超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定動(dòng)物源性食品中9 種多肽類抗生素殘留

李蓮微，楊曉聰，姚閩娜, ，劉正才，李小晶

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002；2.信陽農(nóng)林學(xué)院食品學(xué)院，河南信陽 464000；3.福州海關(guān)技術(shù)中心，福建福州 350001）

多肽類抗生素是一類具有多肽結(jié)構(gòu)特征的抗生素的總稱，通常含有15～45 個(gè)氨基酸殘基[1]，并且分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，它們中的大多數(shù)通過破壞微生物的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)微生物死亡以實(shí)現(xiàn)抗菌功能，少數(shù)直接穿透細(xì)胞膜并與不同的靶點(diǎn)結(jié)合發(fā)揮抗菌作用[2]，因此被廣泛用于動(dòng)物飼養(yǎng)中作為飼料添加劑和獸藥使用，以促進(jìn)動(dòng)物生長和預(yù)防疫病[3]。動(dòng)物生產(chǎn)過程中抗生素的違規(guī)使用和濫用一方面破壞了抗菌藥物和細(xì)菌耐藥性之間的平衡，加快了細(xì)菌耐藥菌的產(chǎn)生進(jìn)程[4]，這些耐藥菌通過環(huán)境和食品加工環(huán)節(jié)在動(dòng)物源性食品中傳播，臨床上的“超級細(xì)菌”和“超級耐藥基因”逐漸蔓延并出現(xiàn)在食品中，很可能導(dǎo)致人類生病后無藥可治[5-7]。另一方面也帶來了食品安全隱患，長期攝入這些動(dòng)物產(chǎn)品，食物中殘留的多肽類抗生素也會(huì)對人體產(chǎn)生一定的毒副作用[8]。此外，該行為還會(huì)打破動(dòng)物體內(nèi)的微生態(tài)平衡，造成動(dòng)物免疫力減退[9]，累積的獸藥以及其代謝物被排泄到土壤和水中，也可能對農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生生態(tài)毒性[10]。因此，有必要針對動(dòng)物產(chǎn)品中殘留的多肽類抗生素補(bǔ)充和確立更為準(zhǔn)確高效的檢測方法。然而，目前針對多肽類抗生素的檢測大多只涉及到一種或兩種化合物的檢測方法研究，鮮有針對同時(shí)檢測多種多肽類抗生素的方法研究，最多同時(shí)測定也不超過8 種[11-14]。主要有微生物法[15]、免疫分析法[16]、薄層色譜法[17-18]、毛細(xì)管電泳法[19]、毛細(xì)管電色譜[20]、高速逆流色譜法[21]、高效液相色譜法[22]和液質(zhì)聯(lián)用法[23-25]等。其中，液質(zhì)聯(lián)用法可以同時(shí)發(fā)揮色譜和質(zhì)譜的優(yōu)勢進(jìn)行定性、定量檢測[26]，非常適用于多肽抗生素的殘留檢測。本研究建立了一種UPLC-MS/MS 同時(shí)測定動(dòng)物組織中9 種多肽類抗生素殘留的方法，可為相關(guān)部門進(jìn)行多肽類殘留的標(biāo)準(zhǔn)制定和實(shí)際檢測提供補(bǔ)充和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

去甲萬古霉素 純度為83.4%，中國藥品生物制品檢定所；維吉尼亞霉素M1 純度為90% 加拿大Toronto Research Chemicals 公司；萬古霉素、粘桿菌素A、粘桿菌素B、桿菌肽A、太古霉素純度分別為91.2%、84.7%、80.6%、47.1%、28.9% 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司；乙腈、甲醇、甲酸、正己烷 色譜純，德國Merck 公司；鹽酸、酸性氧化鋁、C18、乙酸銨、草酸、三氯乙酸、磷酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；固相萃取柱Oasis HLB 美國Waters 公司，60 mg/3 mL；出口雞肉、雞肝、豬肉等待測樣品共37 批 均采自福建省食品藥品監(jiān)督管理局日常抽檢。

