外源磷酸鈉對棗果實活性氧和苯丙烷代謝關鍵酶活性及酚類物質積累的影響

溫曉麗

（鞍山師范學院化學與生命科學學院，遼寧鞍山 114000）

棗是一種典型的藥食兼用水果，具有調節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞等保健作用[1]。棗亦富含多種營養(yǎng)物質，相較于一般水果，糖含量較高，還包含維生素C、脂肪、膳食纖維、氨基酸、蛋白質、環(huán)磷酸鳥苷、環(huán)磷酸腺苷、酚、類黃酮以及礦物質等[2]。三星棗是我國御寒能力很強的棗品種之一，肉質嫩脆、產量穩(wěn)定、成熟快、營養(yǎng)物質均衡，被稱為“北方瑪瑙”[3]。棗果實采收正值高溫季節(jié)，采后呼吸速率較大，易導致果實失水萎蔫、軟化、酒軟等而失去食用價值[4]。因此，延長鮮棗的保鮮期和提高其品質已成為棗產業(yè)發(fā)展及其產業(yè)化的關鍵問題[5-6]。

磷酸鈉為白色或無色晶體，可通過增加pH 和增強離子強度來提高食品的保水能力，從而作為一種品質改良劑在食品工業(yè)中廣泛應用[7]。磷酸鈉在果蔬采后防腐保鮮中也有一些報道。王修俊等[8]研究發(fā)現(xiàn)，復合磷酸鹽處理可以有效防止鮮切青蘋果的酶促褐變。已有研究證明，采后磷酸鈉處理可誘導蘋果果實對黑斑病的抗性，并且促進了苯丙烷和活性氧代謝關鍵酶活性和次生代謝產物的積累[9-10]。此外，采后磷酸鈉處理可降低棗果實的還原糖含量，抑制棗果實蔗糖代謝中的酸性轉化酶、中性轉化酶、蔗糖合酶裂解、蔗糖合酶合成和蔗糖磷酸合酶活性從而抑制果實呼吸速率，達到保鮮效果[11]。棗果實的研究還證明，采后精氨酸、1-MCP 等處理可以增強果實抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活性，激活苯丙烷代謝來降低棗皮細胞膜通透性并增加果實的抗病性[12-13]。由此說明，活性氧代謝和苯丙烷代謝在果實抗病中具有重要作用。苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）和4-香豆酰CoA 連接酶（4-coumarate/coenzyme A ligase，4CL）是苯丙烷代謝途徑的關鍵酶，其活性高低與酚類、黃酮類和木質素等產物的積累密切相關[14]。此外，采后誘抗劑處理還可以誘導果實胞內H2O2積累，從而作為信號分子激活苯丙烷代謝途徑，提高了PAL 和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性，促進木質素、酚類物質等的積累，以抵抗病原菌的侵染并提高貯藏性能[14-16]。綜上所述，活性氧代謝、苯丙烷代謝途徑與果蔬抗性密切相關。然而，尚未見采后磷酸鈉處理對棗果實活性氧和苯丙烷代謝影響的報道。

本研究以三星棗為對象，分析磷酸鈉處理后果實H2O2含量及其清除相關酶GR 和APX 活性，苯丙烷代謝關鍵酶PAL、4CL 和POD 活性及酚類物質含量的變化，為揭示磷酸鈉提高棗果實保鮮效果的機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三星棗 采自遼寧省朝陽市，選取無損傷、質地優(yōu)良、大小均一的果實，成熟度為半紅果，紙箱包裝后當天運回實驗室進行處理；磷酸鈉 北京索萊寶生物科技有限公司；鹽酸（36%～38%）、硫酸（95%～98%）、四氯化鈦 錦州古城化學試劑廠；氫氧化鈉福晨（天津）化學試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉天津博迪化工股份有限公司；交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

UV-2550 型分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；湘儀H1650R 離心機 湘儀離心機儀器有限公司；L6S 紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 外源磷酸鈉處理棗果實 挑選成熟度一致，大小和顏色均勻，無機械損傷和病蟲害的三星棗果實。用預實驗篩選的0.5 mg/mL 磷酸鈉溶液（含0.01%Tween 20）浸泡果實5 min，以蒸餾水處理為對照。將果實風干后放入聚乙烯（PE）托盤中，在室溫下（20±2 ℃，相對濕度75%±5%）保存待用。每組處理用果實210 個。參考葛永紅等[17]的方法，分別于處理后第0、2、4、6、8、10 和12 d 果實去核，帶皮切碎組織并在液氮中冷凍，然后放入-80 ℃冰箱中保存待用。每組處理每次用果實30 個。

