基于網(wǎng)絡藥理學探討牛黃治療阿爾茨海默病的作用機制

付新，鄧琦川，張佳寧，?；?/p>

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種嚴重損害老年人健康的慢性進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以漸進性記憶減退、顯著性語言功能障礙、加劇性認知功能缺陷以及人格行為改變等為主要特征，最終導致重度癡呆、智力全面下降等嚴重癥狀。目前普遍認為，阿爾茨海默病在神經(jīng)病理學上存在兩種經(jīng)權威證據(jù)證實的主要特征：β 淀粉樣蛋白（β amyloid，Aβ）沉積和攜帶APOE e4 等位基因［1］。調(diào)查阿爾茨海默病的患病情況可以發(fā)現(xiàn)，患有AD 的人數(shù)隨著世界人口老齡化程度的加劇而不斷增加。據(jù)《世界阿爾茨海默病報告2018》估計，到2050 年，全球患阿爾茨海默病的人數(shù)將增至1.52 億［2］。由于AD 改變了一系列分子細胞進程，其發(fā)病機制復雜，發(fā)病原因多樣，目前為止尚未找到合適的治療方案。盡管不斷開發(fā)新的治療藥物，但只能減緩癥狀，并不能有效地治愈AD，無法改變其病理進程［3］。因此，研發(fā)預防、緩解及治療AD 的藥物具有極為重要的臨床價值。

中醫(yī)藥具有“多活性成分－多靶點－多通路－多疾病”的治療特點，契合AD 發(fā)病機制的復雜性和病因的多樣性，以及其改變一系列分子細胞進程的特征，通過探討兩者潛在的協(xié)同效應，以此挖掘中醫(yī)藥同時靶向多種AD 相關靶點的優(yōu)勢［4］。牛黃是一種常用的中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為?？苿游锱５母稍锬懡Y(jié)石［5］，在許多中醫(yī)著作中，用于治療與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關的疾病，臨床應用已有兩千多年的歷史。基于大量藥理學及藥效學研究證實，牛黃對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有顯著作用，主要包括鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥、抗癲癇、抗腦損傷、保護腦血管、解熱鎮(zhèn)痛以及通過促進神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育和增殖分化以增強學習記憶能力的作用［6］。此外，相關藥理學研究表明，牛黃可與多味中藥配伍制成復方藥劑，用于醫(yī)治中樞神經(jīng)系統(tǒng)類疾病，如神經(jīng)重癥等［7］。近年來，研究者們不斷對牛黃的活性成分、作用靶點以及相關作用機制等進行研究探討，權威研究結(jié)果顯示，牛黃可能對AD 等一系列神經(jīng)性疾病有良好的預防與治療作用［8］。因此，牛黃有望成為預防及治療AD 的生物活性藥物，對其進行深入研究具有極大臨床價值。

1 材料與方法

1.1 化學成分的獲得、檢索及主要活性成分的篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學基礎研究數(shù)據(jù)庫和專業(yè)分析平臺（TCMSP），以中藥牛黃為檢索詞，得到牛黃的全部活性成分及化學成分作用靶點，根據(jù)TCMSP 初步篩選標準，設定口服利用度（oral bioavailability，OB）≥15%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為初步篩選參數(shù)，并結(jié)合已有的藥理學研究收集符合條件的有效成分。此外，通過中國知識資源總庫（CNKI，https：//kns. cnki.net/），主題檢索2015 年1 月1 日—2020 年12 月1 日文獻中牛黃的化學成分。通過生物醫(yī)學和健康科學信息檢索系統(tǒng)PubMed（https：//pubmed. ncbi. nlm.nih.gov/）以牛黃的化學成分為主要關鍵詞進行檢索，根據(jù)已發(fā)表的藥物相關成分的文獻報道，補充有效活性成分及其預測的相關靶點，并結(jié)合TCMSP 得到的相關靶點，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http：//www. uniprot. org）將靶蛋白轉(zhuǎn)換成為基因，并剔除非人源基因。

