水飛薊素治療藥物性肝損傷的“藥效—靶標(biāo)”作用網(wǎng)絡(luò)分析*

鄭世榜 邱 華 李永強(qiáng) 廖思娜 廖小莉

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西南寧市 530021

藥物性肝損傷(Drug-induced liver injury，DILI)是藥物、膳食補(bǔ)充劑和保健品引起常見的不良反應(yīng)之一。研究表明，中國的藥物性肝損傷的發(fā)生率達(dá)到每10萬人口就有約24人發(fā)病，而抗腫瘤藥物是引起DILI的第三大常見原因，占比8.34%[1]。臨床上常因藥物性肝損傷而導(dǎo)致抗腫瘤治療時(shí)間延長(zhǎng)或者抗腫瘤藥物劑量降低，從而影響患者的治療效果，是目前臨床亟待解決的熱點(diǎn)問題之一。

水飛薊素是水飛薊(歸肝、膽經(jīng))的主要成分，是一種天然保肝的黃酮類化合物。它可通過抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化、刺激肝臟細(xì)胞再生等而發(fā)揮保肝作用[2]。中華醫(yī)學(xué)會(huì)的藥肝診治指南對(duì)DILI的保肝推薦藥物中水飛薊素是一線推薦用藥[3]。水飛薊制劑肝病臨床應(yīng)用專家共識(shí)提出對(duì)藥物性肝損傷，特別是毒蕈中毒所致肝損傷，首先推薦使用水飛薊素治療；使用水飛薊素可預(yù)防或減少抗結(jié)核藥物所致藥物性肝損害[4]。

然而不同藥物導(dǎo)致的肝損機(jī)制是不同的，且護(hù)肝藥物的療效也是不一樣的，鑒于水飛薊素具有多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，為進(jìn)一步更好指導(dǎo)臨床用藥，將采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對(duì)接的方法來篩選并且探討水飛薊素抗藥物性肝損傷主要的藥效靶點(diǎn)，為DILI的精準(zhǔn)治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 水飛薊素靶點(diǎn)獲取 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取水飛薊素對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白信息輸入 Uniprot數(shù)據(jù)庫，將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)化為“智人”物種以及選擇對(duì)應(yīng)已驗(yàn)證的基因符號(hào)，從而進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白和基因匹對(duì)，獲得作用靶點(diǎn)，在CTD數(shù)據(jù)庫中以水飛薊素為關(guān)鍵詞，初篩水飛薊素的作用靶點(diǎn)，將上述靶點(diǎn)合并且刪除重復(fù)靶點(diǎn)后，獲取水飛薊素作用靶點(diǎn)。

1.2 DILI疾病基因獲取及治療靶點(diǎn)的篩選 運(yùn)用GEO數(shù)據(jù)庫下載芯片數(shù)據(jù)原始文件GSE54255，此芯片收集5例藥物性肝損傷肝臟切片和5例正常對(duì)照肝臟切片的基因測(cè)序信息的樣本，利用R語言軟件中的limma 包分析差異基因，設(shè)置調(diào)整后的P<0.05和|log 2倍變化(FC)|>1為截?cái)嚅撝?。差異分析的結(jié)果使用ggplot2 軟件包將繪制成火山圖和熱圖。運(yùn)用GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫，以“Drug-induced liver injury”為檢索詞收集藥物性肝損傷的靶點(diǎn)。將GEO數(shù)據(jù)庫、GeneCards 和 OMIM 數(shù)據(jù)庫的疾病基因合并，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后得到DILI疾病基因靶點(diǎn)。利用在線Venny2.1平臺(tái)繪制藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的韋恩圖，篩選出水飛薊素抗藥物性肝損傷的治療靶點(diǎn)。

