銅藻中巖藻黃質(zhì)提取及分離純化工藝研究

陳雅鑫，何裊裊，蔡樹蕓，楊 婷，陳 暉，張 怡，洪 專, ，張怡評(píng),

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350001；2.自然資源部第三海洋研究所，海洋生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心，福建廈門 361005）

銅藻（）又名丁香屋、草茜、竹茜菜，屬褐藻門（Phaeophyta）馬尾藻科（Sargassaceae），是北太平洋西部特有的暖溫帶海藻，主要分布于我國(guó)沿海省份如遼寧、浙江、福建及廣東等地。銅藻作為一種常見經(jīng)濟(jì)褐藻，是海藻場(chǎng)構(gòu)建的主要褐藻之一，具有較高生態(tài)價(jià)值，常被稱為“海中森林”、“海洋牧場(chǎng)”。目前，銅藻主要作為藻膠工業(yè)的重要原料，被廣泛應(yīng)用到醫(yī)學(xué)、食品、飼料和有機(jī)肥料方面。現(xiàn)如今我國(guó)關(guān)于銅藻的研究仍局限于多糖類如褐藻酸、褐藻淀粉和褐藻糖膠等成分，而對(duì)于其他具有生物活性的化學(xué)成分的研究還較少，造成銅藻資源未能得到充分利用。

巖藻黃質(zhì)（Fucoxanthin，F(xiàn)X）亦被稱為褐藻黃素、巖藻黃素，是海洋中第二大類胡蘿卜素，主要分布在褐藻中，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、減肥、降血糖等作用，在保健食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景，具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值?，F(xiàn)已有報(bào)道稱銅藻中巖藻黃質(zhì)含量較高，可作為提取巖藻黃質(zhì)的優(yōu)良原料。目前，國(guó)內(nèi)大多關(guān)注于海帶（）、裙帶菜（）、羊棲菜（）中巖藻黃質(zhì)的提取工藝，對(duì)銅藻中巖藻黃質(zhì)的提取純化工藝的報(bào)道很少，以銅藻鮮藻作為原料進(jìn)行提取更為少見，且傳統(tǒng)有機(jī)溶劑浸提方法提取時(shí)間長(zhǎng)、溶劑消耗多、提取成本高；超聲輔助提取法常應(yīng)用于植物中活性成分的提取，其原理是利用超聲波產(chǎn)生空化效應(yīng)來加速植物細(xì)胞中活性成分的溶出，具有提取時(shí)間短、溫度低、安全性高等優(yōu)點(diǎn)。此外，大孔吸附樹脂層析法是初步純化最常用的方法，但尚無其對(duì)巖藻黃質(zhì)吸附與解析的動(dòng)力學(xué)研究，缺乏大孔吸附樹脂應(yīng)用在巖藻黃質(zhì)分離純化的相關(guān)理論依據(jù)。

基于此，本研究以新鮮銅藻為原料，采用超聲輔助有機(jī)溶劑萃取法提取，并對(duì)巖藻黃質(zhì)的提取工藝進(jìn)行單因素與響應(yīng)面優(yōu)化，隨后采用6 種不同大孔吸附樹脂純化巖藻黃質(zhì)，通過靜態(tài)吸附與解析動(dòng)力學(xué)研究，以及動(dòng)態(tài)吸附與解析研究篩選出最優(yōu)性能的大孔吸附樹脂，建立巖藻黃質(zhì)大孔吸附柱層析最佳分離工藝。本研究可為銅藻資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供重要的理論基礎(chǔ)，也為巖藻黃質(zhì)的提取純化提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮銅藻 福建泉州海域，經(jīng)自然資源部第三海洋研究所王初生鑒定為銅藻；大孔吸附樹脂D101、AB-8 安徽三星樹脂科技有限公司；KP20、HPD750、KP670 廈門科譜儀器設(shè)備有限公司；PS30 北京德易科技有限責(zé)任公司；甲醇（色譜純）、乙醇（分析純） 西隴化工有限公司；巖藻黃素標(biāo)品純度99.53%，本實(shí)驗(yàn)室自制。

