，PBS清洗清洗 3次，每次1 min，滴加二抗，37 ℃孵育2 h，PBS清洗 3次，每次1 min，加入DAB染色，將切片置于梯度濃度的二甲苯和乙醇溶液中脫水，干燥后封片，置于高倍顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取3個(gè)視野，觀察蛋白表達(dá)情況。

1.6.5大鼠結(jié)腸組織和腦組織SERT、THP1、5-HT3R、5-HT4R蛋白表達(dá)水平 采用Western blot法檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織和腦組織SERT、THP1、5-HT3R、5-HT4R蛋白表達(dá)水平。選取各組大鼠結(jié)腸組織并進(jìn)行稱量，按照比例加入裂解液提取組織蛋白，BCA法測(cè)定裂解液中蛋白濃度，依據(jù)測(cè)定的蛋白濃度按照比例加入上樣緩沖液，置于沸水中煮沸10 min使蛋白變性，獲取本后置于-20 ℃冰箱中備用。配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠，組織樣本上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜。然后，取出PVDF膜，置于37 ℃搖床中用脫脂奶粉封閉2 h，取出PVDF膜，TPBS沖洗3次，每次5 min，PBS清洗1次，每次3 min，滴加一抗(1∶100)，4 ℃搖床中孵育過夜，TPBS沖洗3次，每次5 min，PBS沖洗1次，每次3 min，置于37 ℃搖床中孵育二抗(1∶50 000)2 h，沖洗，配置顯影液后均勻涂抹于PVDF膜上，掃描目的蛋白，采用Image-Pro Plus軟件分析蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1大鼠基本情況 治療期間，所有大鼠均未發(fā)生死亡事件。正常組大鼠飲食、排便狀況、機(jī)體活動(dòng)，以及生長(zhǎng)狀況均表現(xiàn)正常；模型組大鼠在造模后，出現(xiàn)稀便樣腹瀉、精神狀況萎靡、飲水量增加、進(jìn)食量減少，以及煩躁不安等癥狀；糞菌移植組大鼠在治療后，精神狀況明顯改善，腹瀉狀況明顯好轉(zhuǎn)。

2.23組大鼠糞便含水量比較 模型組大鼠糞便含水量明顯高于正常組，糞菌移植組大鼠糞便含水量明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

2.33組大鼠腦組織及血清5-HT和SP表達(dá)水平比較 與正常組相比，模型組大鼠腦組織和血清5-HT和SP表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，糞菌移植組大鼠腦組織和血清5-HT和SP表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 3組大鼠腦組織及血清5-HT和SP表達(dá)水平比較

2.43組大鼠結(jié)腸組織及腦組織SERT蛋白表達(dá)水平比較 與正常相比，模型組大鼠結(jié)腸組織及腦組織SERT蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，糞菌移植組大鼠在糞菌移植治療后結(jié)腸組織及腦組織SERT蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

注：免疫組化結(jié)果(×200)。

2.53組大鼠結(jié)腸組織和腦組織SERT、THP1、5-HT3R、5-HT4R蛋白表達(dá)水平比較 與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織和腦組織SERT、5-HT4R蛋白表達(dá)水平明顯降低，THP1和5-HT3R蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，糞菌移植組能SERT、5-HT4R蛋白表達(dá)水平明顯升高，THP1和5-HT3R蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3、4。

注：A為Western blot檢測(cè)結(jié)果；B～E為相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；與正常組比較，aP<0.01；與糞菌移植組比較，bP<0.01。

注：A為Western blot檢測(cè)結(jié)果；B～E為相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；與正常組比較，aP<0.01；與糞菌移植組比較，bP<0.01。

3 討 論

IBS-D是一種常見的以腹瀉、腹痛等癥狀的消化系統(tǒng)疾病。目前，臨床上對(duì)IBS-D患者的治療方案主要為5-HT受體拮抗劑、選擇性5-HT再攝取抑制劑、解痙劑及止瀉藥等藥物治療，雖然有一定療效，但是停藥后容易復(fù)發(fā)，其應(yīng)用有一定局限性[13-15]。近年來，F(xiàn)MT在調(diào)節(jié)胃腸道、改善IBS-D癥狀方面表現(xiàn)出明顯的療效，但其作用機(jī)制尚無統(tǒng)一的結(jié)論。因此，本研究旨在探討FMT對(duì)IBS-D的治療效果及作用機(jī)制，為臨床治療提供指導(dǎo)。本研究通過構(gòu)建IBS-D模型大鼠發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，F(xiàn)MT能夠明顯改善大鼠精神狀態(tài)、飲食及腹瀉等癥狀，提示FMT在IBS-D治療中有明顯的療效。

