毛蕊花糖苷抑制2型豬鏈球菌的溶血素蛋白活性而降低其小鼠致病性

詹佳飛， 徐 魁， 張 磊， 夏介英， 洪 楊， 董 涵， 劉洋露， 周 靜， 袁明銘， 王永金， 鄢良春，*

(1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院 實驗動物中心，四川 成都 610041； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130)

豬鏈球菌(，)是一種呈世界范圍分布的革蘭氏陽性菌，人和牲畜(尤其是豬)感染后通常會引發(fā)腦膜炎、敗血癥及關(guān)節(jié)炎等臨床癥狀，給人畜的生命健康帶來嚴重威脅，同時給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。根據(jù)莢膜抗原的差異，豬鏈球菌可被分為35種血清型(1～34及1/2)，其中屬2型豬鏈球菌(serotype 2， SS2)的毒力最強，且流行范圍最廣。目前由于長期使用青霉素、阿莫西林、氨芐西林等抗生素，豬鏈球菌的耐藥性日益加重，因此，尋求更加安全有效的辦法抵抗豬鏈球菌感染已是當(dāng)務(wù)之急。

豬鏈球菌在感染宿主過程中可分泌多種毒力因子，研究表明，毒力因子對豬鏈球菌的生長雖無必要，但卻與豬鏈球菌的致病性強弱密切相關(guān)。溶血素(suilysin， SLY)是豬鏈球菌一種重要的毒力相關(guān)因子，被認為是豬鏈球菌的毒力標志物。SLY與細菌的溶血活性有重要關(guān)系，對人、豬、雞及鼠等動物的紅細胞均表現(xiàn)出很強的溶血活性，可溶解紅細胞釋放血紅蛋白。SLY屬于膽固醇依賴性細胞裂解素家族(cholesterol dependent cytolysins， CDCs)，由4個結(jié)構(gòu)域組成。當(dāng)SLY被細菌釋放后，SLY的第4結(jié)構(gòu)域最先特異性識別并結(jié)合宿主細胞膜上的膽固醇。與細胞膜結(jié)合后的SLY單體通過構(gòu)象改變發(fā)生寡聚形成成孔前體，隨后第3結(jié)構(gòu)域的兩個β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)(TMH1、TMH2)插入細胞膜形成β-桶樣跨膜結(jié)構(gòu)，從而在細胞膜上形成親水性孔道，最終引起細胞裂解直至死亡。Takeuchi等認為在感染過程中SLY高分泌的豬鏈球菌菌株比SLY低分泌的菌株具有更強的毒性及侵襲力。將基因缺失后，缺失株的毒力顯著下降，幾乎不造成感染小鼠死亡。此外，在轉(zhuǎn)錄水平通過上調(diào)基因可增強豬鏈球菌的毒力。因此，靶向溶血素SLY的抗毒力因子策略為治療豬鏈球菌感染提供了一種新的思路。

毛蕊花糖苷(verbascoside，VBS)又被稱為類葉升麻苷，是一種苯乙醇苷類化合物，主要存在于連翹、肉蓯蓉、洋丁香、車前草及綠豆等多種植物中，單體經(jīng)機體攝入后能快速吸收發(fā)揮生理作用，例如抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化等。目前已有研究表明，連翹中的VBS可對金黃色葡萄球菌(，)產(chǎn)生中等強度的抑制作用。因此，本研究擬將毛蕊花糖苷作用于2型豬鏈球菌，探討該藥物對2型豬鏈球菌致病力的影響及其機制研究，為臨床上治療2型豬鏈球菌病提供一個新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所需2型豬鏈球菌菌株SC21由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物中心提供；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)、小牛血清、二甲基亞砜(DMSO)及雞紅細胞均購自索萊寶(北京)有限公司；鼠源GFP抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；HRP標記的羊抗鼠IgG抗體購自武漢博士德有限公司；毛蕊花糖苷(純度>98%)購自成都普思生物科技股份有限公司，利用DMSO將毛蕊花糖苷稀釋為20 480 μg·mL，于-20 ℃環(huán)境下避光儲存?zhèn)溆?；雌性C57 BL/6J小鼠(7周齡)購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 測定最低抑菌濃度(MIC)試驗

將凍存的2型豬鏈球菌菌株SC21按1∶50接種于新鮮的TSB培養(yǎng)基(添加5%小牛血清)中，在搖床內(nèi)37 ℃振蕩(220 r·min)培養(yǎng)10 h，于4 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