FS400 多功能粉碎機(jī) 江蘇常州機(jī)械設(shè)備有限公司；KQ-500E 超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；LC-2010AD 高效液相色譜儀 日本島津公司；HZ-9212SB 水浴恒溫振蕩器 太倉市華利達(dá)設(shè)備有限公司；Hei-VAP Expert 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 銅藻巖藻黃質(zhì)提取工藝 新鮮的銅藻用自來水清洗，紗布過濾去除多余的水分，瀝干后的銅藻首先用藥用鍘刀進(jìn)行初步剪碎，再用多功能粉碎機(jī)粉碎至長(zhǎng)度約5～8 mm。參照王樂等的方法并做適當(dāng)調(diào)整：精確稱取一定量的絞碎銅藻，按照一定濃度的乙醇溶液與一定液料比均勻混合，在超聲功率為500 W 下超聲一定時(shí)間，重復(fù)提取一定次數(shù)。提取結(jié)束后，使用離心機(jī)在8000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心5 min。取上清液，得到巖藻黃質(zhì)粗提取液。吸取1 mL 粗提取液過0.22 μm 濾膜，通過HPLC 測(cè)定其峰面積，計(jì)算銅藻提取液中巖藻黃質(zhì)得率。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 不同乙醇濃度的影響 取5 g 處理過的銅藻各5 份，分別加入150 mL 不同乙醇濃度（v/v：60%、70%、80%、90%及100%）的水溶液，在超聲功率為500 W 下提取20 min，過濾，測(cè)定?？疾觳煌掖紳舛葘?duì)巖藻黃質(zhì)提取得率的影響。

1.2.2.2 超聲時(shí)間的影響 取5 g 處理過的銅藻各5 份，各加入90%乙醇水溶液150 mL，在超聲功率為500 W 下超聲分別提取10、20、30、40、50 min，過濾，測(cè)定。考察不同提取時(shí)間對(duì)巖藻黃質(zhì)提取得率的影響。

1.2.2.3 液料比的影響 取5 g 處理過的銅藻各5 份，分別加入10、20、30、40、50 倍量的90%乙醇水溶液進(jìn)行超聲提取20 min（超聲功率為500 W），過濾，測(cè)定。考察不同液料比對(duì)巖藻黃質(zhì)提取得率的影響。

1.2.2.4 提取次數(shù)的影響 取5 g 處理過的銅藻各3 份，加入150 mL 90%乙醇水溶液，在超聲功率為500 W 下超聲提取20 min，過濾，測(cè)定，同法提取第二、三次?？疾觳煌崛〈螖?shù)對(duì)巖藻黃質(zhì)提取得率的影響。

1.2.3 巖藻黃質(zhì)提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮各因素影響，選取乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲時(shí)間（C）為自變量，以巖藻黃質(zhì)提取得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析軟件DesignExpert 8.0 所提供的Box-Behnken 模型對(duì)巖藻黃質(zhì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平的取值見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.4 高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)與巖藻黃質(zhì)提取得率計(jì)算 用HPLC 檢測(cè)巖藻黃質(zhì)含量。色譜條件：色譜柱Shim－pack VP－ODS C（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相為甲醇-水溶液（92:8）；流速設(shè)定1.0 mL·min；檢測(cè)波長(zhǎng)取450 nm，進(jìn)樣量為10 μL。將不同質(zhì)量濃度的巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液過0.22 μm 濾膜后進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度和峰面積分別為橫、縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=46.84X+259.71（=0.9998），將樣品在保留時(shí)間相同的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算巖藻黃質(zhì)含量，之后按照以下公式計(jì)算樣品中巖藻黃質(zhì)提取得率：

1.2.5 巖藻黃質(zhì)分離純化工藝 考慮到適合工廠化生產(chǎn)，本實(shí)驗(yàn)考慮采用大孔吸附樹脂吸附-乙醇洗脫體系。

1.2.5.1 大孔吸附樹脂及粗提液的預(yù)處理 取大孔吸附樹脂（KP20、D101、AB-8、HPD750、KP670、PS30）用乙醇室溫下密封浸泡24 h，用水洗至中性備用（長(zhǎng)時(shí)間不用的話，用乙醇密封浸泡）。取一定體積的銅藻粗提液置于旋蒸瓶中，在38 ℃下減壓濃縮，除去部分乙醇（約占70%）后停止?jié)饪s，測(cè)定其巖藻黃質(zhì)含量為84 μg/mL，將巖藻黃質(zhì)提取濃縮液置于4 ℃密封避光保存。