1.2 阿爾茨海默病的相關靶點篩選

應用GeneCards 數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫和DrugBank 數(shù)據(jù)庫進行檢索，同時為保證研究數(shù)據(jù)的科學性、準確性及全面性，以“Alzheimer's Disease”“Alzheimer disease”“Senile Dementia”“AD”等阿爾茨海默病相關名詞作為檢索詞，分別獲取AD 的核心作用靶點。利用Draw Venn Diagram 在線繪圖工具平臺將各個數(shù)據(jù)庫基因取并集，并繪制AD 疾病基因韋恩圖。

1.3 牛黃有效成分－AD疾病靶點的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡（protein－protein interaction，PPI）是指從蛋白質(zhì)分子層面深入挖掘化合物和疾病兩者之間的相關性，再從基礎生物化學，相關信號轉(zhuǎn)導和分子遺傳網(wǎng)絡等角度構(gòu)建網(wǎng)絡以研究相關性。為更加明確闡述其靶蛋白在分子系統(tǒng)水平上的主要作用，將上述獲得的主要靶點于STRING 11. 0 數(shù)據(jù)庫在線上傳，物種篩選為“智人”，同時設置靶點關聯(lián)的置信度為0. 40，以獲得PPI關系網(wǎng)絡。

1.4 生物信息學注釋

將牛黃核心靶點進行KEGG 主要通路分析。使用生物化學在線基因信息學功能注釋專業(yè)分析工具Metascape（http：//metascape. org/），以P< 0.05 為初步篩選條件，對關鍵靶點進行平臺在線KEGG 通路富集分析，并對得到的氣泡圖和柱狀圖進行分析。

1.5 分子對接驗證

在PDB 數(shù)據(jù)庫中下載靶蛋白的相應3D 結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)受體與主要配體的獲取方法如下：

醛糖還原酶的三維晶體結(jié)構(gòu)來源于Protein Database（PDB 代號為1US0）。中藥牛黃的主要活性成分（共計3 種小分子化合物）的SDF 文件全部來源于PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），通 過將從成分－靶點－疾病的網(wǎng)絡藥理學圖中找出的3 種主要化學成分輸入PubChem 中，以SDF 形式下載其3D Conformer 并保存在文件夾中，由此獲得主要配體的3D 模型。阿爾茨海默病的蛋白質(zhì)受體的3D 模型主要通過PDB（https：//www. rcsb. org/）這一網(wǎng)址進行搜索，首先排除非人的靶點，再以從最好到最壞的方式將其A 值進行排列（A 值越小，蛋白質(zhì)受體越好），通過下載其PDF格式，便可獲得蛋白質(zhì)受體不同類型的3D模型。接下來便可通過CB－Dock 軟件將蛋白質(zhì)受體與主要成分配體進行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 牛黃的活性成分篩選

通過在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索牛黃，獲取牛黃的全部化學成分共133 種。根據(jù)標準篩選條件，得到活性成分共計13 個，其中具有中強度滲透性的活性成分有3 種，不透過BBB 的活性成分有10 種。見表1。

表1 牛黃的主要活性成分

續(xù)表1

2.2 活性成分的靶點篩選結(jié)果與預測

排除各化合物對應的相同靶點后，共對應133個潛在靶點。其中11個橙紅色菱形方塊節(jié)點表示有對應靶點的牛黃活性成分，周圍的133個藍色圓形節(jié)點表示活性成分對應的靶蛋白，即潛在的藥物靶點，邊緣表示交互作用，節(jié)點的大小與程度成正比，繪制結(jié)果見圖1。

