高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法(HRGC/HRMS)分析環(huán)境樣品中二噁英類物質(zhì)前處理技術(shù)探討

冉艷瓊,曹 陽,黃 蕓，鮮文婷,熊 杰

(四川省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測總站,成都 610091)

前 言

二噁英實際上是二噁英類(Dioxins)一個簡稱，是一種在環(huán)境中可持久性存在的有機污染物(POPs)，其化學、物理、生物學降解周期較長，通常需要幾十年或更長時間。二噁英類的毒性因氯原子的取代數(shù)量和取代位置不同而有差異，含有1～3個氯原子的被認為無明顯毒性；含4～8個氯原子的有毒，其中2,3,7,8-T4CDD毒性最大(其毒性相當于人們熟知的劇毒物質(zhì)氰化物的130倍、砒霜的900倍)[1]。再隨著氯原子取代數(shù)量的增加，其毒性又將會有所減弱。對二噁英類的毒性進行評價時，國際上常把各同類物折算成相當于2,3,7,8-T4CDD的量來表示，稱為毒性當量(Toxic Equivalent Quantity，簡稱TEQ)。二噁英不易溶于水，極易溶于脂肪組織，可通過母乳和動植物吸收而直接侵害人體[2]，且二噁英具有致畸、致癌、致突變效應(yīng)和生殖毒性[3]。在《斯德哥爾摩公約》已經(jīng)控制的 20 多種 POPs 中，二噁英是公認毒性最強的污染物，是公約首批控制的12 種污染物之一。二噁英同時存在含量低(痕量與超痕量分析)、多組分分析、異構(gòu)體繁多，分析技術(shù)特異性高、難度大等因素[4]，全世界都急需高效的檢測手段來監(jiān)測和控制環(huán)境中的二噁英含量。

目前環(huán)境樣品中的二噁英類檢測方法主要分為化學檢測法、生物檢測法、免疫法[5]。國際公認的二噁英檢測方法高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法(HRGC -HRMS)因分辨率高、檢出限低、精密度好應(yīng)用廣泛，其中美國的 EPA1613 法現(xiàn)為各國公認的仲裁方法[6]。高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法的主要步驟為：提取-濃縮-凈化-濃縮-定容-上機測試[7]，而這其中提取和凈化這兩步是極為關(guān)鍵，對二噁英類物質(zhì)分析的準確性起至關(guān)作用，同時不同的前處理方法，分析準確度，分析周期，耗費人力都不盡相同。而現(xiàn)階段二噁英的分析普遍存在分析前處理過程中技術(shù)難度大、周期長、試劑用量大、操作安全性等相關(guān)問題。本文主要針對高分辨氣相色譜-質(zhì)譜法分析二噁英類物質(zhì)的前處理技術(shù)中最為關(guān)鍵的提取、凈化的不同方法進行了綜合比較試驗，提出更加簡便、高效、準確、安全的前處理技術(shù)方案，為二噁英類物質(zhì)分析提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

本實驗采用高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法(HRGC/HRMS)對前處理后的樣品進行分析。所需儀器設(shè)備有： Thermo DFS高分辨氣相色譜-質(zhì)譜儀、索式提取裝置、ASE350快速溶劑萃取儀(Thermo)、全自動凈化儀(德國LCTech)、半自動凈化儀、氮吹濃縮儀(Organomation)。所需試劑耗材有：多層硅膠柱(德國LCTech)、氟羅里硅土柱(德國LCTech)、活性炭柱(德國LCTech)、二氯甲烷(農(nóng)殘級)、正己烷(農(nóng)殘級)、甲苯(農(nóng)殘級)、丙酮(農(nóng)殘級)、壬烷(農(nóng)殘級)、濃硫酸(優(yōu)級純)、硅藻土、中性硅膠(CNW)、活性炭、EPA1613 ISS混合標準樣品(13C-1,2,3,4-TCDD 和13C-1,2,3,7,8,9-HxCDD進樣內(nèi)標)、EPA1613 LCS混合標準溶液(含15個13C標記的2,3,7,8-氯取代PCDD/Fs提取內(nèi)標)、EPA 1613 CS1-CS5校正標準溶液、儀器參考標樣全氟三丁胺(FC43)。