隨著消化系統(tǒng)及神經(jīng)病理學(xué)等基礎(chǔ)研究的發(fā)展，腦-腸軸學(xué)理論越來越受到廣泛關(guān)注。有研究指出，IBS-D的發(fā)病機(jī)制主要由中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道神經(jīng)系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)節(jié)內(nèi)臟敏感性和胃腸動(dòng)力，其中腦腸肽(如5-HT、SP)在起到中間樞紐的作用[16-17]。5-HT是廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸系統(tǒng)中一種常見的腦腸肽，具有多種生理功能，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，5-HT的分泌異常能夠影響情緒狀態(tài)，增加不安狀態(tài)，同時(shí)也是作為一種內(nèi)源性鎮(zhèn)痛物質(zhì)，降低疼痛的敏感性[18]；在胃腸系統(tǒng)中，5-HT參與胃腸道蠕動(dòng)、炎癥分泌等多種功能[19]。5-HT在機(jī)體中的合成及與受體間的結(jié)合異常會(huì)引起胃腸系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生相應(yīng)的改變[20]。其中，SERT和色氨酸羥化酶1(TPH1)在5-HT的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要作用。SERT是一種廣泛分布于胃腸道細(xì)胞膜和神經(jīng)系統(tǒng)中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，5-HT發(fā)揮作用后，會(huì)被SERT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)失活，進(jìn)而降低細(xì)胞外液中5-HT的濃度[21-22]；而TPH1是一種限速酶，在5-HT合成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，TPH1表達(dá)水平升高，會(huì)明顯升高腸道或中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT水平[23-24]。既往有研究指出，胃腸道及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中SERT低表達(dá)和TPH1的高表達(dá)會(huì)明顯升高胃腸道或中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT水平，從而導(dǎo)致胃腸功能異常及內(nèi)臟敏感性升高，表現(xiàn)出腹瀉、腹痛等不適癥狀，這可能是誘發(fā)IBS-D發(fā)病的原因[25]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)糞菌移植治療后，大鼠結(jié)腸組織中SERT蛋白表達(dá)水平明顯升高，而TPH1蛋白表達(dá)水平明顯降低，且血清5-HT水平明顯降低，提示糞菌移植可能是通過抑制TPH1并增強(qiáng)SERT的表達(dá)來影響5-HT的合成與攝取，進(jìn)而調(diào)節(jié)IBS-D腸道5-HT水平，發(fā)揮改善IBS-D大鼠胃腸動(dòng)力的作用。此外，進(jìn)一步研究大鼠腦組織相關(guān)5-HT信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)，THP1和SERT蛋白的表達(dá)趨勢(shì)與結(jié)腸組織一致。究其原因可能在于糞菌移植通過改善胃腸道功能，間接性調(diào)控腦組織5-HT信號(hào)通路中蛋白的表達(dá)，進(jìn)而改善內(nèi)臟敏感性及焦慮、抑郁等應(yīng)激狀態(tài)。

5-HT發(fā)揮生理作用是與其對(duì)應(yīng)的受體結(jié)合介導(dǎo)的，其中5-HT3R和5-HT4R與IBS-D關(guān)系最為密切。5-HT3R在傳遞腦-腸軸中胃腸動(dòng)力和內(nèi)臟敏感性方面發(fā)揮重要作用，5-HT與5-HT3R結(jié)合能夠升高內(nèi)臟敏感性，導(dǎo)致IBS-D等胃腸不適狀態(tài)[26]，而激活5-HT4R受體能夠促進(jìn)乙酰膽堿等物質(zhì)的釋放，從而影響胃腸蠕動(dòng)及舒張[27]。5-HT3R和5-HT4R表達(dá)水平的變化均能影響IBS-D胃腸功能及改變內(nèi)臟敏感性[28-29]。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠中腦組織及結(jié)腸組織5-HT3R表達(dá)水平明顯升高，5-HT4R表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，糞菌移植組5-HT3R表達(dá)明顯降低，5-HT4R的表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。這表明影響5-HT與其受體的結(jié)合也是糞菌移植發(fā)揮作用的重要機(jī)制。

綜上所述，5-HT在體內(nèi)的合成、重?cái)z取，以及與其受體結(jié)合受到影響均會(huì)導(dǎo)致5-HT信號(hào)通路傳遞異常，進(jìn)而誘發(fā)IBS-D的發(fā)生。糞菌移植能夠明顯改善的IBS-D的不適癥狀，其機(jī)制可能與調(diào)控腦-腸軸5-HT信號(hào)通路有關(guān)。