圖1 牛黃活性成分與對應靶點的復合目標網(wǎng)絡

2.3 AD相關病理靶點的篩選

TTD 數(shù)據(jù)庫檢索得到AD 相關靶點156 個；GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索到AD 初始靶點11 207 個，以≥1.5為篩選條件得到AD 相關靶點7 214個；OMIM 數(shù)據(jù)庫檢索得到377 個相關結(jié)果后刪除重復靶點得到AD相關靶點200個；DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索得到AD相關靶點99 個。對各個基礎工具檢索的結(jié)果進行合并，刪除重復靶點后共得到10 437 個AD 相關靶點，繪制的Venn圖結(jié)果見圖2。

圖2 篩選AD相關靶點的Venn圖

2.4 牛黃活性成分－AD共同靶點的篩選及構(gòu)建網(wǎng)絡

將篩選后獲取的133 個藥物靶點與10 437 個疾病靶點上傳至在線繪圖工具平臺Cytoscape，找出交集靶點共4 個，并將靶點上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫以構(gòu)建PPI網(wǎng)絡。網(wǎng)絡圖顯示共有23 個節(jié)點，97 條邊，平均節(jié)點度為8.43，見圖3。其中節(jié)點表示相關蛋白，邊表示蛋白與蛋白之間的相互作用。

圖3 靶標蛋白相互作用核心網(wǎng)絡圖

2.5 牛黃活性成分治療AD關鍵靶標的KEGG通路富集分析結(jié)果

為了討論牛黃對AD 作用的分子機制，我們通過KOBAS 數(shù)據(jù)庫對牛黃活性成分與疾病的5 個交集基因CHRM3、CHRM1、CCND2、MTTP、BCL2進行了KEGG 富集通路分析。選擇每個聚類富集率最高且P值< 0. 05 的5 條通路，并將得到的通路進行可視化，見圖4、表2。圖中縱坐標表示KEGG 富集所得的通路，橫坐標表示負的P值的對數(shù)。

圖4 富集分析通路圖

表2 5個交集基因的KEGG通路富集結(jié)果

分析富集結(jié)果顯示，其可能生物學進程主要包括氧化應激、細胞凋亡［9］、線粒體動態(tài)變化分裂與融合［10］、癌癥壞死因子、炎癥介質(zhì)、神經(jīng)生長因子［11］、神經(jīng)元調(diào)節(jié)體內(nèi)能量平衡［12］等；信號通路主要為膽堿能突觸、胃酸分泌、唾液分泌、凋亡－多物種、p53 信號通路、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、催乳激素信號通路、FoxO 信號通路、細胞衰老等，以上富集分析數(shù)據(jù)顯示，牛黃的主要成分可能通過作用于神經(jīng)系統(tǒng)相關的信號通路，如含血清素的膽堿能神經(jīng)突觸等，還對凋亡－multiple specesp53 信號通路、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、催乳激素信號通路、FoxO 信號通路、唾液分泌通、胃酸分泌等進行調(diào)控，從而發(fā)揮治療AD 的潛在作用。信號通路的顯著性通過展示圖中氣泡的大小來表示，氣泡越大代表富集該通路的基因越多，說明該通路在牛黃發(fā)揮治療AD 的作用中越重要。該結(jié)論研究初步揭示牛黃神經(jīng)作用的關鍵靶點及涉及的信號通路，為進一步研究其AD 作用機制提供參考和依據(jù)。

2.6 活性成分－疾病交集基因與通路的網(wǎng)絡互作圖

橙色的5 個節(jié)點表示牛黃活性成分與疾病交集基因；外面的圓圈為基因?qū)耐?；有深藍色圈的通路表示P值<0.05且選擇每個聚類富集率最高的5條的通路。見圖5。