1.2 實驗方法

目前環(huán)境樣品中二噁英分析的行業(yè)標準中二噁英前處理方法方式單一和繁瑣且存在周期長、試劑用量大、操作安全性等相關(guān)問題。其具體步驟為在樣品中加入EPA1613 LCS混合標液，使提取內(nèi)標的加標量為：四氯～七氯代化合物0.5ng，八氯代化合物1.0ng進行提取，經(jīng)提取后的樣品需通過凈化去除基體干擾，將凈化后的樣品濃縮至近干，加入30μL正壬烷和5μL進樣內(nèi)標EPA1613 ISS(1.0ng)定容至35μL，最后采用高分辨氣相色譜-質(zhì)譜儀進行上機分析。目前環(huán)境分析實驗室常用提取樣品方法選用美國賽默飛DionexASE350快速溶劑萃取儀和索式提取儀兩種方式進行提取，本實驗采用兩種提取方法分別測定8個土壤標準樣品，比較17種二噁英類化合物結(jié)果準確度及15種二噁英類提取內(nèi)標回收率，綜合提出更優(yōu)的樣品提取方法。常用的凈化樣品方法有三種：一種是采用LcTech的全自動凈化儀和成品柱，一種是采用手工填充的手動凈化，還有一種為半自動凈化。本實驗室采用某垃圾焚燒廠周邊實際土壤樣品，經(jīng)加壓流體萃取后，采用三種凈化方法進行比對試驗。

快速溶劑萃取條件：二噁英快速溶劑萃條件為：萃取池壓力：1500psi、加熱溫度：150℃、預(yù)加熱平衡時間：7min、靜態(tài)萃取時間：7min、溶劑淋洗體積：100%池體積、氮氣吹掃時間：200s、靜態(tài)萃取次數(shù)：3次，萃取溶劑為甲苯約,80mL，單個萃取時間為35min以內(nèi)。

索式提取條件：稱取一定量的土壤樣品至于濾筒中，放入索氏提取管，在平底燒瓶中加入350mL甲苯溶劑，采用電爐加熱試劑循環(huán)浸提的方式，回流18～24h。

LCTech全自動凈化條件：根據(jù)凈化柱數(shù)量可分為三柱式、四柱式凈化，以常見的四柱式凈化為例，第一段為多層硅膠柱，含有堿性硅膠、中性硅膠、酸性硅膠等，其中酸性硅膠柱能夠有效地吸附樣品中強極性化合物，多環(huán)芳香族化合物、有色物質(zhì)等，而經(jīng)過多層硅膠柱的樣品中的二噁英類、呋喃類化合物以及PCBs等通過正己烷將分離樣品中的PCB并吸附在第一活性炭柱上；第二段為弗羅里硅土柱，樣品經(jīng)過弗羅里硅土柱并在二氯甲烷/正己烷(1∶1,V/V)混合溶劑的作用下將PCDD/PCDF附著在第二活性炭柱上；第三段為第一活性炭柱，用二氯甲烷/正己烷(1∶1,V/V)混合溶劑洗脫部分PCB化合物，并用甲苯溶劑反沖第一活性炭柱再次分離PCB化合物，第四段為第二活性炭小柱，用甲苯溶劑反沖第二活性碳小柱洗脫PCDD/PCDF，并收集洗脫液。整個過程全部自動化，并由儀器精準控制流量，每凈化一個樣品僅需要60～70min。