毛蕊花糖苷對2型豬鏈球菌MIC的測定以“美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)抗菌藥物敏感性實驗執(zhí)行標準”為依據(jù)。具體方法如下，將毛蕊花糖苷儲存液按0.5～2 048 μg·mL的濃度梯度稀釋，并依次加到等量分裝的2型豬鏈球菌中使菌液濃度均為5×10CFU·mL。另外分別設(shè)置陽性對照和陰性對照，其中陽性對照中不加入藥物只加等量細菌重懸液，陰性對照中只加入高壓滅菌的TSB培養(yǎng)液(添加5%小牛血清)。將處理好的培養(yǎng)物放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，每隔12 h觀察一次細菌生長情況。以培養(yǎng)物呈現(xiàn)透明狀態(tài)，沒有肉眼可見細菌生長為標準，該藥物濃度即為最低抑菌濃度。

1.2.2 2型豬鏈球菌生長曲線的繪制

將2型豬鏈球菌菌液接種到TSB培養(yǎng)液(添加5%小牛血清)中振蕩培養(yǎng)至菌液為0.3。將菌液等量分裝并依次加入不同劑量的毛蕊花糖苷儲存液，使培養(yǎng)物中藥物終濃度分別達到0、0.5、1、2、4、8、16、32及64 μg·mL。將培養(yǎng)物放入搖床內(nèi)繼續(xù)振蕩6 h并每隔30 min測一次菌液吸光度。

1.2.3 毛蕊花糖苷對2型豬鏈球菌溶血活性的測定

在約為0.3的2型鏈球菌菌液中加入不同劑量的毛蕊花糖苷使藥物濃度梯度稀釋(0、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg·mL)。將培養(yǎng)物振蕩培養(yǎng)12 h后離心(12 000×，2 min)并收集培養(yǎng)物上清。將25 μL雞紅細胞(4%)、100 μL上述培養(yǎng)物上清及875 μL PBS緩沖液輕柔混勻并放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。將孵育后的混合物低速離心(3 000×，5 min)獲取混合物上清并測定其吸光度。另外利用1% Triton X-100和PBS緩沖液分別作為陽性對照和陰性對照。

1.2.4 免疫印跡試驗

參照1.2.3節(jié)試驗步驟，收集2型豬鏈球菌與毛蕊花糖苷(0～64 μg·mL)共同培養(yǎng)體系的上清。參照之前研究的操作步驟，在收集的上清中分別加入等量純化的GFP蛋白(本實驗室前期已制備)作為內(nèi)參對照。在20 μL上清中加入4 μL 6×上樣緩沖液混勻并加熱煮沸8 min，離心(12 000×，2 min)取其上清進行12% SDS-PAGE凝膠電泳。將凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h后，分別加入1∶1 000的鼠源SLY一抗(本實驗室前期已制備)及1∶2 000的鼠源GFP一抗4 ℃孵育過夜。經(jīng)洗滌后，加入1∶2 000以HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗常溫孵育2 h，最后使用化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)進行顯色觀察。

1.2.5 分子模擬對接

在PDB在線軟件() 中下載SLY蛋白(代碼： 3HVN)三維結(jié)構(gòu)，PubChem在線軟件(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)可下載毛蕊花糖苷小分子(代碼： 5281800)的二維和三維結(jié)構(gòu)。利用AutoDock Vina 1.5.6軟件對SLY及VBS進行半柔性對接。在對接過程中毛蕊花糖苷所有扭轉(zhuǎn)鍵均可自由旋轉(zhuǎn)，SLY蛋白則保持剛性結(jié)構(gòu)。

1.2.6 SLY蛋白的表達及純化

以除去信號肽及終止密碼子的基因序列(GenBank： AY341263.1)為模板設(shè)計引物(上游5′-GATTCCAAACAAGATATTAATCA-3′，酶切位點為H Ⅰ；下游5′-TACTCTATCACCTCATCCGCAT-3′，酶切位點為d Ⅲ)。從cDNA中擴增出序列，將擴增產(chǎn)物連接到pCold-I質(zhì)粒上并轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21中，37 ℃條件下利用1 mmol·LIPTG誘導(dǎo)表達8 h，離心(12 000×，2 min)收集菌體沉淀，用超聲破碎儀超聲裂解重組菌。利用Ni親和層析的方法對重組蛋白進行純化，且純化后的蛋白質(zhì)濃度用BCA蛋白試劑盒進行測定。