圖5 活性成分－疾病交集基因與通路的網(wǎng)絡互作圖

2.7 分子對接

2.7.1 牛黃活性成分與AD 所對應的靶蛋白的交集——受體

2004 年發(fā)表于PubMed 的超高分辨率藥物設計關于人醛糖還原酶抑制劑復合物首次提出了一個36 kDa蛋白質(zhì)的亞原子分辨結(jié)構(gòu)［13］，即醛糖還原酶（P 代號1S0）。其分辨度為0.66?，該模型總體上非常有序，此外，這個蛋白模型和電子密度詳細顯示了較多細微特征，例如氫原子、鍵密度和標磚立體化學的顯著偏差等。同時，該模型的氫鍵網(wǎng)絡、多重構(gòu)想以及溶劑結(jié)構(gòu)也有相對完善的定義。更為重要的是該模型的活性中心區(qū)域的大部分原子具有極好的有序性，以此可以確定與催化作用有關的殘基的質(zhì)子化狀態(tài)。以人模型結(jié)構(gòu)1US0 為蛋白受體對牛黃主要成分及其主要活性小分子進行分子對接，可為研究中藥牛黃對阿爾茨海默病的作用機制提供一些參考，故分子對接選用1US0作為受體。

2.7.2 牛黃活性成分——配體

牛黃為?？苿游锱５母稍锬懡Y(jié)石，通過對2020 版《中華人民共和國藥典》和TCMSP 數(shù)據(jù)庫內(nèi)容進行整合，得出其主要成分為oleanolic acid、ergosterol、ursolic acid、methyl（4R）－4－［（3R，5S，7S，8R，9S，10S，12S，13R，14S，17R）－3，7，12－trihydroxy－10，13－dimethyl－2，3，4，5，6，7，8，9，11，12，14，15，16，17－tetradecahydro－1H－cyclopenta［a］phenanthren－17－yl］pentanoate、Methyl desoxycholate、chenodeoxycholic acid、Cherianoi、methyl（4R）－4－［（3R，5S，7R，8R，9S，10S，13R，14S，17R）－3，7－dihydroxy－10，13－dimethyl－2，3，4，5，6，7，8，9，11，12，14，15，16，17－tetradecahydro－1H－cyclopenta［a］phenanthren－17－yl］pentanoate、Deoxycholic Acid、ZINC01280365 和CLR這11 種［5］，其中能與阿爾茨海默病受體進行分子對接的活性成分只有Cherianoine、ursolic acid、chenodeoxycholic acid 這3種。

2.7.3 關鍵靶點的分子對接結(jié)果

根據(jù)成分－疾病－通路網(wǎng)絡的結(jié)果，確定關鍵靶點為 Muscarinic acetylcholine receptor M1、Prostaglandin G/H synthase 2、Neuronal acetylcholine receptor protein，alpha－7 chain、Carboxylesterase 2；關鍵成分為Cherianoine、ursolic acid、chenodeoxycholic acid。經(jīng)PDB數(shù)據(jù)庫對四種關鍵靶點中的蛋白質(zhì)從好到壞進行分析提取，發(fā)現(xiàn)能夠與活性成分進行分子對接的蛋白質(zhì)活性成分均為aldose reductase（醛糖還原酶）。利用CB－Dock軟件對關鍵靶點中的活性蛋白和關鍵成分的相互作用進行分子對接預測，見圖6。CB-Dock 會對每一種預測模型進行vina值打分，vina值表明化合物與蛋白質(zhì)之間具有一定的結(jié)合活性，vina值越負，表明該化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合越穩(wěn)定。經(jīng)軟件對接得出關鍵靶點蛋白aldose reductase與關鍵成分的相互作用vina值分別為?6.1、?9、?9、?6.4、?6.4、?9，均≤?6.4，表明aldose reductase 與Cherianoine、ursolic acid、chenodeoxycholic acid之間均有較強的結(jié)合能力，其中aldose reductase 與ursolic acid、chenodeoxycholic acid 的vina 值均為?9，表明它們的結(jié)合能力最強。牛黃極有可能是通過其中的活性成分ursolic acid和chenodeoxycholic acid 作用于人體阿爾茨海默病靶點中的aldose reductase結(jié)構(gòu)從而發(fā)揮治療阿爾茨海默病的作用的。