半自動凈化條件：半自動凈化采用成品柱，不需要手工填充凈化柱。第一步用40mL正己烷預(yù)淋洗酸性硅膠層析柱，將預(yù)淋洗好的酸性硅膠層析柱與活性炭柱串聯(lián)，并用10mL正己烷淋洗，第二步將樣品用正己烷轉(zhuǎn)移至串聯(lián)酸性硅膠層析柱/活性炭柱，每次用2mL正己烷洗滌容器(3～4次)，并將洗滌液轉(zhuǎn)移至串聯(lián)酸性硅膠層析柱/活性炭柱上，再用15mL正己烷淋洗串聯(lián)酸性硅膠層析柱/活性炭柱(棄去過柱正己烷)后，用15mL正己烷洗脫DL-PCBS和PBDES，第三步將活性炭柱與酸性硅膠層析柱分離，連接在另一空玻璃柱下方(活性炭平整面向上)，用6mL甲苯/正己烷(1∶1)洗脫DL-PCBS和PBDES，最后再將活性炭柱翻轉(zhuǎn)與空玻璃柱連接，用30mL甲苯洗脫PCDDS/FS，收集洗脫液。全過程也需要實驗人員把控好每一步，每批樣品凈化需要8h左右。

手工填充的手動凈化條件：目前應(yīng)用也比較廣泛，手動凈化需要在實驗室自行制作填料，裝填凈化柱。各實驗室裝填方式大致相同。本實驗手動凈化填充凈化分為兩大部分組成，一部分為多層硅膠柱，另一部分為活性炭柱，見圖1。凈化步驟為先用150mL正己烷以每秒1～2滴的速度活化多層硅膠柱，再用150mL正己烷以相同的速度進行洗脫。洗脫以后的樣品經(jīng)濃縮待用。再30ml正己烷以每秒1～2滴的速度活化活性炭柱，用二氯甲烷/正己烷(1∶1,V/V)混合溶劑將多層硅膠洗脫濃縮后的樣品進行再次洗脫，翻轉(zhuǎn)活性炭柱后再用50mL甲苯洗脫二噁英。全程均需要實驗人員把控好每一步，每批樣品凈化需要8h左右。

圖1 手動填充凈化柱示例Fig.1 Example of manually filled purification column

2 結(jié)果與討論

2.1 快速溶劑萃和索式提取兩種樣品提取方法的綜合比較

按照快速溶劑萃取條件和索式提取條件，對土壤標準樣品分別測定8次，用分析結(jié)果與標準樣品的相對誤差值來評價提取方法的正確度，如圖2；用15種二噁英類提取內(nèi)標回收率來評價提取方法的提取效率，如圖3。

圖2 兩種提取方式正確度比較Fig.2 The accuracy comparison of the two extraction methods

圖3 兩種提取方式二噁英類物質(zhì)提取內(nèi)標回收率比較Fig.3 Comparison of internal standard recovery of dioxins by two extraction methods

由圖2可見，采用快速溶解萃取或索氏提取兩種提取方法對二噁英類土壤標準樣品進行測定準確度分別在-0.8～4.5和-9.6～19.3之間，均在±20%以內(nèi)。由圖3可見，提取內(nèi)標的回收率大小并無明顯區(qū)別且均在72%以上。但是采用美國賽默飛DionexASE350快速溶劑萃取儀，試劑用量少(小于80mL)，可連續(xù)提取幾十個樣品，且單個樣品萃取時間短(35min以內(nèi))。

綜上所述，加壓流體萃取和索式提取兩種方式的提取效率基本一致，但加壓流體萃取相比索氏提取試劑用量更少，前處理周期更短，實驗室安全性能更高。

2.2 LCTech全自動凈化方法、手工填充的手動凈化方法、半自動凈化方法的綜合比較

以實際土壤樣品為例經(jīng)提取后的樣品按照全自動凈化、手動凈化及半自動凈化分別測定8個平行樣品，以15種二噁英提取內(nèi)標回收率測定均值來評價凈化方法的準確度，如圖4；以質(zhì)譜圖和FC43提取離子圖的評價凈化方法的凈化效果，三種凈化方法的質(zhì)譜圖和FC43提取離子圖均如圖5、圖6。

圖4 三種凈化方式15種同位數(shù)標記二噁英內(nèi)標回收率對比Fig.4 The internal recovery comparison of 15 isotopes labelling dioxin by three purification methods

由圖4可見：采用全自動凈化時15種同位數(shù)標記二噁英提取內(nèi)標回收率在79%～107%之間，五氯代二苯并-對-二噁英和六氯代二苯并-對-二噁英的回收率要優(yōu)于其他物質(zhì)；采用手動凈化

