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    夏枯草三萜類提取物聯(lián)合Survivin-siRNA對食管癌Eca-109細胞抑制作用研究

    2022-08-25 08:48:20鄭學(xué)芝徐秋玲王文婷
    中國當(dāng)代醫(yī)藥 2022年20期
    關(guān)鍵詞:三萜類夏枯草貨號

    鄭學(xué)芝 徐秋玲 郭 冉 孫 健 王文婷

    牡丹江醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,黑龍江牡丹江 157011

    中藥夏枯草具有散結(jié)、明目、清火、消腫、抗腫瘤等作用,所含化學(xué)成分包括三萜類(熊果酸、齊墩果酸)、黃酮類、香豆素類、有機酸類、糖類、揮發(fā)油類等。其中夏枯草提取物的抗腫瘤作用表現(xiàn)在抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡、誘導(dǎo)分化、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥、抑制新生血管生成、抗突變等多方面。但傳統(tǒng)中藥抗腫瘤具有藥物生物利用度低、起效慢、療程長等特點,影響了其在臨床上的應(yīng)用。因此需要探究能增強夏枯草抗腫瘤療效的方法。食管癌是嚴重危害人類健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,其發(fā)生發(fā)展與多基因表達異常有關(guān),所以研究致癌相關(guān)基因并加以干預(yù)具有重要意義。Survivin 基因在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用,參與調(diào)控細胞凋亡和細胞周期,是最強的凋亡抑制因子之一,下調(diào)Survivin 基因表達可以促進腫瘤細胞的凋亡,Survivin 基因參與調(diào)控食管癌ERK 信號傳導(dǎo)通路,Survivin 蛋白表達與食管癌分化程度和TNM 分期有關(guān),故推測Survivin 基因可能對食管癌細胞的惡性增殖發(fā)揮重要作用。但臨床實踐表明,單獨干預(yù)一個基因不能起到穩(wěn)定持久的抗癌效果。所以本研究設(shè)計將中藥夏枯草三萜類提取物與Survivin基因靶點干預(yù)聯(lián)合應(yīng)用,探究從調(diào)控基因表達角度,能否起到優(yōu)化夏枯草抗食管癌療效的作用及可能性,觀察中藥夏枯草三萜類提取物聯(lián)合Survivin-siRNA對食管癌Eca-109 細胞增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)作用的影響,研究兩種治療方法對食管癌Eca-109 細胞是否具有協(xié)同抑制作用,Survivin-siRNA 能否增強夏枯草的抗腫瘤敏感性,進一步探究夏枯草抗食管癌機制,為臨床食管癌中醫(yī)藥治療提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    食管癌Eca-109 細胞:購自原中科院上海細胞所,傳代培養(yǎng)后由牡丹江醫(yī)學(xué)院科研中心保存;夏枯草三萜類提取物:利用大孔樹脂法得到三萜類成分,用95%乙醇溶解,配成生藥濃度為100 mg/ml 的夏枯草提取液,夏枯草購自廣東匯群中藥飲片公司(貨號:粵20160301);RPMI1640 培養(yǎng)基(貨號:22400-0089)、胎牛血清(貨號:10270-106)、胰蛋白酶(貨號:25200-056):購自Gibco 公司;RT-PCR 試劑盒(貨號:RR037A):購自takara 公司;Trizol(貨號:R0016)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:P0011)、Survivin 抗體(貨號:AS792)、GAPDH 抗體(貨號:AF1186):購自碧云天生物技術(shù)研究所;Survivin-siRNA B 套餐(貨號:A10002)、siRNA-Mate 轉(zhuǎn)染試劑(貨號:G04003):購自Gene Pharma 公司;Annexin-V-FITC/PI 凋亡雙染試劑盒(貨號:556547):購自BD 公司;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(貨號:BA1056)、CCK-8 試劑盒(貨號:AR1160):購自武漢博士德生物工程公司。

    1.2 細胞培養(yǎng)

    食管癌Eca-109 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),2~3 d 傳代一次,選取處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