1.2.2 過氧化氫（H2O2）含量測定 參考Liu 等[18]的方法并修改。精確稱取1.0 g 冷凍組織，加入3.0 mL冷丙酮在冰浴條件下研磨成勻漿，然后低溫（4 ℃）離心20 min（12000×g）。取2.0 mL 上清液，加入40 μL，20 mol/L 四氯化鈦溶液和50 μL 濃氨水反應5 min，在相同條件下離心10 min。沉淀物用冷丙酮洗滌3 次后溶于3.0 mL，1.0 mol/L H2SO4溶液中，并在410 nm 下測定吸光度值。按照同樣的方法，以吸光度為縱坐標，H2O2物質的量（μmol）為橫坐標，制作H2O2標 準 曲 線（y=0.0063x+0.0208，R2=0.9952）。H2O2含量以μmol/g FW（鮮重）表示。

1.2.3 APX 活性測定 APX 粗酶液提取和活性測定參照Ge 等[14]的方法。取1.5 g 冷凍組織，液氮研磨成粉末，然后加入3.0 mL 磷酸緩沖液（pH7.5，0.1 mol/L）繼續(xù)研磨成勻漿后在4 ℃、12000×g 條件下離心25 min 收集上清液。APX 反應體系包括2.0 mL 100 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.5），0.8 mL 3.0 mmol/L抗壞血酸，200 μL 粗酶液和0.5 mL 0.5 mmol/L H2O2。反應啟動15 s 后測量混合液在290 nm 處的吸光度值，并連續(xù)測量2 min。以吸光度值每分鐘變化0.01 為1 個酶活性單位（U），APX 活性以U/g FW表示。

1.2.4 GR 活性測定 GR 粗酶液提取和活性測定參照Ge 等[14]的方法。稱取1.0 g 冷凍組織，液氮研磨成粉末，然后加入3.0 mL 磷酸緩沖液（pH7.5，0.1 mol/L）繼續(xù)研磨成勻漿后在12000×g 條件下（4 ℃）離心25 min 收集上清液。GR 反應體系包括3.0 mL 磷酸鈉緩沖液（100 mmol/L、pH7.5）、90 μL NADPH（3.0 mmol/L）、0.1 mL 氧化型谷胱甘肽（5.0 mmol/L）和0.6 mL 粗酶液。反應完成后測定混合液在340 nm處的吸光度。以340 nm 處吸光度值每分鐘變化0.01 為1 個酶活性單位（U），GR 活性表示為U/g FW。

1.2.5 PAL 活性測定 PAL 粗酶液提取和活性測定參照Liu 等[19]的方法。稱取冷凍組織1.5 g，液氮研磨成粉末后加入4.0 mL 硼酸緩沖液（100 mmol/L，pH8.8），繼續(xù)磨成勻漿后靜置提取20 min，最后在12000×g 條件下（4℃）離心20 min 收集上清液。PAL 反應體系包括0.5 mL 粗酶液、0.5 mL 苯丙氨酸溶液（0.02 mol/L）和3.0 mL 蒸餾水?；靹蚝笥?90 nm 處分別測定反應0 min 和反應40 min 的吸光度。以290 nm 處吸光值每分鐘變化0.01 定義為1 個酶活性單位（U），PAL 活性以U/g FW 表示。

1.2.6 4CL 活性測定 4CL 粗酶液提取和活性測定參照Ren 等[20]的方法。稱取冷凍組織2.0 g，加入4.0 mL 預冷的Tris-HCl 緩沖液（0.2 mol/L）磨成勻漿后暗處反應20 min，低溫離心（12000×g）30 min 后收集上清液待測定。4CL 反應體系由0.15 mL 香豆酸（2.0 mmol/L）、0.15 mL 乙酰輔酶A（1.0 μmol/L）、0.15 mL 三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）（0.8 mmol/L）、0.45 mL 氯化鎂（75 mmol/L）和1.5 mL粗酶液組成。酶活性以U/g FW 表示，將333 nm 處吸光值每分鐘變化0.01 定義為1 個酶活性單位（U）。

1.2.7 POD 活性測定 參考葛永紅等[17]的方法提取粗酶液和測定POD 活性。稱取果肉組織1.5 g，加入4.0 mL 預冷的0.05 mol/L 磷酸鈉提取液（pH7.5，內含1.0 mmol/L 聚乙二醇、2.0% 聚乙烯吡咯烷酮和0.01% Triton X-100），磨成勻漿后低溫離心（12000×g）30 min 后收集上清液。反應體系包括2.5 mL、0.025 mol/L 的愈創(chuàng)木酚，0.2 mL、0.25 mol/L 的H2O2和0.2 mL 粗酶液。以470 nm 處吸光度值每分鐘變化0.01 定義為1 個酶活性單位（U），POD 活性以U/g FW 表示。