1.2.5.2 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附與解析動(dòng)力學(xué)稱取經(jīng)過預(yù)處理的上述6 種吸附樹脂各5 g 置于100 mL 三角瓶中，各加25 mL 巖藻黃質(zhì)提取濃縮溶液（84 μg/mL），加入25 mL 的水，水浴搖床（轉(zhuǎn)速為200 r/min）在25 ℃下振搖吸附，每隔一段時(shí)間后，測(cè)定濾液中的巖藻黃質(zhì)濃度。吸附2 h 后，取吸附巖藻黃質(zhì)后的樹脂用超純水清洗后，置于100 mL 的三角瓶中，加入95%的乙醇溶液50 mL，置于水浴搖床25 ℃下振搖解析，每隔一段時(shí)間后測(cè)定解析液中巖藻黃質(zhì)濃度。根據(jù)樹脂的吸附能力和解析率對(duì)其進(jìn)行預(yù)選。根據(jù)以下公式計(jì)算樹脂的吸附容量、吸附率和解析率：

其中Q代表吸附平衡時(shí)的吸附容量（mg/g 濕樹脂），A 代表吸附率（%），D 代表解析率（%），C和C是溶液中巖藻黃質(zhì)的初始濃度和平衡濃度（mg/L），V為初始樣品溶液的體積（L），W 是測(cè)試的濕樹脂的重量（g），V是解析溶液的體積（L），C代表解析溶液中巖藻黃質(zhì)的濃度（mg/L）。

分別采用兩種經(jīng)典吸附動(dòng)力學(xué)方程對(duì)大孔樹脂吸附動(dòng)力學(xué)進(jìn)行擬合，公式如下：

擬一階動(dòng)力學(xué)方程：

擬二階動(dòng)力學(xué)方程：

式中k為準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程常數(shù)（min）；k為準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程常數(shù)（mg/（g·min））；Q為吸附平衡時(shí)樹脂吸附量（mg/g 濕樹脂）；Q為t 時(shí)刻樹脂吸附量（mg/g 濕樹脂）；t 為吸附時(shí)間（min）。

1.2.5.3 大孔吸附樹脂的動(dòng)態(tài)吸附與解析 取2.5 cm×30 cm 的樹脂層析柱，分別裝上KP670、KP20 樹脂各40 g，用2 倍柱體積乙醇洗脫，后用水洗凈，將乙醇濃度為25%的提取濃縮液（88.03 μg/mL），以1.0 mL/min 加入樹脂柱中，流出液每20 mL 收集一份，按“1.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定巖藻黃質(zhì)含量。當(dāng)流出液濃度為上樣液濃度的5%時(shí)，到達(dá)最大上樣量（泄露點(diǎn)），停止上樣吸附，此時(shí)為最佳上樣容積。并分別繪制KP670 和KP20 樹脂的泄露曲線。依次采用3 倍柱體積的水，30%乙醇，60%乙醇除雜，然后95%乙醇洗脫，主要收集該部分洗脫液（橙紅色色帶），進(jìn)行巖藻黃質(zhì)含量檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，利用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)各影響因素進(jìn)行ANOVA 統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析，繪出3D 曲面圖，考察各影響因素對(duì)銅藻提取巖藻黃質(zhì)提取得率的影響。采用Origin 9.0 軟件進(jìn)行回歸分析，檢驗(yàn)回歸模型中各項(xiàng)的顯著性，去除非顯著項(xiàng)，確定簡(jiǎn)化動(dòng)力學(xué)擬合模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅藻提取巖藻黃質(zhì)單因素分析

2.1.1 乙醇濃度對(duì)銅藻中巖藻黃質(zhì)提取得率的影響

由圖1 可知，隨著乙醇濃度的增大，巖藻黃質(zhì)提取得率呈上升趨勢(shì)，到80%乙醇時(shí)得率有明顯提高，之后沒有明顯變化。這可能是因?yàn)?0%乙醇已能均勻與銅藻碎塊充分接觸，使巖藻黃質(zhì)的傳質(zhì)過程進(jìn)行完全，此時(shí)大部分巖藻黃質(zhì)已被提取出。因此選擇60%～100%的乙醇濃度進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖1 乙醇濃度對(duì)銅藻中巖藻黃質(zhì)提取得率的影響Fig.1 The effect of ethanol concentration on the extraction yield of fucoxanthin in Sargassum horneri