API5500 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Applied Biosystems 公司；CR21N 高速冷凍離心機(jī)美國Beckman Coulter 公司；HN200 多功能氮吹儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 根據(jù)9 種多肽類物質(zhì)的純度進(jìn)行折算后，準(zhǔn)確稱取適量的9 種多肽類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，先用0.1%甲酸水溶解并用甲醇定容至100 mL，分別配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L 的單標(biāo)儲(chǔ)備液，分別準(zhǔn)確量取適量的上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用乙腈-0.1%甲酸溶液（20：80，v/v）配制成所需濃度的混合中間標(biāo)準(zhǔn)工作液，精密量取適量的中間標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別用處理過的空白基質(zhì)樣品配制成不同質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。所有溶液于-4 ℃下冷藏避光儲(chǔ)存。

1.2.2 樣品前處理 取5 g 均質(zhì)過的樣品（精確到0.01 g）于50 mL 具塞塑料離心管，加入15 mL 甲醇+0.1 mol/L 鹽酸溶液（7:3，v/v）和2～3 g 酸性氧化鋁，振蕩2 min，4000 r/min 下離心5 min。收集上清液，渣中再加入10 mL 甲醇-0.1mol/L 鹽酸溶液（7:3，v/v）重復(fù)提取一次。合并上清液并定容至25 mL。取10 mL 于45 ℃氮吹干，用5 mL 0.1 mol/L 鹽酸溶液復(fù)溶，再加入2.0 mL 正己烷，混勻，15000 r/min低溫離心5 min，棄去正己烷，下層水溶液全部過玻璃纖維濾紙，待凈化。

先活化Oasis HLB 固相萃取柱，依次加入3.0 mL甲醇、3.0 mL 水、3.0 mL 0.1 mol/L 鹽酸溶液活化。將待凈化液全部過柱，棄去流出液。用5.0 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液、3.0 mL 水淋洗，棄去流出液。最后加入2.0 mL 0.1%甲酸甲醇溶液（體積比）、3.0 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液。洗脫液45 ℃下氮?dú)獯蹈桑?.0 mL 乙腈-甲酸水（0.1%）（1:9，v/v）復(fù)溶，混勻后過0.22 μm 濾膜待測。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱：Luna? C8（2）100A（150 mm×2 mm，3 μm）；柱溫：35 ℃。流動(dòng)相：A 為0.2%甲酸水溶液，B 為乙腈；梯度洗脫程序：1.5～3 min，10%B～75%B；3～5.5 min，75%B 不變；5.5～6 min，降至10%B，保持2 min，進(jìn)樣量：5 μL，流速：0.3 mL/min。

1.2.4 質(zhì)譜條件 電離模式：電噴霧電離正離子模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式；離子源噴霧電壓：5000 v；氣簾氣壓力：0.275 MPa；離子源溫度：500 ℃；霧化氣壓力：0.345 MPa；加熱輔助氣壓力：0.345 MPa。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，使用Microsoft Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件的選擇

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 多肽類抗生素一般含有4～16 個(gè)氨基酸構(gòu)成的線狀或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，分子量一般在300～3000 之間。在電噴霧離子化時(shí)容易與H+結(jié)合而使離子帶正電，根據(jù)結(jié)合的H+數(shù)量不同，離子所帶的電荷數(shù)可能是單個(gè)也可能是多個(gè)。實(shí)驗(yàn)表明，多肽類抗生素如萬古霉素、去甲萬古霉素、恩拉霉素、桿菌肽、太古霉素等在電噴霧離子化時(shí)能產(chǎn)生不同豐度的雙電荷離子和三電荷離子。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)前者的響應(yīng)比后者要高，因此選擇雙電荷離子（[M+2H]2+）分別作為母離子；粘桿菌素A、B 在流動(dòng)相體系含有銨鹽的情況下，帶雙電荷離子的響應(yīng)和三電荷離子差異不大，而在流動(dòng)性只有甲酸的情況下，帶三電荷離子的響應(yīng)比雙電荷離子高大約100 倍，因此選擇的三電荷離子（[M+3H]3+）作為粘桿菌素A、B 的母離子；而維吉尼霉素M1 產(chǎn)生穩(wěn)定的、強(qiáng)度較高的準(zhǔn)分子離子峰（[M+H]+）。因此，它被選作維吉尼亞霉素M1 的母離子。母離子斷裂或重排之后會(huì)產(chǎn)生不同豐度的碎片離子。選擇兩個(gè)響應(yīng)值高的離子作為定量和定性離子，再優(yōu)化其他參數(shù)。采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），使測定的靈敏度達(dá)到最大。9 種多肽類化合物的主要質(zhì)譜分析條件參數(shù)見表1。