1.3 成分—靶點(diǎn)圖的繪制和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、核心藥靶的篩選 將“1.2”項(xiàng)所得交集基因?qū)隒ytoscape軟件，進(jìn)行藥效成分—靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的可視化，藥物活性成分和作用靶點(diǎn)以“節(jié)點(diǎn)”表示，節(jié)點(diǎn)之間的相互作用以“邊”表示，然后將交集基因輸入 String 數(shù)據(jù)分析平臺(tái)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，選擇物種為智人，選擇互動(dòng)得分≥0.9，刪除游離的蛋白，獲取水飛薊素治療藥物性肝損傷的 PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，并將PPI數(shù)據(jù)保存為TSV格式，將TSV格式文件導(dǎo)入Cytoscape軟件，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖；為進(jìn)一步篩選出水飛薊素抗DILI的核心基因，使用CytoNCA工具(Cytoscape插件)來分析靶基因的拓?fù)鋵傩裕捎枚戎行男?DC)、間中心性(BC)、接近中心性(CC)、特征向量中心性(EC)、局部邊連通性(LAC) 和網(wǎng)絡(luò)中心性(NC)六個(gè)參數(shù)來估計(jì)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的中心屬性[5]，節(jié)點(diǎn)參數(shù)量化值越高，表明節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中重要性越大；在PPI網(wǎng)絡(luò)中，采用上述六個(gè)參數(shù)大于中位數(shù)1倍進(jìn)行兩次篩選，獲取水飛薊素作用于DILI的核心靶點(diǎn)。

1.4 GO功能富集分析和 KEGG 通路富集分析 為進(jìn)一步研究核心靶點(diǎn)功能及水飛薊素在治療DILI中的主要作用通路，利用R包c(diǎn)lusterProfiler對(duì)“1.2”項(xiàng)中獲得的治療靶點(diǎn)進(jìn)行 GO和 KEGG分析，設(shè)置P值和糾正后P值均<0.05進(jìn)行可視化分析。

1.5 分子對(duì)接 從PubChem 數(shù)據(jù)庫下載水飛薊素和常用護(hù)肝藥還原性谷胱甘肽的二維化合物結(jié)構(gòu)，用Chemoffice軟件整合成三維結(jié)構(gòu)，并對(duì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行最小結(jié)合能的優(yōu)化，從PDB數(shù)據(jù)庫中下載“1.3”項(xiàng)篩選出的degree值前5核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)，運(yùn)用 Pymol軟件進(jìn)行預(yù)處理，移除靶蛋白中的原有配體和水分子。使用Autodock對(duì)預(yù)處理后的靶蛋白添加氫原子，并將處理后的受體(靶標(biāo)蛋白)和配體(水飛薊素、還原性谷胱甘肽)文件保存為 PDBQT格式。設(shè)置Gridbox的坐標(biāo)及大小，運(yùn)行Autodock vina進(jìn)行尋找柔性對(duì)接的最佳對(duì)接條件，記錄受體與配體的對(duì)接位置，以此來評(píng)估靶蛋白與化合物的結(jié)合情況，最后使用 Pymol軟件觀察和分析靶蛋白和化合物的對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 DILI相關(guān)靶點(diǎn)篩選結(jié)果 根據(jù)篩選條件，對(duì) GEO 芯片數(shù)據(jù)庫的基因芯片進(jìn)行分析獲得1 706個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因872個(gè)，下調(diào)基因834個(gè)，運(yùn)用 R 語言軟件繪制DILI相關(guān)芯片的差異表達(dá)基因的火山圖和聚類圖，見圖1。GeneCards數(shù)據(jù)庫設(shè)置相關(guān)系數(shù)≥10獲得428個(gè)DILI相關(guān)基因，OMIM數(shù)據(jù)庫獲得35個(gè)疾病相關(guān)基因，去除數(shù)據(jù)庫重復(fù)項(xiàng)后共獲得2 108個(gè)DILI相關(guān)靶點(diǎn)。

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2.2 水飛薊素治療肝損傷的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 TCMSP以及CTD 數(shù)據(jù)庫中獲得水飛薊素的靶點(diǎn) 270個(gè)，GEO、GeneCards 以及 OMIM 數(shù)據(jù)庫中獲得DILI的相關(guān)靶點(diǎn)2 108個(gè)，通過利用在線工具Venny2．1取交集后顯示，水飛薊素與DILI形成的藥物—疾病交集靶基因有112個(gè)，見圖2。