圖6 分子對接結(jié)果示意圖

3 分析與討論

中醫(yī)古籍中沒有阿爾茨海默病的名稱記載，可被定義為“癡呆”“呆病”“健忘”等，明代張景岳《景岳全書·雜證謨》中最早提出“癡呆”病名。其發(fā)病機制是五臟虛損為本，痰濁、瘀血邪實蒙蔽清竅為標［14］。牛黃具有清心、化痰、利膽、鎮(zhèn)驚的作用。本研究主要通過網(wǎng)絡藥理學和分子生物學相互結(jié)合的方法，初步研究探討牛黃治療AD的可能作用靶點及機制，具體見圖7。

圖7 網(wǎng)絡藥理學聯(lián)合代謝組學構(gòu)建的靶點－基因－通路圖

3.1 潛在有效成分分析

3.1.1 熊果酸

有研究顯示，熊果酸作用于阿爾茨海默病模型后，Aβ25－35處理的細胞存活率水平顯著升高，細胞凋亡率水平降低，Cleaved Caspase－3 蛋白表達能力下降，MDA、ROS 水平降低，SOD 活性提升，SNHG14表達降低，miR－105表達升高（P< 0.05），而SNHG14 過表達或干擾miR－105 表達可降低熊果酸對Aβ25－35誘導的PC12 細胞起到保護作用。因此，熊果酸可能通過調(diào)控SNHG14/miR－105 分子軸從而抑制Aβ25－35誘導的PC12 細胞凋亡，并減輕細胞氧化損傷，從而起到對阿爾茨海默病的預防作用［15］。

3.1.2 鵝去氧膽酸

通過查閱文獻，鵝去氧膽酸具有對抗DEX 誘導的小鼠巨噬細胞系RAW264.7 凋亡作用，且與上調(diào)凋亡抑制蛋白mRNA 表達有關［16］。還可顯著抑制LPS 誘導的細胞炎癥反應，其機制可能與激活TGR5、抑制Akt/NF－κB 信號通路有關［17］。這些作用均可直接對阿爾茨海默病的抑制產(chǎn)生影響，從而極大地降低發(fā)病率。

3.2 潛在靶點分析

3.2.1 毒蕈堿型乙酰膽堿受體M1

毒蕈堿型乙酰膽堿受體（M 受體）亞型M1 受體（M1R）在腦內(nèi)的分布量極大，且在海馬和大腦皮層中高度表達，發(fā)揮著舉足輕重的促進學習記憶的作用，激活M1R 可增強長時間電位（long－time potentiation，LTP）并誘導神經(jīng)元樹突棘頭部絲狀偽足的形成，從而改善神經(jīng)突觸可塑性［18］。通過對突觸可塑性和學習記憶促進作用進行探索，可能為阿爾茨海默病等認知功能障礙疾病的研究和治療提供新的思路和可能的新靶點。

3.2.2 前列腺素G/H合酶

白細胞介素－1在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細胞，介導T細胞和B細胞的活化、增殖與分化及在炎癥反應中至關重要，它的作用可能部分通過前列腺素介導。前列腺素G/H合酶（PGHS）是合成前列腺素的關鍵酶［19］，其可能間接對細胞的凋亡和炎癥反應起重要作用。

3.2.3 α7煙堿型乙酰膽堿受體

在探究激活α7 煙堿型乙酰膽堿受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAchR）對大腦皮質(zhì)神經(jīng)元氧糖剝奪損傷的作用及可能機制后發(fā)現(xiàn)，與氧糖剝奪組相比，PNU－282987可提高大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的存活率、降低LDH的含量、抑制大腦神經(jīng)元細胞凋亡、降低ROS產(chǎn)量（P< 0.05），同時使HO－1 蛋白的表達顯著升高、HIF－1α蛋白表達顯著減少（P<0.05）［20］。這些結(jié)果均表明激活α7煙堿型乙酰膽堿受體具有抗大腦皮質(zhì)神經(jīng)元氧糖剝奪損傷作用，該作用可能與抗氧化應激有關，進而對阿爾茨海默病的發(fā)生起到一定的調(diào)節(jié)作用。

