蘆筍兩性株染色體的細胞學(xué)研究

李 霞， 包艷存， 李保華， 牛曉雪， 路 遠， 牟 萌， 楊 林

(濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 山東 濰坊 261071)

cytological characteristics

蘆筍(AsparagusofficinalisL.)學(xué)名石刁柏，是百合科天門冬屬多年生草本宿根性植物，以嫩莖供食，是國際市場公認的營養(yǎng)保健蔬菜。核型分析表明，天門冬屬植物有二倍體、四倍體和六倍體，共同的染色體基數(shù)是x=10[1]，普通二倍體蘆筍有20條染色體2 n=2 x=20(XY)，其中有10條大染色體、2條中型染色體和8條小染色體，除了小染色體3號為亞中著絲粒染色體外，其他染色體都是中部著絲粒染色體，核型類型屬2 B型，較不對稱，為較原始的類型[2]。蘆筍屬于雌雄異株植物，一般蘆筍雌株只開雌花，雄株只開雄花，其性別決定主要體現(xiàn)在雌、雄花器官的形態(tài)建成上。蘆筍性別有3種基因型和4種表現(xiàn)型，分別為雌株(mm)、普通雄株(Mm)、超雄株(MM)、雄性兩性株(Mm，簡稱兩性株)，其中超雄株是有活力的[3-4]。蘆筍和其他雌雄異株植物一樣，不論是雌株還是雄株，最初形成的都是兩性花，同時具備雄蕊和雌蕊，在發(fā)育過程，雌性或雄性器官發(fā)生退化，兩性花逐漸發(fā)育形成單性花[5]。但自然界中有些蘆筍雄株的雌蕊退化不完全而會結(jié)出少量果實，形成種子，這樣的植株稱為兩性株，通常情況下蘆筍兩性株出現(xiàn)的比例僅有0～2%[6]。目前國內(nèi)僅在蘆筍兩性株的初步利用、調(diào)查、兩性花誘導(dǎo)及生理生化等方面做了研究[6-9]，還未涉及對蘆筍兩性株染色體的研究，故本試驗采用常規(guī)的細胞學(xué)分析方法對蘆筍兩性株的染色體進行有絲分裂和減數(shù)分裂研究，旨在為蘆筍兩性株的研究增加細胞學(xué)資料，為進一步揭示兩性株生長發(fā)育提供理論基礎(chǔ)。

注：A為荷蘭全雄兩性株單株；B為兩性株后代套袋雄株(取此根尖和花蕾)；C為收獲的兩性株漿果；D為有種皮的兩性株種子；E為有種皮和無種皮的兩性株種子；F為無種皮的兩性株種子。圖1 兩性株試材Fig.1 Test materials of andromonoecious plants

1 材料與方法

1.1 材 料

以“冠軍”父本“荷蘭全雄”為原始材料，2018年9月田間調(diào)查3 267株制種群體(占地面積6.67 hm2)中雄株單株結(jié)種情況，發(fā)現(xiàn)有22株雄株結(jié)種，將新結(jié)種子全部收獲，共計2 256粒，觀察發(fā)現(xiàn)種子的大小、千粒重、飽滿度及種皮的有無等均不一致。所有種子于2019年3月育苗，6月定植于濰坊市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園大棚中，成活植株968株，成活率為42.91%，10月淘汰其中的雌株，剩余雄株418株，單株做標記。2020—2021年連續(xù)2年調(diào)查兩性株后代雄株的生長情況，對其中結(jié)種單株用90目紗網(wǎng)套袋，取當年生的根尖和花蕾分別進行有絲分裂和減數(shù)分裂研究(圖1)。

1.2 方 法

1.2.1根尖染色體有絲分裂觀察

采用孚爾根染色法，取套袋兩性株當年生的白色根尖，置于蒸餾水中于0 ℃處理24 h后，加入新配制的卡諾氏固定液Ⅰ(V乙醇∶V冰乙酸=3∶1)保存于4 ℃冰箱內(nèi)，根尖用1 mol/L鹽酸60 ℃解離10 min，Schiff試劑染色，1%醋酸洋紅常規(guī)壓片，Olympus BX 41顯微鏡觀察，挑選處于分裂中期形態(tài)良好的細胞在100倍的油鏡下拍照，對50個染色體中期分裂相好的制片進行統(tǒng)計分析。計算染色體數(shù)目、相對長度、臂比等[10]，確定染色體核型[11]。