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)銅藻中巖藻黃質(zhì)提取得率的影響

由圖2 可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，銅藻中巖藻黃質(zhì)的提取得率緩慢增大，20 min 時(shí)達(dá)到最大值，之后提取得率不再增加，反而出現(xiàn)下降?？赡苁怯捎诙虝r(shí)間色素沒有完全溶出，原理是傳質(zhì)過程需要有足夠的時(shí)間達(dá)到平衡，時(shí)間太短，提取還沒有達(dá)到平衡；隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，巖藻黃質(zhì)全部被溶出；當(dāng)繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，巖藻黃質(zhì)因長(zhǎng)時(shí)間超聲的高功率作用下產(chǎn)生的熱量而遭受破壞，產(chǎn)生降解，導(dǎo)致提取得率減少。故超聲時(shí)間選擇10～30 min 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)銅藻中巖藻黃質(zhì)提取得率的影響Fig.2 The effect of ultrasound time on the extraction yield of fucoxanthin in Sargassum horneri

2.1.3 液料比對(duì)銅藻中巖藻黃質(zhì)提取得率的影響由圖3 可知，隨液料比的增大，巖藻黃質(zhì)提取得率慢慢提高，當(dāng)液料比為40：1 mL/g 時(shí)達(dá)到較大值，再加大液料比，提取液中巖藻黃質(zhì)基本不變。說明溶劑體積達(dá)到40：1 mL/g 時(shí)已幾乎可將巖藻黃質(zhì)完全溶出。其原理在于該提取屬于固一液萃取過程，化學(xué)位差（濃度差）是該過程的推動(dòng)力。當(dāng)浸提劑用量增加到一定程度，傳質(zhì)達(dá)到平衡后，被提取物溶出率不再增加，而僅僅是更加均勻的分布在溶劑中。因此，考慮到成本，液料比選擇20:1～40:1 mL/g 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 液料比對(duì)銅藻中巖藻黃質(zhì)提取得率的影響Fig.3 The effect of liquid-to-material ratio on the extraction yield of fucoxanthin in Sargassum horneri

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)銅藻中巖藻黃質(zhì)提取得率的影響

由圖4 可知第一次提取得率最高，為185.41 μg/g，第二次提取量明顯降低，為11.34 μg/g，到第三次提取則無巖藻黃質(zhì)?？傮w來說，第一次的提取得率已達(dá)到了總提取得率的94.23%，說明銅藻中巖藻黃質(zhì)已大部分被提取出?？紤]到提取次數(shù)增加，會(huì)增加提取劑消耗，且不利于后面蒸發(fā)溶劑進(jìn)行濃縮的操作，最終選擇提取一次即可。

圖4 提取次數(shù)對(duì)銅藻中巖藻黃質(zhì)提取得率的影響Fig.4 The effect of extraction times on the extraction yield of fucoxanthin in Sargassum horneri

2.2 巖藻黃質(zhì)提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化分析

綜合考慮各因素影響，選取乙醇濃度（A）、液料比（B）、超聲時(shí)間（C）做響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平的取值表見表1。

根據(jù)Box-Behnken 的原理，試驗(yàn)中對(duì)三因素各取三水平，設(shè)計(jì)了三因素三水平共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，并用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert 8.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

經(jīng)過ANOVA 方差分析，各因素經(jīng)過擬合后，得到回歸方程為：Y=206.19+17.30A+11.76B+5.44C-1.15AB-1.10AC-2.10BC-26.04A-6.14B-9.94C。方差分析結(jié)果見表3，可以看出模型的值＜0.0001，說明該二次多項(xiàng)式回歸方程模式達(dá)到了極顯著的水平，具有較高的可靠性。決定系數(shù)=0.9958，表明試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值高度相關(guān)，即響應(yīng)值的變化由99.58%來自于所選變量，且失擬項(xiàng)（0.5611＞0.05）不顯著，說明實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值有較好的擬合度。由值可得，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響大小順序?yàn)椋篈（乙醇濃度）＞B（液料比）＞C（超聲時(shí)間）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