1—2,3,7,8-T4CDF、13C122,3,7,8-T4CDF；2—13C121,2,3,4-T4CDF；3—2,3,7,8-T4CDD、 13C12-2,3,7,8-T4CDD；4—1,2,3,7,8-P5CDF、13C121,2,3,7,8-P5CDF；5—2,3,4,7,8-P5CDF、13C122,3,4,7,8-P5CDF；6—1,2,3,7,8-P5CDD、13C121,2,3,7,8-P5CDD；7— 1,2,3,4,7,8-H6CDF、13C12-1,2,3,4,7,8-H6CDF；8—1,2,3,6,7,8-H6CDF、13C12-1,2,3,6,7,8- H6CDF；9—2,3,4,6,7,8- H6CDF、13C12-2,3,4,6,7,8- H6CDF；10—1,2,3,4,7,8-H6CDD、13C12-1,2,3,4,7,8-H6CDD；11—1,2,3,6,7,8-H6CDD、13C12-1,2,3,6,7,8-H6CDD；12—1,2,3,7,8,9-H6CDD、13C12-1,2,3,7,8,9-H6CDD；13—1,2,3,7,8,9-H6CDF、13C12-1,2,3,7,8,9-H6CDF；14—1,2,3,4,6,7,8-H7CDF、13C12-1,2,3,4,6,7,8-H7CDF；15—1,2,3,4,6,7,8-H7CDD、13C12-1,2,3,4,6,7,8-H7CDD；16—1,2,3,4,7,8,9-H7CDF、13C12-1,2,3,4,7,8,9-H7CDF；17—OCDD、13C12-OCDD；18—OCDF圖5 高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法(HRGC-HRMS)測定質(zhì)譜圖Fig.5 The mass spectrum by HRGC-HRMS

圖6 高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法(HRGC -HRMS)測定FC43提取離子圖Fig.6 FC43 Extracted ion diagram by HRGC-HRMS

時同位數(shù)標記二噁英內(nèi)標回收率在63%～96%之間，五氯代二苯并-對-二噁英的回收率要優(yōu)于其他物質(zhì)；采用半自動凈化時二噁英類提取內(nèi)標回收率在63%～83%之間。因此采用圖5可見，通過三種凈化方式后的樣品分析后均物質(zhì)峰分離度好，無拖尾峰；由圖6可見，提取離子圖基線平順、無負峰、無突出峰、雜質(zhì)較少。

綜上所訴三種凈化方式的凈化效果程度一致，但全自動凈化方式的回收率整體上優(yōu)于手動凈化和半自動凈化，且全自動凈化耗時較短，不需要過多的人工操作，對于經(jīng)費預(yù)算足且分析技術(shù)員缺乏的單位是較好的一種前處理方式，而手動凈化和半自動凈化的回收率基本接近，原因可能是全自動凈化是采用儀器精準控制活化及洗脫的流速和壓力，成品填充柱的填充松緊度也相對緊實及均勻。而手動凈化和半自動凈化均由操作人員自行調(diào)節(jié)活化及控制洗脫的流速和壓力，會因為不同操作者熟練程度而產(chǎn)生的較大的系統(tǒng)誤差，同時實驗室自行填充的凈化柱也會受不同操作者的影響較大。

3 結(jié) 論

本文通過對用高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法(HRGC/HRMS)分析環(huán)境樣品中實驗室常用的幾種前處理方法進行充分的比對試驗，試驗表明采用快速溶解萃取和全自動凈化方法相結(jié)合的方式進行前處理，操作簡單、前處理效率高、數(shù)據(jù)準確性高，能夠更簡便、高效、準確、安全的進行環(huán)境樣品中二噁英類物質(zhì)的前處理。為環(huán)境類樣品二噁英分析的前處理提供技術(shù)方案，極大的彌補了行業(yè)標準中前處理方式單一的缺陷，為廣泛的開展二噁英分析工作，推進二噁英技術(shù)研發(fā)，改進二噁英類污染監(jiān)測技術(shù)起到重要的支撐作用，從而為進一步的二噁英綜合防治奠定更加堅實的技術(shù)基礎(chǔ)。