1.2.2花粉母細胞減數(shù)分裂觀察

采用改良苯酚品紅染色法，取套袋兩性株0.5 mm左右的花蕾，蒸餾水沖洗2～3次，在卡諾氏固定液Ⅰ中固定24 h，然后轉(zhuǎn)移到70%酒精中于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?%醋酸洋紅解剖制片，改良石炭酸品紅復(fù)染，酒精燈上微烤后壓片。對85個處于中期Ⅰ的細胞用Olympus BX 41顯微鏡觀察拍照并進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆筍兩性株的根尖有絲分裂

對50個中期分裂相好的細胞進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，蘆筍兩性株的染色體數(shù)目為20條，20條染色體中包括8條中部著絲粒染色體，分別是第6、7、9、10號染色體；12條近中部著絲粒染色體，分別是第1、2、3、4、5、8號染色體；其中第8號染色體帶有隨體。最短的染色體是第10號，相對長度為6.14%，最長的染色體是第1號，相對長度為16.42%，染色體的長度比為2.67，介于2∶1～4∶1之間；臂比大于2∶1染色體占比為30%，介于1%～50%之間，核型屬于2 B型，核型公式為2 n=2 x=8 m+12 sm(2 SAT)(表1、圖2、圖3)。

注：A為棒狀二價體和環(huán)狀二價體；B為全部為環(huán)狀二價體；C為中期Ⅰ，箭頭示小環(huán)狀二價體；D為中期Ⅰ，箭頭示配對不完全的二價體；E為中期Ⅰ，箭頭示染色體粘連；F為中期Ⅰ，箭頭示環(huán)狀四價體；G為落后染色體-箭頭示；H為染色體橋-箭頭示。圖4 蘆筍兩性株花粉母細胞減數(shù)分裂Fig.4 The meiosis of pollen mother cells of andromonoecious plants of Asparagus officinalis L.

表1 蘆筍兩性株的核型參數(shù)Table 1 Karyotype parameters of andromonoecious plants of Asparagus officinalis L.

2.2 蘆筍兩性株的花粉母細胞減數(shù)分裂

對85個花粉母細胞減數(shù)分裂中期Ⅰ觀察結(jié)果顯示，所有細胞中，中期Ⅰ同源染色體配對過程中二價體出現(xiàn)的比例為97.65%，四價體為2.35%；二價體中96.39%是棒狀二價體和環(huán)狀二價體共存，6.02%為環(huán)狀二價體；減數(shù)分裂過程中有50%的細胞均存在一對較小的環(huán)狀二價體；中期Ⅰ出現(xiàn)了配對不完全的二價體和染色體粘連的現(xiàn)象。在由中期Ⅰ向后期Ⅰ轉(zhuǎn)變的過程中出現(xiàn)了落后染色體和染色體橋(圖4)。

圖3 蘆筍兩性株的核型模式Fig.3 Karyotype models of andromonoecious plants of Asparagus officinalis L.

3 討 論

本研究觀察到蘆筍兩性株體細胞染色體數(shù)目和花粉母細胞染色體數(shù)目均為2 n=2 x=20，這與林俊芳,莊偉建[12]，周勁松等[14]的研究結(jié)果一致，但隨體的位置及數(shù)量、染色體臂比、核型類型存在差異[12-14]。分析原因，一是在蘆筍進化早期，性別決定并未發(fā)生，此時具有兩性特征，當雄花的雌性器官或者雌花的雄性器官停滯發(fā)育時，此時由兩性逐漸向單性分化，由于發(fā)育階段的不同致使體細胞有絲分裂出現(xiàn)了不同；二是取材位置不同，先前的研究試材都是生長旺盛的莖尖，本研究的試材是兩性株當年生的白色根尖。

國內(nèi)外對蘆筍兩性株的花粉母細胞減數(shù)分裂研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)，花粉母細胞減數(shù)分裂中期Ⅰ出現(xiàn)了棒狀和環(huán)狀的構(gòu)型，環(huán)狀四價體出現(xiàn)的頻率為2.35%，在觀察的細胞中有一半存在一對較小的環(huán)狀二價體。觀察到絕大多數(shù)蘆筍兩性株花粉母細胞減數(shù)分裂中染色體的行為正常，在少數(shù)的花粉母細胞減數(shù)分裂中出現(xiàn)了配對不完全的二價體、染色體粘連、落后染色體及染色體橋等異常行為，異常行為的出現(xiàn)可能導(dǎo)致蘆筍兩性株一部分花粉敗育而不結(jié)實。分析原因，除了兩性株與普通蘆筍群體在進化上有一定差異及兩性株花藥自身發(fā)育的情況外，可能在取材時外界環(huán)境干擾了不同材料的正常發(fā)育，導(dǎo)致不同的減數(shù)分裂現(xiàn)象出現(xiàn)。隨著染色體分帶、熒光原位雜交及各種分子技術(shù)的出現(xiàn)，蘆筍兩性株染色體配對研究的準確率大大提高。