1.2.8 總酚和類黃酮含量測定 參考Liu 等[18]的方法。稱取1.0 g 磷酸鈉處理和對照果肉組織，分別加入3.0 mL 預冷的1%鹽酸-甲醇溶液，冰浴條件下充分研磨后在4 ℃、12000×g 離心10 min。取上清液分別測定280 nm 和325 nm 處吸光度值。用ΔOD280/g FW和ΔOD325/g FW 分別表示總酚和類黃酮含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有指標的測定均進行3 次生物學重復，全部實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010 計算平均值和標準誤差并作圖，采用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件進行最小極差分析，以P＜0.05 表示對照和處理差異顯著。

2 結果與分析

2.1 棗果實H2O2 含量的變化

活性氧爆發(fā)是果蔬遭受脅迫后作出的早期反應之一，果實體內積累的H2O2可以作為信號分子啟動防衛(wèi)反應，也可以參與木質素的合成過程，然而過量的H2O2又會導致細胞膜質過氧化，從而加速果實的衰老[21]。由圖1 可知，對照果實H2O2含量在整個貯藏期間呈單峰變化趨勢，在第8 d 達到最大，而磷酸鈉處理果實H2O2含量呈雙峰變化趨勢，分別在貯藏第4 d 和10 d 出現(xiàn)峰值，分別比對照組高16.9%和18.7%。此外，磷酸鈉處理顯著（P＜0.05）促進了貯藏第2、4、8、10 和12 d 棗果實中H2O2含量的增加。蘋果果實的研究也表明，采后磷酸鈉處理誘導了果實中H2O2的積累，并且出現(xiàn)兩個高峰[10]。因此，推測磷酸鈉處理誘導果實中H2O2含量的升高可能是因為其誘抗作用促進H2O2的積累從而作為信號分子啟動其它防衛(wèi)反應的表達，而在后期明顯上升可能是由于其參與了木質素的合成。

圖1 采后磷酸鈉處理對棗果實H2O2 含量的影響Fig.1 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on H2O2 content in jujube fruit

2.2 棗果實APX 活性的變化

APX 是抗壞血酸-還原型谷胱甘肽循環(huán)的關鍵酶，將電子從抗壞血酸轉移到H2O2，并產生周期短的脫氫抗壞血酸和H2O，從而達到清除過量H2O2的目的[22]。由圖2 可知，在整個貯藏期內，磷酸鈉處理和對照果實的APX 活性均呈先升高后降低趨勢，且磷酸鈉處理果實均高于對照果實，同時在貯藏第4～12 d具有差異顯著性（P＜0.05），分別是對照組APX 活性的1.17、1.21、1.15、1.26 和1.20 倍。Ge 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，采后磷酸鈉處理提高了蘋果果實中APX 活性，有助于清除大量積累的H2O2，從而提高蘋果果實的采后抗性。由此表明，磷酸鈉處理棗果實能有效提高抗氧化酶活性并減輕膜脂過氧化反應，從而提高棗果實的抗病能力。

圖2 采后磷酸鈉處理對棗果實APX 活性的影響Fig.2 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on APX activity in jujube fruit

2.3 棗果實GR 活性的變化

GR 是抗壞血酸-還原型谷胱甘肽循環(huán)中的另外一個關鍵酶，依賴NADPH 催化谷胱甘肽，從而保持氧化性和還原性谷胱甘肽的穩(wěn)定[22]。磷酸鈉處理果實中GR 活性在貯藏第0～2 d 和6～8 d 上升，在第2～6 d 和8～12 d 下降；而對照果實GR 活性在貯藏第0～8 d 呈上升趨勢，隨后下降（圖3）。磷酸鈉處理顯著提高了貯藏第2～8 d 棗果實中GR 活性，分別是對照果實的1.46、1.24、1.18 和1.28 倍（P＜0.05）。Ge等[10]研究發(fā)現(xiàn)，采后磷酸鈉處理提高了蘋果果實中GR 活性，并且出現(xiàn)了一個高峰，而本實驗結果表明，磷酸鈉誘導棗果實中出現(xiàn)兩個GR 活性高峰。分析其原因可能是由于貯藏后期H2O2含量增加，為了保證抗壞血酸-還原型谷胱甘肽循環(huán)對H2O2的清除效率和谷胱甘肽平衡，GR 活性再次被誘導升高。由此說明，外源磷酸鈉處理能夠提高棗果實常溫貯藏期間的GR 活性，從而保持氧化性和還原性谷胱甘肽的平衡，但在不同的果蔬中磷酸鈉誘導的抗性反應有差異。

圖3 采后磷酸鈉處理對棗果實GR 活性的影響Fig.3 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on GR activity in jujube fruit