綜上所述，試驗(yàn)所建立的數(shù)學(xué)回歸模型擬合度較高，可以較好地反映各因素與響應(yīng)值間的真實(shí)關(guān)系。因此，可以用該數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)銅藻中巖藻黃質(zhì)的提取工藝條件。

為了更好地對(duì)結(jié)果進(jìn)行理解與分析，利用Design Expert 軟件繪制了響應(yīng)面的三維圖和等高線圖，以研究各因素交互作用（AB、AC、BC）對(duì)因變量（巖藻黃質(zhì)提取得率）的影響。結(jié)果見圖5。

圖5 不同相互作用下對(duì)巖藻黃質(zhì)提取得率的影響Fig.5 The effect of different interactions on the extraction yield of fucoxanthin

響應(yīng)面能夠反映出單因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響能力大小，響應(yīng)面越陡，說明這種因素對(duì)響應(yīng)值影響越顯著。一般地，等高線圖越接近橢圓狀則說明相關(guān)性越顯著，由圖可觀察到，交互項(xiàng)對(duì)FX 提取得率的影響大小為：BC＞AB＞AC，其中BC 交互項(xiàng)的影響呈顯著性。

2.3 巖藻黃質(zhì)提取優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)DesignExpert 對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，可知最佳工藝條件為乙醇濃度為95.43%，液料比38.42:1，超聲時(shí)間為21.31 min，提取液中巖藻黃質(zhì)理論提取得率為202.21 μg/g。結(jié)合實(shí)際操作，以修正后的提取條件（乙醇濃度95%，液料比38:1，超聲時(shí)間21 min，提取次數(shù)為1 次）進(jìn)行銅藻中巖藻黃質(zhì)驗(yàn)證試驗(yàn)，平行做3 組，得到巖藻黃質(zhì)的平均提取得率為200.28 μg/g，RSD＜5%，與理論值的相對(duì)誤差為0.95%。說明篩選出的最佳條件準(zhǔn)確可靠。

2.4 巖藻黃質(zhì)分離純化工藝

2.4.1 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附與解析動(dòng)力學(xué) 本研究分別采用擬一階動(dòng)力學(xué)方程和擬二階動(dòng)力學(xué)方程對(duì)樹脂的靜態(tài)吸附曲線進(jìn)行擬合，分析了不同大孔吸附樹脂對(duì)巖藻黃質(zhì)的吸附速率變化情況。

圖6給出了KP20、D101、AB-8、HPD750、KP670和PS30 6 種樹脂在室溫下吸附銅藻提取物中巖藻黃質(zhì)的吸附量（Q）與接觸時(shí)間（t）的關(guān)系圖。圖中顯示，KP670 和PS30 的吸附平衡時(shí)間接近，約80 min，其次是KP20、AB-8、HPD750 樹脂，平衡時(shí)間為100 min 左右，D101 所需時(shí)間最長(zhǎng)，約在130 min 后達(dá)到吸附平衡。

圖6 不同樹脂吸附巖藻黃質(zhì)的吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.6 Adsorption kinetic curves of fucoxanthin by different resins

圖7顯示了6 種樹脂的擬一階動(dòng)力學(xué)模型和擬二階動(dòng)力學(xué)模型，擬合結(jié)果的動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表4 所示。根據(jù)擬合結(jié)果中相關(guān)系數(shù)，擬一階動(dòng)力學(xué)方程的擬合結(jié)果更為良好，其值均大于0.97，且大部分＞0.99。此外，根據(jù)擬合出的理論計(jì)算值Q（cal）與實(shí)際實(shí)驗(yàn)值Q（exp）相比較，一階動(dòng)力學(xué)方程所得的結(jié)果與實(shí)際值非常接近，差值更小，結(jié)果表明擬一階動(dòng)力學(xué)模型能更好的詮釋6 種樹脂吸附巖藻黃質(zhì)的動(dòng)力學(xué)行為。根據(jù)擬一階速率常數(shù)k，吸附率大于0.02 min的樹脂依次為：KP670＞PS30＞KP20。