1.2.7 毛蕊花糖苷對SLY蛋白溶血活性的測定

將100 μL純化后的SLY重組蛋白與毛蕊花糖苷均勻混合使藥物終濃度梯度稀釋(0、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg·mL)，將培養(yǎng)物置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。之后將25 μL的雞紅細胞(4%)、100 μL上述培養(yǎng)物及875 μL PBS緩沖液混勻繼續(xù)在37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h后，低速離心(3 000×，5 min)獲取上清并測定其。此外利用1% Triton X-100和PBS緩沖液分別作為陽性對照和陰性對照。

1.2.8 小鼠體內(nèi)感染試驗

將2型豬鏈球菌菌液培養(yǎng)至約為0.8時低速離心(3 000×，5 min)收集菌體，利用無菌PBS反復(fù)清洗菌體3次并重懸菌體使其濃度保持于5.6×10CFU·mL。將雌性C57 BL/6J 小鼠隨機分為3組，每組10只，分別為SC21+VBS組、SC21+DMSO組、PBS+VBS組。對實驗組小鼠腹腔注射500 μL上述細菌重懸液，對照組小鼠腹腔注射500 μL PBS。豬鏈球菌感染小鼠2 h后，皮下注射100 mg·kg毛蕊花糖苷，并隔8 h再次給藥，連續(xù)觀察72 h并每隔12 h統(tǒng)計一次小鼠死亡率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均進行了3次重復(fù)。軟件GraphPad Prism 8.0被用來進行實驗數(shù)據(jù)分析，平均值±標準差表示最終結(jié)果，Student’s-test 方法分析組間數(shù)值的統(tǒng)計學(xué)差異。* 表示差異顯著(<0.05)，**表示差異極顯著(<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛蕊花糖苷對2型豬鏈球菌生長活性的影響

試驗結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷對2型豬鏈球菌的最低抑菌濃度高達1 024 μg·mL。此外，當(dāng)不同濃度的毛蕊花糖苷(0～64 μg·mL)作用2型豬鏈球菌6 h后，菌液近乎相同，由此可見在最低抑菌濃度范圍內(nèi)毛蕊花糖苷并不會抑制2型豬鏈球菌的生長活性(圖1)。

2.2 毛蕊花糖苷對2型豬鏈球菌溶血活性的抑制作用

如圖2所示，當(dāng)沒有毛蕊花糖苷作用時豬鏈球菌菌液上清的溶血活性為77.97%。隨著藥物濃度的增加，上清溶血活性呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，其中當(dāng)藥物濃度為64 μg·mL時，上清溶血活性已降至5.24%。試驗結(jié)果表明，較低濃度的毛蕊花糖苷即可抑制2型豬鏈球菌的溶血活性，且其溶血活性與藥物的作用濃度呈負相關(guān)關(guān)系。

圖1 在不同濃度毛蕊花糖苷作用下2型豬鏈球菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of SS2 treated with different concentrations of VBS

NC， 陰性對照。*表示與未添加毛蕊花糖苷組差異顯著 (P<0.05)，**表示與未添加毛蕊花糖苷組差異極顯著 (P<0.01)。下同。NC， Negative control. * meaned significant difference compared with VBS-free group (P<0.05), ** meaned extremely significant difference compared with VBS-free group (P<0.01). The same as below.圖2 毛蕊花糖苷與2型豬鏈球菌共同培養(yǎng)體系中上清的溶血活性Fig.2 Hemolytic activity in supernatant of VBS and SS2 co-culture system

2.3 毛蕊花糖苷對2型豬鏈球菌分泌SLY蛋白的影響

免疫印跡結(jié)果表明，經(jīng)過不同濃度的毛蕊花糖苷處理后，豬鏈球菌菌液上清中的SLY蛋白分泌量沒有明顯區(qū)別，可見毛蕊花糖苷對2型豬鏈球菌分泌SLY蛋白沒有影響(圖3)。

2.4 毛蕊花糖苷與SLY蛋白相互結(jié)合分析

經(jīng)分子模擬對接試驗預(yù)測，毛蕊花糖苷主要結(jié)合于SLY蛋白的第4結(jié)構(gòu)域，其中藥物苯環(huán)中的羥基可與SLY蛋白2個氨基酸殘基SER-388及GLN-441形成3條氫鍵相互作用，距離分別為2.1、2.4和2.6 nm，該結(jié)果表明，毛蕊花糖苷與SLY蛋白具有較高的結(jié)構(gòu)親和力(圖4)。

圖3 毛蕊花糖苷與2型豬鏈球菌共同培養(yǎng)體系中上清的SLY分泌量Fig.3 Expression of SLY in supernatant of VBS and SS2 co-culture system