3.2.4 羧酸酯酶2

羧酸酯酶（CES）是一類藥物代謝I相酶，屬絲氨酸水解酶家族，廣泛分布于哺乳動物體內(nèi)，是大部分前藥代謝活化過程中的一個關鍵性酶類。近年來有研究發(fā)現(xiàn)肥胖、糖尿病患者CES2 表達水平顯著升高，說明糖尿病和羧酸酯酶2 之間存在某種關聯(lián)［21］，而決定糖尿病是否發(fā)生的關鍵性因素——胰島素，和阿爾茨海默病也有著千絲萬縷的關系。因此，可推斷羧酸酯酶2和阿爾茨海默病之間可能存在著某些關聯(lián)。

3.3 生物富集分析

為了討論牛黃對AD 作用的分子機制，筆者通過KOBAS 數(shù)據(jù)庫對牛黃活性成分與疾病的交集基因CHRM3、CHRM1、CCND2、MTTP 和BCL2 共5 個基因進行了KEGG 富集通路分析。在給定路徑中觀察至少m個疾病相關基因的P值可按照公式1 進行計算，其中m是疾病相關基因數(shù)，M是與給定疾病相關的基因總數(shù)，N是已經(jīng)科學驗證的基因數(shù)量，n是通路中的基因數(shù)量［22］。P值越小，表示與疾病相關的基因列表在這一途徑中的比例越高，一般認為相關通路的統(tǒng)計顯著性閾值為P<0.05 即可表示否定無效，假設的兩組差別有顯著意義。

因此，筆者在不同的集群中均選取P<0.05 的數(shù)據(jù)進行分析，其中每個集群僅顯示富集率最高的5 條通路，最終共得到16 條通路，分別為膽堿能突觸［hsa04725］、胃酸分泌［hsa04971］、味覺傳導［hsa04742］、胰島素分泌［hsa04911］、唾液分泌［hsa04970］、刺猬信號通路［hsa04340］、凋亡－多物種［hsa04215］、p53 信號通路［hsa04115］、肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）［hsa05014］、麻疹［hsa05162］、催乳素信號通路［hsa04917］、細胞周期［hsa04110］、FoxO 信號通路［hsa04068］、Hippo 信號通路［hsa04390］、細胞凋亡衰老［hsa04218］及氨酰tRNA 生物合成［hsa00970］。筆者通過參考各種文獻，確定了目前已經(jīng)證實的和阿爾茨海默病相關的通路共10 條，分別為膽堿能突觸、胰島素分泌、刺猬信號通路、p53 信號通路、肌萎縮側(cè)索硬化癥、細胞周期、FoxO 信號通路、Hippo信號通路、細胞凋亡衰老和氨酰tRNA生物合成。

3.3.1 膽堿能突觸

阿爾茨海默病是最常見的年齡相關神經(jīng)退行性疾病。其特征是出現(xiàn)β－淀粉樣蛋白（Aβ）斑塊和神經(jīng)元纖維纏結(jié)積聚，這最終會導致基底前腦膽堿能神經(jīng)元的減少［23］。膽堿能突觸在人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中普遍存在，它們在丘腦、紋狀體、邊緣系統(tǒng)和新皮質(zhì)的高密度表明膽堿能傳遞可能在學習記憶、注意力和其他高級腦功能等方面發(fā)揮著中流砥柱的作用。而膽堿酯酶抑制劑可顯著增加乙酰膽堿在大腦中的有效含量，是臨床上證明可用于治療阿爾茨海默病的少數(shù)藥物療法之一，可見膽堿能系統(tǒng)是該病的重要治療靶點［24］。