表1 9 種多肽類化合物的主要質(zhì)譜分析條件參數(shù)Table 1 Main parameters for the 9 polypeptide antibiotics by mass spectrometry

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化 由于9 種化合物溶解性差異較大，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相中緩沖溶液的pH、離子強(qiáng)度和有機(jī)溶劑（乙腈或甲醇）的含量，可以控制多肽類化合物的離子化強(qiáng)度和溶解性，在色譜柱上獲得適當(dāng)?shù)谋Ａ艉头蛛x。流動(dòng)相的組成和添加劑對分析物的峰形、基質(zhì)效應(yīng)和離子化效率均會(huì)造成一定的影響。本文在文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上，考察了不同流動(dòng)相組成對于分析物靈敏度的影響。常用的流動(dòng)相有5 mmol/L 乙酸銨-乙腈、5 mmol/L 乙酸銨含0.2%甲酸水溶液-乙腈和0.2%甲酸水溶液-乙腈，本實(shí)驗(yàn)比較了這3 種流動(dòng)相的效果。當(dāng)所用色譜柱為反相色譜柱時(shí)，多肽抗生素易發(fā)生拖尾現(xiàn)象，原因在于其結(jié)構(gòu)上含有多個(gè)氨基和羧基，而反相色譜柱中的硅醇基易和這些氨基羧基發(fā)生作用。當(dāng)緩沖溶液為乙酸銨時(shí)，粘桿菌素、恩拉霉素和桿菌肽響應(yīng)值較低，所以不選用5 mmol/L 乙酸銨-乙腈和5 mmol/L 乙酸銨含0.2%甲酸水溶液-乙腈；而加入甲酸后，響應(yīng)值逐漸增高。因此選用0.2%甲酸水溶液-乙腈。分析其原因，可能是由于甲酸可以提供離子化的質(zhì)子來源，所以加入甲酸能提高響應(yīng)值。為了使9 種多肽類化合物在C8色譜柱上得到較好的分離效果，按照1.2.1 的條件進(jìn)行梯度洗脫，多肽類化合物定量離子對的MRM 色譜圖見圖1。

圖1 空白基質(zhì)（a）和雞肉基質(zhì)加標(biāo)（b）的多肽類化合物定量離子對的MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of quantitative transitions of peptide compounds in blank matrix (a) and chicken matrix spiked (b)