圖7 不同樹脂吸附巖藻黃質(zhì)的擬一階動(dòng)力學(xué)模型（A）和擬二階動(dòng)力學(xué)模型（B）Fig.7 The pseudo-first-order kinetic model (A) and pseudosecond-order kinetic model (B) of fucoxanthin adsorption by different resins

表4 不同樹脂吸附巖藻黃質(zhì)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 Kinetic parameters of fucoxanthin adsorption by different resins

圖8顯示在室溫下，6 種大孔吸附樹脂對(duì)巖藻黃質(zhì)解析動(dòng)力學(xué)。從圖中觀察到，樹脂的解析速率相比吸附速率均明顯提高，其中KP20 最快達(dá)到解析平衡，約10 min，PS30 與KP670 平衡速率接近，在20 min左右達(dá)到解析平衡，其次是AB-8 與HPD750，而D101 樹脂的平衡解析量和解析速率皆最低。根據(jù)洗脫液的濃度（C）與解析速率大小，性能較高的三種樹脂排序依次為：KP20＞PS30＞KP670。結(jié)合吸附能力結(jié)果，最終選擇KP20、PS30、KP670 這三種樹脂作為適合分離純化巖藻黃質(zhì)的層析樹脂。

圖8 不同樹脂的洗脫動(dòng)力學(xué)曲線Fig.8 Elution kinetic curves of different resins

2.4.2 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附與解析性能驗(yàn)證為了驗(yàn)證6 種樹脂的靜態(tài)吸附與解析動(dòng)力學(xué)結(jié)果，采用“1.2.5.2”項(xiàng)下公式，分別對(duì)6 種樹脂的吸附率與解析率進(jìn)行考察，結(jié)果如表5。

表5 不同樹脂對(duì)巖藻黃質(zhì)的靜態(tài)吸附與解析Table 5 Static adsorption and desorption of fucoxanthin by different resins

由表5 可知，KP670 型大孔吸附樹脂對(duì)銅藻提取液中巖藻黃質(zhì)的吸附能力最強(qiáng)，其次是PS30 和KP20 型樹脂；而 KP20、PS30 型大孔吸附樹脂對(duì)巖藻黃質(zhì)的解析能力強(qiáng)于KP670，其吸附與解析能力結(jié)果與“2.4.1”動(dòng)力模型擬合結(jié)果一致，說明篩選出的最佳樹脂準(zhǔn)確可靠。

考慮到PS30 樹脂較昂貴，放大化生產(chǎn)成本較高，故選擇KP20、KP670 兩種樹脂為吸附材料，放大3 倍進(jìn)行吸附后，考察樹脂動(dòng)態(tài)吸附性能與解析率，進(jìn)一步確定最佳層析樹脂。

2.4.3 大孔吸附樹脂的動(dòng)態(tài)吸附與解析 按“1.2.5.3”項(xiàng)下方法測(cè)定兩種樹脂的最大上樣量，并繪制泄露曲線。

當(dāng)流出液濃度為上樣液濃度的5%時(shí)，到達(dá)泄露點(diǎn)，認(rèn)為此時(shí)為最佳上樣容積。由圖9（A）可見，在到12 份流出液中濃度仍為0，當(dāng)流出液收集到第16 份時(shí)為4.6 μg/mL，達(dá)到上樣液濃度的5%，因此選擇上樣液容積為320 mL 為KP670 型樹脂的最大上樣量。

圖9 巖藻黃質(zhì)在KP670 型（A）、KP20 型（B）大孔吸附樹脂上的泄露曲線Fig.9 The leakage curve of fucoxanthin on KP670 type (A) and KP20 type (B) macroporous resin

同理，由圖9（B）可觀察到當(dāng)流出液收集到第9 份開始有巖藻黃質(zhì)流出，在第11 份流出液中檢測(cè)到巖藻黃質(zhì)濃度為4.8 μg/mL，達(dá)到上樣液濃度的5%，因此選擇上樣液容積為220 mL 為KP20 型樹脂的最大上樣量。

同時(shí)，為了更好比較兩種樹脂的純化效果，按“1.2.5.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行巖藻黃質(zhì)在樹脂上的動(dòng)態(tài)解析，分離純化結(jié)果見表6。