2.5 SLY重組蛋白的表達與純化

經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，在C端添加了6個組氨酸標簽的SLY蛋白被成功原核表達。經(jīng)純化后SLY重組蛋白顯示為單一條帶，大小約為50 ku，符合預(yù)期蛋白大小。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定重組蛋白為1 μg·μL(圖5)。

A，毛蕊花糖苷二維化學(xué)結(jié)構(gòu)；B，毛蕊花糖苷三維化學(xué)結(jié)構(gòu)；C， 毛蕊花糖苷的羥基與SLY殘基結(jié)合細節(jié)。A， 2D chemical structure of VBS； B， 3D chemical structure of VBS； C， Details of binding between the hydroxyl group of VBS and the residues of SLY.圖4 毛蕊花糖苷與SLY蛋白的分子對接構(gòu)象Fig.4 The molecular docking conformation of VBS with SLY

M， 蛋白質(zhì)分子量標準；1，加IPTG誘導(dǎo)大腸埃希菌BL21表達SLY重組蛋白；2，純化后的SLY重組蛋白。M， Protein molecular weight marker； 1， Lysate of IPTG-induced E.coil BL21 expressing recombinant SLY； 2， Purified recombinant SLY.圖5 SLY重組蛋白的表達及純化Fig.5 Expression and purification of recombinant SLY

2.6 毛蕊花糖苷對SLY蛋白溶血活性的抑制作用

將不同濃度的毛蕊花糖苷直接作用純化的SLY蛋白后，結(jié)果顯示，SLY蛋白介導(dǎo)的溶血活性隨藥物濃度的增加呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。其中16 μg·mL的毛蕊花糖苷便可將SLY溶血活性降至41.31%，顯著地抑制了SLY蛋白活性(圖6)。

2.7 毛蕊花糖苷對2型豬鏈球菌致病力的影響

為了進一步探究毛蕊花糖苷是否具有降低2型豬鏈球菌毒力的功效，本研究將豬鏈球菌作用于小鼠。結(jié)果顯示，SS2+DMSO組小鼠經(jīng)豬鏈球菌感染后在72 h內(nèi)全部死亡，但是感染后給予毛蕊花糖苷的SS2+VBS組小鼠死亡率下降至70%，且明顯延緩了小鼠的死亡時間，提高了小鼠的存活率，這表明毛蕊花糖苷可有效降低豬鏈球菌對小鼠的致病性(圖7)。

圖6 毛蕊花糖苷對純化后SLY溶血活性的作用Fig.6 Effect of VBS on the hemolytic activity of purified SLY

圖7 毛蕊花糖苷對2型豬鏈球菌感染小鼠存活率的影響Fig.7 Effect of VBS on the survival rate of mice infected with SS2

3 討論

目前臨床上主要采用抗生素對豬鏈球菌進行治療，抗生素主要以致病菌生存所必需的成分(DNA、蛋白質(zhì)和細胞膜等)為靶標來達到殺菌的作用。雖然該方法可以有效清除病原菌，但是長期使用甚至濫用抗生素會給予細菌更多的生存選擇壓力進而使細菌耐藥性加重。研究表明，病原菌的毒力因子是其致病環(huán)節(jié)中的重要一員，而與細菌毒力相關(guān)的基因或蛋白通常并不是致病菌生存所必需的。因此，抗毒力策略在有效降低致病菌對機體感染的基礎(chǔ)上，對細菌生存選擇壓力較小，細菌不易產(chǎn)生耐藥性，且該策略能給機體更多的時間通過自身免疫系統(tǒng)阻礙細菌感染。SLY作為2型豬鏈球菌重要的毒力相關(guān)因子，可通過降低其活性抵抗豬鏈球菌的感染。因此，SLY成為抑制2型豬鏈球菌感染的理想靶點。