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇 由于多肽類化合物的極性和溶解性差異較大，單一溶劑很難滿足要求，為此實(shí)驗(yàn)考察提取溶劑種類、比例、酸性條件等對提取效果的影響。多肽類化合物屬于極性化合物，其結(jié)構(gòu)中包含多個(gè)氨基和羧基，宜采用極性有機(jī)溶劑提取，又因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)樣品均為動(dòng)物性食品樣品，提取中必須有效去除脂肪沉淀蛋白[27-28]，綜合以上各因素，本實(shí)驗(yàn)首先比較甲醇、乙腈和乙酸乙酯的提取效果，結(jié)果表明，提取效果甲醇較好而乙酸乙酯最差，其中乙酸乙酯對去甲萬古霉素、萬古霉素、恩拉霉素的提取回收率均小于20%。隨后為了比較甲醇在不同酸性體系下的提取效果，本實(shí)驗(yàn)選擇甲酸、鹽酸、草酸、三氯乙酸、磷酸來構(gòu)建不同的酸性體系，結(jié)果（見表2）表明，甲醇中加入三氯乙酸、磷酸后提取回收率為40%～50%，加入甲酸、草酸后提取回收率為60%～70%，甲醇與鹽酸結(jié)合的體系對9 種多肽類的提取效果更佳，提取回收率均在80%以上；再分別考察甲醇與鹽酸不同比率（9:1；8:2；7:3；6:4；5:5，體積比）對化合物提取效果的影響，結(jié)果表明水相越高，目標(biāo)物對去甲萬古霉素、萬古霉素的提取效果越好，而其他化合物的提取效果越差，考慮到提取溶液水相比率太高粘度增大，不利于后面的濃縮凈化過程，因此綜合考慮，選擇甲醇-0.1 mol/L 鹽酸溶液（7:3，V/V）作多肽抗生素的提取溶劑，各化合物的提取回收率均可達(dá)到85%以上。

表2 甲醇在不同酸性體系下對多肽類化合物的提取回收率Table 2 Extraction recoveries of peptide compounds with methanol in different acidic systems

2.2.2 提取條件的優(yōu)化 動(dòng)物組織樣品提取液中雜質(zhì)含量較多，這些雜質(zhì)主要以蛋白、脂肪為主。為了盡可能的減少這些雜質(zhì)對化合物的干擾而不影響提取回收率，實(shí)驗(yàn)在提取過程中加入一些凈化填料。分別比較了加入酸性氧化鋁、PSA 粉、C18粉、無水硫酸鎂等對提取回收率的影響（見圖2），其結(jié)果表明PSA 粉對粘桿菌素有明顯的吸附作用；而C18粉也會(huì)影響太古霉素、桿菌肽、維吉尼霉素M1 的提取效果；無水硫酸鎂對除去甲萬古霉素和維吉尼霉素M1 外所有化合物的影響比酸性氧化鋁的影響大；酸性氧化鋁則對所有化合物的影響不大，故在前期提取時(shí)加入適量的酸性氧化鋁去除蛋白等雜質(zhì)[29-30]，另外在過柱凈化前加入正己烷除去脂肪類等雜質(zhì)，可有效去除雜峰的干擾。

圖2 不同凈化填料對目標(biāo)化合物回收率的影響Fig.2 Effect of different purification fillers on the recovery rate of target compounds

2.2.3 過柱凈化方法的優(yōu)化 根據(jù)參考文獻(xiàn)[31-32]，多肽抗生素樣品凈化方法主要采用陽離子交換、C18和HLB 固相萃取柱。由于化合物恩拉霉素在堿性溶液中不穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)比較了2 種不同的固相萃取柱Oasis HLB 和C18固相萃取柱，分別使用標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行固相萃取過柱實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明C18對去甲萬古霉素和萬古霉素的過柱效果較差，過柱回收率在20%以下，HLB 對幾種抗生素的過柱回收效果較好，因此綜合考慮選擇HLB 固相萃取小柱凈化樣品。在使用HLB 小柱進(jìn)行洗脫液的試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)粘桿菌素、桿菌肽會(huì)吸附在填料上，用純甲醇無法將其洗脫下來，但是當(dāng)向洗脫劑中加入適量酸的時(shí)候就可以洗脫，故實(shí)驗(yàn)采用分步洗脫的方式，先用含甲酸甲醇溶液（體積比1:100）洗脫桿菌素、桿菌肽等化合物，再用甲醇洗脫太古霉素、維吉尼霉素M1 等極性較弱的化合物，優(yōu)化洗脫比例，其甲醇洗脫體積優(yōu)化結(jié)果見圖3，結(jié)果表明2 mL 0.1%甲酸甲醇溶液再加3 mL 甲醇洗脫效果最佳，9 種化合物的過柱回收率在92.1%～98.9%，適合定量分析。