2.3 成分—靶標(biāo)的網(wǎng)絡(luò)以及靶標(biāo)的獲取 成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖共由113個(gè)節(jié)點(diǎn)組成，包括藥物節(jié)點(diǎn)(飛薊素)1個(gè)(黃色)，其余節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，其中藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示水飛薊素對(duì)該基因相關(guān)蛋白有抑制作用，粉色節(jié)點(diǎn)表示存在雙向作用，紅色表示促進(jìn)作用，綠色節(jié)點(diǎn)表示有一定的作用，但是作用方式未知，見圖3(來源：CTD數(shù)據(jù)庫)。在STRING數(shù)據(jù)庫中獲取藥物與疾病靶點(diǎn)的 PPI的TSV格式文件，導(dǎo)入Cytoscape軟件，得到潛在節(jié)點(diǎn)共 103個(gè)，邊458條的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖4。利用插件 CytoNCA ，篩選條件為：BC、CC、DC、EC 、LAC 、NC參數(shù)均大于中位值，經(jīng)過兩個(gè)過濾篩選，最終得到9個(gè)核心靶點(diǎn)(按degree值從高到低),見表1。一般而言，高degree的蛋白更傾向于是關(guān)鍵蛋白。

圖3 “成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 核心靶點(diǎn)按degree值(DC)從高到低

2.4 GO功能富集分析 運(yùn)用R包c(diǎn)lusterProfiler進(jìn)行對(duì)“2.2”項(xiàng)中篩選的交集基因進(jìn)行GO功能富集分析后共獲得條目2 479 條(其中生物過程2 335 個(gè)，分子功能 117個(gè)，細(xì)胞組成27個(gè))，生物過程(BP)主要涉及炎癥應(yīng)激、免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激等方面；分子功能(MF)主要涉及細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子活性等方面；細(xì)胞組成(CC)主要涉及分泌性顆粒狀管腔、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔等方面。各類別位于前五的條目,見圖5。

2.5 KEGG通路富集 運(yùn)行R包c(diǎn)lusterProfiler篩選得到165條信號(hào)通路(P<0.05)，其中排名前 30的通路繪制氣泡圖，見圖5。KEGG結(jié)果顯示與藥物性肝損傷密切相關(guān)的通路有：TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等。

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2.6 分子對(duì)接 經(jīng)過篩選最終選擇將“2.3”項(xiàng)的degree值(DC值)前3的關(guān)鍵靶蛋白STAT3、TNF、RELA作為核心靶點(diǎn),相應(yīng)的化合物水飛薊素和還原型谷胱甘肽作為小分子，回顧文獻(xiàn)尋找活性中心后開展分子對(duì)接。分子對(duì)接親和力<-5.0kJ/mol，這表明水飛薊素與關(guān)鍵靶蛋白能穩(wěn)定的結(jié)合，結(jié)合信息及參數(shù)見表2， 其中結(jié)合自由能最小，常見的藥物性肝損傷的靶點(diǎn)TNF-α[6]的3D分子對(duì)接圖，見圖6。

表2 核心靶點(diǎn)—化合物的結(jié)合能(kcal/mol)

圖6 水飛薊素和核心靶點(diǎn)TNF的分子對(duì)接圖

3 討論

水飛薊疏肝利膽、清熱解毒，用于肝膽濕熱和黃疸。水飛薊素作為水飛薊的主要成分，是臨床上治療藥物性肝損傷的基礎(chǔ)藥物。目前水飛薊素已成為國內(nèi)多個(gè)權(quán)威肝病指南的推薦用藥[3,7-9]。而在針對(duì)抗結(jié)核藥物、毒蕈中毒引起的DILI治療中, 水飛薊素也成為我國專家共識(shí)的保肝用藥一線推薦[4]。然而水飛薊素抗藥物性肝損傷的治療主要基于臨床經(jīng)驗(yàn)，其作用分子機(jī)制仍未完全明確。因此篩選和識(shí)別水飛薊素對(duì)DILI的治療靶點(diǎn)具有重要意義，為臨床的精準(zhǔn)治療提供參考。