3.3.2 胰島素分泌

越來越多的證據(jù)表明阿爾茨海默病、葡萄糖代謝、胰島素活性和記憶之間存在潛在的聯(lián)系。微管相關蛋白tau（MAPT）主要是微管動力學和組裝以及神經(jīng)突起生長所必需的微管蛋白結(jié)合蛋白。而胰島素信號對突觸可塑性和記憶形成非常重要，因此可推斷其對正常的大腦功能至關重要［25］。最近，tau 被認為是胰島素信號的重要調(diào)節(jié)者，有證據(jù)表明tau與大腦和外周胰島素抵抗以及β細胞功能障礙有關。反過來說，胰島素抵抗也會導致tau 功能障礙，出現(xiàn)身體功能的惡性循環(huán)［26］。也有實驗研究表明，在AD 患者中，胰島素抵抗與血漿胰島素水平升高和第一時相胰島素分泌降低可能與AD的發(fā)生有關［27］。因此，可得出阿爾茨海默病的發(fā)生和胰島素分泌這條通路密切相關這一結(jié)論。

3.3.3 刺猬信號通路

已有實驗證明了PN－1 可通過阻斷刺猬信號通路，減少海馬神經(jīng)元凋亡，提高空間學習記憶能力，從而對AD 起到保護作用。刺猬信號通路可通過機體的一些途徑導致阿爾茨海默病的產(chǎn)生，深入研究這條通路可對阿爾茨海默病的治療起到一定作用［28］。

3.3.4 p53信號通路

TREM2 突變可引起神經(jīng)退行性疾病，可初步判斷其與阿爾茨海默病風險增加相關。通過體外誘變等報告分析，證實了TREM2 啟動子中存在p53 RE。此外，CHIR－98014 這種特異性抑制劑，可強烈抑制p53 激活TREM2 和酪氨酸bp。由此可得出：TREM2 是一個直接的p53 靶基因，阿爾茨海默病的抑制可通過作用于p53通路的TREM2進而進行調(diào)節(jié)［29］。

3.3.5 肌萎縮側(cè)索硬化癥

細胞因子介導的炎癥在阿爾茨海默?。ˋD）和肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。通過建立發(fā)現(xiàn)的某些細胞因子與神經(jīng)退行性疾病之間的聯(lián)系，可推斷腦脊液炎性細胞因子可能在未來被用作這些疾病的生物標志物［30］。肌萎縮側(cè)索硬化癥的病因——細胞因子介導的炎癥，可能間接對阿爾茨海默病的發(fā)生起到一定的推動作用。

3.3.6 細胞周期

通過異常的細胞周期再發(fā)生，以及慢性氧化損傷阻止細胞凋亡，神經(jīng)元獲得了類似于腫瘤細胞的“永生”，即會在整個腦組織中形成并產(chǎn)生老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)［31］。新證據(jù)表明，異常的細胞周期重入可能在β 誘導的神經(jīng)元死亡中起著核心作用。一些信號介質(zhì)，如Id1、缺氧誘導因子－1（HIF－1）、細胞周期蛋白依賴性激酶－5（CDK5）和音速刺猬信號通路（Shh），可能有助于有絲分裂后神經(jīng)元中β 誘導的細胞周期重入。此外，Id1 和CDK5/p25 能夠相互拮抗對方的活性［32］。因此，Id 蛋白可能通過調(diào)節(jié)細胞周期在AD 的防治中發(fā)揮潛在的臨床應用，即細胞周期對阿爾茨海默病的產(chǎn)生有一定的調(diào)節(jié)作用。

3.3.7 FoxO信號通路

氧化應激是阿爾茨海默病發(fā)病的一個重要決定因素，氧化應激可能促進FoxO 蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，導致高血糖和活性氧（ROS）的進一步增加，即FoxO 蛋白可能為AD的治療提供潛在的分子靶點［33］。