    1.3 Survivin-siRNA 的選用及設(shè)計

    參考文獻[12]及Gen Bank 中人類Survivin 基因序列,設(shè)計靶向人Survivin 基因的特異性siRNA 序列為:正向5-′GGCUGGCUUCAUCCACUGCTT-3′,反向5′-GCAGU-GGAUGAAGCCAGCCTT-3′;無意義siRNA序列為:正向5-′CAGUCGCGUUUGCGACUGGTT-3′,反向5′-CCAGUCGCAA ACGCGACUGTT-3′。

    1.4 實驗分組

    空白對照組:食管癌Eca-109 細胞常規(guī)培養(yǎng),不進行任何處理;陰性對照組:食管癌Eca-109 細胞轉(zhuǎn)染無意義siRNA;夏枯草單獨處理組:夏枯草三萜類提取物處理食管癌Eca-109 細胞;siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組:食管癌Eca-109 細胞轉(zhuǎn)染Survivin-siRNA;夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組:食管癌Eca-109 細胞轉(zhuǎn)染Survivin-siRNA 24 h 后入夏枯草三萜類提取物。調(diào)整夏枯草三萜類提取物終濃度為168 μg/ml。

    1.5 Survivin mRNA 表達檢測

    轉(zhuǎn)染前24 h 將食管癌Eca-109 細胞以2×10/孔接種至6 孔板上,待胞增殖達到30%~50%密度時,按siRNA-Mate 操作說明進行siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組、陰性對照組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組相應(yīng)細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24 h,夏枯草單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組加入夏枯草三萜類提取物,之后所有組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后進行指標檢測。收集各組食管癌Eca-109 細胞,利用Trizol 試劑一步法提取總RNA。按照RT-PCR 試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄及擴增。以GAPDH 作為內(nèi)參照,設(shè)計Survivin、GAPDH引物序列如下。Survivin 基因產(chǎn)物約363 bp,正向引物P1:5′-AGCCCTTTCTCAACGACCAC-3′,反向引物P2:5′-GCACTTTCTTCGAGTTTCC-3′;內(nèi)參照GAPDH 基因產(chǎn)物長度約280 bp,正向引物P3:5′-GGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGA-3′,反向引物P4:5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTGGG-3′。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30 次循環(huán);72℃延伸10 min。擴增反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,通過凝膠成像分析系統(tǒng)分析Survivin 基因表達情況。

    1.6 Survivin 蛋白表達檢測

    收集各組食管癌Eca-109 細胞,加入RIPA 裂解緩沖液,提取總蛋白,用BCA 蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。采用12%SDS-PAGE 電泳分離后進行轉(zhuǎn)膜、封閉,Survivin 抗體(1∶1000)、GAPDH 抗體(1∶1000)室溫孵育過夜,TBST 洗膜,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(1∶1000)二抗室溫孵育2 h,暗室中ECL 反應(yīng)后曝光顯影,用quantity one 4.6.2 軟件進行分析。

    1.7 CCK-8 法檢測細胞增殖抑制率

    在96 孔培養(yǎng)板上按照5×10/孔接種各組食管癌細胞,每組各接種3 孔。待細胞增殖達到30%~50%密度時,按siRNA-Mate 操作說明進行siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組、陰性對照組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組細胞轉(zhuǎn)染。細胞轉(zhuǎn)染后24 h,夏枯草單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組加入夏枯草三萜類提取物,繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后,向所有組細胞待測孔內(nèi)各加入CCK-8 試劑10 μl,培養(yǎng)箱孵育4 h 后于450 nm 處用酶標儀測定各孔的吸光度(optical density,OD 值)。以培養(yǎng)液做空白對照并調(diào)零,測3 次,取平均值。細胞增殖抑制率=1-細胞存活率,即細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD 值/空白對照組OD 值)×100%。

    1.8 細胞凋亡檢測

    在6 孔板上按2×10接種各組食管癌細胞,待細胞增殖達到30%~50%密度時,按siRNA-Mate 操作說明進行siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組、陰性對照組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組相應(yīng)細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24 h,夏枯草單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組加入夏枯草三萜類提取物,繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后,取各組腫瘤細胞1×10個,加入Annexin-V-FITC 4 μl,PI 5 μl,Annexin-V 結(jié)合緩沖液400 μl,室溫條件下避光作用15 min,用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 Survivin mRNA 表達檢測

    夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin mRNA 表達水平均低于空白對照組與陰性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin mRNA表達水平低于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