在我國，針對細菌性傳染病，中藥及其化合物有著獨特的治療體系及顯著的治療效果。通過臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，和傳統(tǒng)抗菌藥物相比，中藥及其化合物使用更加安全，對病原菌的生存壓力更小，不易誘導(dǎo)耐藥性的產(chǎn)生和發(fā)展。在本研究中，我們將單體化合物——毛蕊花糖苷作用于2型豬鏈球菌，發(fā)現(xiàn)藥物在幾乎不影響豬鏈球菌生長活性的基礎(chǔ)上，可有效抑制其溶血活性。研究表明，豬鏈球菌的溶血活性主要通過SLY介導(dǎo)，故毛蕊花糖苷作用2型豬鏈球菌導(dǎo)致該病原菌溶血活性下降可能是其抑制了豬鏈球菌分泌SLY的過程，也可能是藥物通過直接作用SLY蛋白導(dǎo)致其失去活性。為驗證上述假設(shè)，本研究首先通過免疫印跡試驗證實毛蕊花糖苷對豬鏈球菌的SLY分泌量幾乎沒有影響。其次，我們采用了分子對接的方式探索毛蕊花糖苷與SLY蛋白分子結(jié)構(gòu)間的相互作用。分子對接是藥物研發(fā)的新手段和新途徑，具有高效、快速、經(jīng)濟等優(yōu)勢，已在藥品研發(fā)過程中發(fā)揮了巨大的作用。目前已有不少中藥單體被證實可靶向SLY蛋白抑制其溶血活性。經(jīng)分子對接分析，桑色素可與SLY的第2結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合發(fā)揮作用，楊梅素主要結(jié)合于SLY第2及第3結(jié)構(gòu)域的間隙，而白皮杉醇則可嵌入蛋白第2及第4結(jié)構(gòu)域之間的聯(lián)合區(qū)域。雖然結(jié)合位點不同，這些藥物卻均可改變SLY蛋白單體構(gòu)象阻止其寡聚化，從而降低蛋白對宿主細胞膜的破壞。由此可見，SLY的生物活性功能與其空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，空間結(jié)構(gòu)的變化會直接導(dǎo)致其生物功能的降低或喪失。與之前研究所報道的藥物結(jié)合區(qū)域不同，本次分子對接結(jié)果表明毛蕊花糖苷可與SLY蛋白殘基結(jié)合從而嵌入SLY的第4結(jié)構(gòu)域。因此，我們推測毛蕊花糖苷結(jié)合SLY第4結(jié)構(gòu)域后改變了蛋白的原有結(jié)構(gòu)使其功能最終發(fā)生變化。體外紅細胞溶血試驗進一步證實了毛蕊花糖苷可直接抑制SLY蛋白介導(dǎo)的溶血活性。

此外，體內(nèi)研究顯示，經(jīng)毛蕊花糖苷治療后感染小鼠的死亡率降低，存活狀況得到明顯改善，這一結(jié)果直接表明毛蕊花糖苷可以降低豬鏈球菌致病力。但我們發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷對感染小鼠尚未達到完全保護的效果，造成這一現(xiàn)象的原因可能在于除SLY之外，豬鏈球菌還會產(chǎn)生許多與其致病性相關(guān)的毒力因子，例如肽聚糖(peptidoglycan， PG)、莢膜多糖(capsular polysaccharide， CPS)、溶菌酶釋放蛋白(muramidase-released protein， MRP)和細胞外蛋白因子(extracellular， EF)等，它們均參與了鏈球菌侵襲宿主的過程。本研究中毛蕊花糖苷雖抑制了SLY的溶血活性，但是其他毒力因子可能仍在發(fā)揮作用，從而導(dǎo)致毛蕊花糖苷無法完全消除鏈球菌對小鼠的致病性。因此開發(fā)對抗2型豬鏈球菌多種毒力因子的聯(lián)合用藥應(yīng)成為下一步的研究重點。

CDCs家族目前已知包含了40余種成員，其中SLY、肺炎鏈球菌溶血素(pneumolysin， PLY)、產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素(perfringolysin， PFO)、單增李斯特菌溶血素(listeriolysin， LLO)及化膿鏈球菌溶血素(streptolysin O， SLO)等蛋白成員氨基酸序列多處相近甚至相同，且具有高度相似的三級結(jié)構(gòu)。同時該家族大多成員與SLY的致病機制相同，即在宿主靶細胞膜上形成孔洞破壞其完整性。目前毛蕊花糖苷已被證實可結(jié)合在PLY的第3及第4結(jié)構(gòu)域的間隙，通過改變PLY空間構(gòu)象抑制其溶血活性，從而降低肺炎鏈球菌(， pneumococcus)對小鼠的致病力。結(jié)合本次研究結(jié)果，我們猜測毛蕊花糖苷可能是一種廣譜抗CDCs溶血活性的天然化合物，對CDCs家族其他成員的溶血活性也有抑制作用，之后我們將對這一猜想繼續(xù)進行驗證。

4 結(jié)論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷不會影響2型豬鏈球菌的生長活性，但是該藥物可對該病原菌產(chǎn)生的SLY活性產(chǎn)生顯著的抑制作用。同時，毛蕊花糖苷可明顯降低2型豬鏈球菌對小鼠的致病性，起到保護機體的作用。本研究結(jié)果表明，毛蕊花糖苷是一種潛在的SLY蛋白活性抑制劑，為后續(xù)臨床開發(fā)抗2型豬鏈球菌的新藥提供了一定的理論基礎(chǔ)。