3.3.8 Hippo信號通路

AD 的根本原因之一是產(chǎn)生疏水性淀粉樣β42（Aβ42）肽，這些肽聚集形成淀粉樣斑塊。這些斑塊誘導氧化應激和異常信號，導致神經(jīng)元死亡和其他與神經(jīng)退行性變相關的病理過程。通過查閱文獻可知，Hippo 通路在對抗Aβ 誘導的小膠質(zhì)細胞炎癥反應中起著關鍵作用，靶向Hippo 信號可能是治療AD 的有前景的治療方法［34-35］。

3.3.9 衰老細胞凋亡

衰老是癡呆相關神經(jīng)退行性變的主要風險因素，在持續(xù)的壓力下，大部分細胞均可導致慢性衰老，其特征是促炎癥分子的分泌，促進組織和器官的功能衰退。切除衰老細胞被認為是一種有希望的治療手段，可以針對衰老表型，預防或減輕與衰老相關的疾病，即有可能成為治療阿爾茨海默病的新興手段［36］。

3.3.10 氨酰tRNA生物合成

一些標記神經(jīng)退行性病變的蛋白質(zhì)，如tau缺乏色氨酸。TrpRS 以細胞質(zhì)（WARS）和線粒體（WARS2）形式存在，這兩種形式的致病基因變體導致TrpRS 缺乏，從而導致人類智力和運動障礙。AD 患者色氨酸依賴性蛋白質(zhì)生物合成的減少證明了基于模型的疾病概念，即色氨酸t(yī)RNA 合成酶缺乏極有可能導致阿爾茨海默病［37］。

4 結(jié)論與展望

網(wǎng)絡藥理學能夠反映和闡明藥物化學成分－多個靶點－多種疾病之間的相互關系，并根據(jù)這種三通路關系建立網(wǎng)絡藥理學模型，從系統(tǒng)的角度說明中藥牛黃對人體生物網(wǎng)絡的作用，這個構(gòu)建體系與中醫(yī)藥多組分、多靶點、多途徑的治療方法不謀而合。但是，單純用傳統(tǒng)的試驗方法來檢測某種中藥的精確作用機制相對困難。

本篇研究通過對牛黃活性成分靶點和阿爾茨海默病的靶點進行收集和作圖，得到兩個對疾病有一定作用的活性成分靶點，這兩個靶點指向同一活性成分，表明牛黃通過這個成分治療阿爾茨海默病。

以前對藥物的研發(fā)主要遵循“一個藥物對應一個基因進而治療一種疾病”這種一一對應的模式，這是導致絕大多數(shù)新藥在臨床試驗中失敗的主要原因。實際上，臨床上的多種慢性病如阿爾茨海默病、糖尿病、心腦血管疾病等都是多基因、多因素、多靶點共同作用的結(jié)果，僅根據(jù)單一作用靶點很難將機體各方面進行調(diào)節(jié)，從而達到良好治療的效果?；诰W(wǎng)絡藥理學形成藥物－成分－疾病靶點－疾病的新模式，是發(fā)展創(chuàng)新藥物的重要途徑。

隨著網(wǎng)絡藥理學的誕生，我們便可借助于現(xiàn)代化軟件技術將藥物研發(fā)模式進行研究與改進，逐漸轉(zhuǎn)變常規(guī)的研發(fā)理念，從多靶點與復雜疾病交互成網(wǎng)這一角度，通過計算機來模擬構(gòu)建藥物與疾病的網(wǎng)絡關系圖，增強研究前的篩選數(shù)據(jù)范圍，形成一種新型的藥物研發(fā)模式，以此通過該模式研制的藥物治療更多疾病。

本研究主要通過各個數(shù)據(jù)庫挖掘中藥牛黃的活性成分和作用靶點以及疾病AD 的關鍵作用基因，應用網(wǎng)絡藥理學和分子生物學的研究方法從分子水平為中藥研究提供了相對科學可行的理論研究。