網(wǎng)絡(luò)分析篩選得到篩出最終核心靶點(diǎn)包括STAT3、TNF、RELA等藥效靶標(biāo)。STAT3是一種細(xì)胞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子，在介導(dǎo)肝損傷的過程中起著至關(guān)重要的作用[10]。如圖3所示，水飛薊素可以下調(diào)STAT3的表達(dá)。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明STAT3表達(dá)的下降可以保護(hù)小鼠免受多種藥物誘導(dǎo)的肝毒性[11-13]。因而水飛薊素或許是通過抑制STAT3的表達(dá)而發(fā)揮抗DILI作用。TNF-α是腫瘤壞死因子家族的成員,作為主要促炎的細(xì)胞因子，在肝臟的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。TNF-α在DILI進(jìn)程中發(fā)揮加重肝損傷的作用[6]，它能通過激活鞘氨醇激酶來激活PI3K/Akt通路，從而調(diào)節(jié)肝細(xì)胞凋亡[14]。最近的一項(xiàng)研究證實(shí)了水飛薊素可能通過抑制TNF-α表達(dá)來減輕雷公藤內(nèi)酯誘導(dǎo)的DILI[15]，而圖3所示，水飛薊素調(diào)節(jié)TNF的表達(dá)是雙向的，這提示水飛薊素可通過精密調(diào)控TNF-α的濃度而發(fā)揮其抗DILI的作用。RELA是典型的NF-κB家族成員之一，用于調(diào)節(jié)控制炎癥，細(xì)胞死亡和增殖基因的轉(zhuǎn)錄。RELA參與肝臟損傷炎癥的調(diào)節(jié)[16]。研究表明RELA高表達(dá)水平在肝炎患者可以抗肝臟凋亡和減緩肝硬化程度，甚至可以降低死亡率[17-18]，但對(duì)于DILI來說，研究報(bào)道抑制RELA的表達(dá)能減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷[19]。值得注意的是，在GEO數(shù)據(jù)庫得出的差異基因中，肝損傷組RELA表達(dá)是上升的，而CTD數(shù)據(jù)庫中提示水飛薊素可以下調(diào)RELA，從而提示水飛薊素可能通過下調(diào)RELA，從而改善藥物性肝傷。

通路富集分析顯示水飛薊素主要作用于以TNF信號(hào)通路為主的炎癥或氧化應(yīng)激通路。TNF信號(hào)通路參與細(xì)胞損傷、免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，是控制肝穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞內(nèi)通路[20]。TNF-α及其相關(guān)細(xì)胞因子在肝臟穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，它們可以激活肝細(xì)胞的促凋亡(主要是半胱天冬酶)和抗凋亡(主要是NF-κB通路)[21]。藥物可引起氧化還原變化，進(jìn)而抑制TNF信號(hào)通路里面的抗調(diào)亡的生存途徑如 NF-κB。研究表明，亞毒性劑量的乙酰氨基酚能對(duì) NF-κB 進(jìn)行抑制，從而使肝細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子 (TNF) 的細(xì)胞毒性作用愈加敏感[22]。

最終筆者篩出的STAT3、TNF、RELA等靶基因基本富集在TNF信號(hào)通路中，為進(jìn)一步驗(yàn)證水飛薊素的藥效靶點(diǎn)，采用分子對(duì)接的方法進(jìn)行深入的探究，選取了排名degree值前3名的靶點(diǎn)與水飛薊素和還原型谷胱進(jìn)行對(duì)接，結(jié)果表明水飛薊素與3個(gè)核心靶蛋白的結(jié)合能穩(wěn)定結(jié)合，水飛薊素的平均結(jié)合能高于還原型谷胱甘肽，尤其是與TNF-α的結(jié)合，達(dá)到了-10.4kcal/mol(圖6、表2)。Wullaert A等研究發(fā)現(xiàn)TNF-α的激活是肝臟炎癥發(fā)生的最早事件之一[23]，提示水飛薊素在DILI的炎癥早期或許就能發(fā)揮出較強(qiáng)抗炎作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對(duì)接的技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，水飛薊素治療DILI的核心藥靶為 STAT3、TNF、RELA等靶點(diǎn)，主要是通過調(diào)控TNF信號(hào)通路為主的涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞調(diào)亡的多條信號(hào)通路發(fā)揮抗藥物性肝損傷的作用，并通過分子對(duì)接驗(yàn)證了藥效靶點(diǎn)與水飛薊素之間良好結(jié)合。然而本研究是基于現(xiàn)有文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)來挖掘水飛薊素抗藥物性肝損傷的藥效靶點(diǎn)，其結(jié)論仍需更多的研究進(jìn)行驗(yàn)證。