2.4 棗果實PAL 活性的變化

PAL 是苯丙烷代謝的限速酶，調控下游次生代謝產物酚類、木質素、生物堿等的合成，與果實抗病性密切相關[23]。由圖4 可知，對照和磷酸鈉處理果實中PAL 活性在貯藏第0～12 d 呈先升高后降低趨勢，并且在第6 d 達到高峰值。磷酸鈉處理顯著提高了貯藏第4、6 和8 d 棗果實PAL 活性，分別是對照的1.08、1.18 和1.11 倍（P＜0.05）。已有研究表明，采后磷酸鈉能夠誘導蘋果果實中PAL 活性的升高，同時提高其對黑斑病的抗性[10]。由此可見，磷酸鈉處理能夠提高果實中PAL 活性并激活苯丙烷代謝途徑。

圖4 采后磷酸鈉處理對棗果實PAL 活性的影響Fig.4 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on PAL activity in jujube fruit

2.5 棗果實4CL 活性的變化

4CL 是苯丙烷代謝下游分支的關鍵酶之一，催化阿魏酸、對香豆酸、肉桂酸和咖啡酸轉化為對香豆酰-輔酶A[24]。由圖5 可以看出，隨著貯藏時間的延長，磷酸鈉處理與對照果實4CL 活性均呈先上升后下降趨勢，二者均在第8 d 達到高峰值。與對照相比，磷酸鈉處理果實的4CL 活性均保持較高水平，并且在貯藏第4～12 d 差異顯著，分別是對照果實的1.10、1.06、1.16、1.25 和1.16 倍（P＜0.05）。冬棗果實中的研究表明，誘抗劑處理激活了4CL 活性，并且促進了下游產物的積累，從而提高果實的抗性[25]。這些結果表明，促進4CL 活性的升高是磷酸鈉誘導棗果實產生抗性的機理之一。

圖5 采后磷酸鈉處理對棗果實4CL 活性的影響Fig.5 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on 4CL activity in jujube fruit

2.6 棗果實POD 活性的變化

POD 具有多種同工酶，可以清除寄主體內過量積累的H2O2，也是木質素生物合成的關鍵酶[24]。由圖6 可知，磷酸鈉處理棗果實POD 活性始終高于對照果實，在貯藏第4～10 d 差異顯著，對照果實POD活性為磷酸鈉處理果實的83.8%、80.4%、71.2%和93.1%（P＜0.05）。蘋果中的研究證明，采后磷酸鈉浸泡處理誘導了果實中POD 活性的升高，并且呈單峰變化趨勢[10]。冬棗果實的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結果[25]。由此說明，磷酸鈉處理能夠提高棗果實貯藏期間POD 活性。

圖6 采后磷酸鈉處理對棗果實POD 活性的影響Fig.6 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on POD activity in jujube fruit

2.7 棗果實總酚和類黃酮含量的變化

酚類和類黃酮是苯丙烷代謝的主要產物，在果實抗病過程中具有重要作用，二者不僅能夠直接抑制病原真菌的生長，還能強化寄主細胞壁提高對病原真菌侵染的抵抗能力[26]。在整個貯藏期間，磷酸鈉處理棗果實總酚含量始終高于對照果實，且在貯藏第8 d達到峰值（圖7A），其中，6～12 d 磷酸鈉處理果實總酚含量顯著高于對照果實，分別為對照果實的1.19、1.38、1.26 和1.24 倍（P＜0.05）。磷酸鈉處理與對照棗果實中類黃酮含量在貯藏期內緩慢上升，且均在貯藏第10 d 達到峰值（圖7B）。相較于對照組果實，磷酸鈉處理在貯藏第6～12 d 顯著促進了類黃酮的積累，分別為對照組的1.14、1.15、1.29 和1.25 倍（P＜0.05）。Ge 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，采后磷酸鈉處理提高了蘋果果實中總酚和類黃酮含量，并且呈單峰變化趨勢。此外，冬棗果實中的研究也證明，采后誘抗劑處理能夠促進總酚和類黃酮的積累[25]。由此可知，磷酸鈉處理能夠提高棗果實常溫貯藏期間次生代謝產物總酚與類黃酮的積累。

圖7 采后磷酸鈉處理對棗果實總酚（A）和類黃酮（B）含量的影響Fig.7 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on the contents of total phenolic compounds (A) and flavonoids (B)in jujube fruit

3 結論

采后0.5 mg/mL 磷酸鈉浸泡能誘導棗果實中H2O2的積累，并且呈雙峰變化趨勢，同時顯著提高了果實APX 和GR 活性（P＜0.05）。磷酸鈉提高了果實PAL、POD和4CL 活性，分別在貯藏第6、8 和8 d出現(xiàn)高峰，這些酶活性的升高顯著促進了總酚和類黃酮的積累（P＜0.05）。由此說明，采后外源磷酸鈉處理能夠激活棗果實活性氧清除酶的活性，促進苯丙烷代謝關鍵酶活性和酚類物質的積累。