    圖1 各組食管癌細胞中Survivin mRNA 的表達情況

    2.2 Survivin 蛋白表達檢測

    夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin 蛋白表達水平均低于空白對照組與陰性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin 蛋白表達水平低于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2、表1)。

    圖2 各組食管癌細胞中Survivin 蛋白的表達情況

    表1 各組食管癌細胞中Survivin 蛋白表達水平的比較(±s)

    2.3 細胞增殖抑制率檢測

    夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞增殖抑制率高于空白對照組與陰性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞增殖抑制率高于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

    表2 各組食管癌細胞增殖抑制率的比較(%,±s)

    2.4 細胞凋亡檢測

    流式雙染結(jié)果顯示,夏枯草單獨處理組、siRNA轉(zhuǎn)染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞凋亡率高于空白對照組與陰性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);夏枯草+siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞凋亡率高于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3、表3)。

    圖3 各組食管癌細胞凋亡率

    表3 各組食管癌細胞凋亡率(%,±s)

    3 討論

    食管癌發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)居高不下,隨著現(xiàn)代外科醫(yī)學(xué)高速發(fā)展,手術(shù)輔助以放化療的治療方式使食管癌患者的5年生存率得到了改善,但還存在術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及因手術(shù)創(chuàng)傷、放化療副作用等因素造成患者的生活質(zhì)量降低等問題,因此中醫(yī)藥治療、靶向基因干預(yù)等非手術(shù)治療方法已成為食管癌防治研究的熱點。與傳統(tǒng)化療藥物相比,夏枯草毒副作用小,不易產(chǎn)生耐藥,患者主觀接受度高,但是夏枯草成分復(fù)雜,抗腫瘤作用起效慢,療程長,生物利用度低,限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此,有必要通過聯(lián)合其他抗腫瘤策略以利于夏枯草提取物抗食管癌的臨床應(yīng)用及推廣。

    食管癌的發(fā)生與促凋亡基因和抗凋亡基因的失衡有關(guān),其中Survivin 基因?qū)κ彻馨┰鲋澈偷蛲龅挠绊懹绕滹@著。Survivin 基因在胚胎組織、多種惡性腫瘤組織中廣泛表達,具有調(diào)節(jié)細胞周期、抑制細胞凋亡、調(diào)控腫瘤血管生成等作用。研究表明,Survivin在腫瘤組織高表達不僅與腫瘤發(fā)生有關(guān),而且與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移、生存期和復(fù)發(fā)有關(guān),抑制Survivin 基因表達能起到抑制腫瘤的作用。

    基于以上原因,本研究探討Survivin-siRNA 能否增強中藥夏枯草三萜類提取物對食管癌Eca-109 細胞增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)作用,從基因表達層面探究夏枯草抗食管癌作用機制。本研究結(jié)果顯示,夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin mRNA及Survivin 蛋白表達水平均低于空白對照組與陰性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞增殖抑制率、細胞凋亡率均高于空白對照組與陰性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin mRNA 及Survivin 蛋白表達水平均低于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞增殖抑制率、細胞凋亡率均高于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示Survivin 基因沉默與夏枯草三萜類提取物對食管癌Eca-109 細胞具有協(xié)同抑制效應(yīng),Survivin 基因沉默增加了夏枯草三萜類提取物抑制食管癌細胞增殖敏感性。夏枯草三萜類提取物聯(lián)合Survivin-siRNA 從理論上有望為臨床食管癌中藥及靶向治療提供新的思路和方案。推測夏枯草抗食管癌作用與抑制Survivin 基因表達密切相關(guān),具體機制有待于進一步研究。

    目前,有關(guān)Survivin-siRNA 聯(lián)合中藥夏枯草在食管癌治療中的研究較少,本研究只觀察了離體情況下中藥夏枯草三萜類提取物聯(lián)合Survivin-siRNA 對食管癌Eca-109 細胞的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)作用,今后尚需通過體內(nèi)動物實驗進一步驗證以Survivin 作為基因靶點聯(lián)合夏枯草提取物對在體食管癌的影響,以及二者聯(lián)合應(yīng)用作為治療食管癌策略的有效性及可行性,為夏枯草的抗腫瘤臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。

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