圖3 9 種多肽類化合物在HLB 上的洗脫結(jié)果Fig.3 Elution histogram of 9 polypeptide antibiotics on HLB

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)是開發(fā)和確證液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法過程中十分重要的一步。通常認(rèn)為，基質(zhì)匹配校正曲線斜率與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值在0.85～1.15 之間時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)可以忽略不計(jì)。實(shí)驗(yàn)以雞肉、豬肝、豬腎為基體，以提取液配制基質(zhì)曲線來評價(jià)不同的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，太古霉素（0.3）和粘桿菌素B（0.8）存在基體抑制效應(yīng)，而其它化合物均在0.85～1.02 之間，不存在基質(zhì)效應(yīng)。綜合考慮需消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 方法的線性范圍、檢出限及定量限 按1.2.1的方法配制一系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.2.3 色譜條件和1.2.4 質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，結(jié)果表明在0.1～500 ng/mL 范圍內(nèi)，9 種分析物的質(zhì)量濃度（x, ng/mL）與其定量離子峰面積（y）之間均有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.9955～0.9999 之間（見表3）。方法的定量限（LOQ）根據(jù)其響應(yīng)值大于或等于基線響應(yīng)值的10 倍（S/N≥10）且準(zhǔn)確度和精密度（以RSD 計(jì)）≤20%來確定。采用添加法進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測，得出維吉尼霉素M1 定量限為1.0 μg/kg，去甲萬古霉素和萬古霉素、恩拉霉素A、B、太古霉素的定量限為10 μg/kg，粘桿菌素A、B、桿菌肽A 的定量限為20 μg/kg。

表3 9 種多肽類化合物的線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear equations and correlation coefficients of 9 polypeptide antibiotics

2.4.2 方法的回收率與精密度 取有代表性的不同空白樣品（雞肉、豬肉、豬肝、豬腎）作為添加回收實(shí)驗(yàn)的基質(zhì)，進(jìn)行添加回收和精密度實(shí)驗(yàn)。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法[27]，分別添加低、中、高3 個(gè)不同濃度水平的多肽抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加濃度做6 組平行測定，計(jì)算平均加標(biāo)回收率（Rce.%）及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）。結(jié)果表明9 種多肽的平均回收率為74.2%～96.3%，精密度RSD 為4.3%～14.6%，表明本方法的準(zhǔn)確性良好，精密度良好，結(jié)果見表4。

表4 9 種多肽類化合物在動(dòng)物組織樣品中的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table 4 Recovery and precision of 9 polypeptide antibiotics in animal tissue sample (n=6)

2.4.3 實(shí)際樣品檢測 應(yīng)用本方法檢測出口雞肉、雞肝、豬肉等樣品共37 批，結(jié)果在2 批次雞肝樣品中檢出粘桿菌素A，結(jié)果分別為26.3 μg/kg 和35.0 μg/kg，其他化合物均未檢出。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對動(dòng)物組織中的萬古霉素、去甲萬古霉素、恩拉霉素A 與B、太古霉素、粘桿菌素A 與B、桿菌肽A、維吉尼霉素M1 等9 種多肽抗生素殘留進(jìn)行了快速、準(zhǔn)確的定量與定性分析，在雞肉、豬肉、豬肝、豬腎等基質(zhì)中采用加標(biāo)回收試驗(yàn)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法的回收率為74.2%～96.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%～14.6%。采用所建立的方法對雞肉、雞肝、豬肉等樣品進(jìn)行檢測，在雞肝中檢測到了粘桿菌素A。該方法簡單快速，靈敏度高，可為有關(guān)部門進(jìn)行動(dòng)物組織中多肽類殘留的標(biāo)準(zhǔn)研究和實(shí)際檢測提供方法參考和補(bǔ)充。