表6 大孔吸附樹脂純化工藝結(jié)果Table 6 Purification process results of macroporous resins

結(jié)果表明，對(duì)于KP670 大孔吸附樹脂，乙醇的洗脫率為89.53%，固形物由3.13 g 減少到0.09 g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.90%升至31.07%；對(duì)于KP20 大孔吸附樹脂，固形物由2.15 g 減少到0.08 g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.90%升至24.56%，洗脫率為87.51%。綜合對(duì)比，KP670 大孔吸附樹脂對(duì)銅藻中巖藻黃質(zhì)的分離純化效果更好。

3 討論與結(jié)論

本研究首先采用超聲波輔助有機(jī)溶劑萃取法提取銅藻中的巖藻黃質(zhì)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken 模型對(duì)巖藻黃質(zhì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)回歸分析和方差分析，得到簡(jiǎn)化回歸方程，模型擬合結(jié)果良好（=0.9958），最終得到最優(yōu)提取工藝為：乙醇濃度95%，超聲時(shí)間21 min，液料比38:1，提取次數(shù)為1 次，所得巖藻黃質(zhì)的提取得率為200.28 μg/g鮮重（FW），折算成干重為0.93 mg/g（DW），相比于胡永東等采用超聲輔助有機(jī)溶劑萃取法所得的巖藻黃質(zhì)提取率為0.70 mg/g 干重（DW），本研究中提取工藝所得的巖藻黃質(zhì)提取得率有所提高，這說明，銅藻鮮藻中巖藻黃質(zhì)提取得率要高于銅藻干藻，同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在海帶、馬尾藻等的提取得率對(duì)比中，原因可能是一方面樣品干燥過程容易使巖藻黃質(zhì)受熱分解；一方面干燥樣品中吸附作用加強(qiáng)，影響巖藻黃質(zhì)浸出，且不易過濾，導(dǎo)致巖藻黃質(zhì)的損失，故直接采用新鮮銅藻作為巖藻黃質(zhì)原料是更為高效的方法。

其次，本研究基于大孔吸附樹脂的一步柱層析方法對(duì)巖藻黃質(zhì)粗提取液進(jìn)行純化。通過6 種型號(hào)大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附和解析動(dòng)力學(xué)結(jié)果比較，KP670、KP20 大孔吸附樹脂表現(xiàn)出較優(yōu)的綜合性能，其靜態(tài)吸附過程符合擬一階動(dòng)力學(xué)方程（均＞0.99）。最后，在大孔樹脂的動(dòng)態(tài)吸附與解析動(dòng)力學(xué)中對(duì)兩種樹脂進(jìn)一步比較，KP670 大孔吸附樹脂對(duì)銅藻中巖藻黃質(zhì)的分離純化效果比KP20 大孔吸附樹脂好，其純化后經(jīng)HPLC 檢測(cè)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.09%提高到31.07%，提高了30.98%，且?guī)r藻黃質(zhì)的洗脫率為89.53%，損失較少，說明選用KP670 大孔吸附樹脂能更好地分離純化巖藻黃質(zhì)。在巖藻黃質(zhì)純化方面，近年來已有學(xué)者使用硅膠柱層析分離純化海帶、鼠尾藻、球等鞭金藻等中的巖藻黃質(zhì)，對(duì)于使用大孔樹脂從銅藻提取液中分離巖藻黃質(zhì)鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，且未揭示大孔吸附樹脂對(duì)巖藻黃質(zhì)的吸附動(dòng)力學(xué)規(guī)律。相比之下，本研究采用的大孔吸附樹脂具有比表面積大，條件溫和，再生處理方便等優(yōu)點(diǎn)，采用吸附-解析一步柱層析工藝即獲得高含量的巖藻黃質(zhì)，成本低，操作簡(jiǎn)易，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)為巖藻黃質(zhì)的提取純化工藝提供了新的理論參考。

考慮到本文采用大孔樹脂吸附技術(shù)對(duì)巖藻黃質(zhì)僅進(jìn)行了初步的純化，巖藻黃質(zhì)的純度和濃度都有待提高，后續(xù)可以采用制備型液相或高效液相色譜法得到更高純度的巖藻黃質(zhì)，并采用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)巖藻黃質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，對(duì)其生物活性和功能進(jìn)行進(jìn)一步研究。