小亞璃眼蜱CPL截短基因的多克隆抗體制備及其應(yīng)用研究

翟雪潔，郝蘊(yùn)偉，阿力木江·加帕爾，宋瑞其，諾明達(dá)來(lái)，蔣 倩，何文文，鄭會(huì)珍，巴音查汗*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，新疆 石河子 832003）

硬蜱是一種可以通過(guò)吸食宿主血液傳播疾病的體外寄生蟲(chóng)。小亞璃眼蜱（Hyalomma anatolicum，H. anatolicum）屬于硬蜱科璃眼蜱屬，其幼蜱和若蜱主要寄生于嚙齒類(lèi)動(dòng)物，成蜱主要寄生于駱駝、牛、馬、羊等家畜。H.anatolicum在國(guó)外主要分布于印度、巴基斯坦、伊朗、蘇丹、以色列等地[1-2]，國(guó)內(nèi)僅在中國(guó)新疆有報(bào)道，其是新疆的優(yōu)勢(shì)蜱種[3-4]，其除傳播動(dòng)物梨形蟲(chóng)[5]，還可傳播克里米亞-剛果出血熱、立克次體病、萊姆病和森林腦炎等人畜共患病的病原[6-7]。防治蜱蟲(chóng)主要使用有機(jī)磷和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)化學(xué)藥物，但有研究顯示因?yàn)E用殺蟲(chóng)劑使得蜱蟲(chóng)對(duì)部分化學(xué)藥物產(chǎn)生了耐藥性，且耐藥性逐年增強(qiáng)[8-9]，而抗蜱疫苗可有效避免環(huán)境污染和蜱蟲(chóng)耐藥性的產(chǎn)生，因此篩選鑒定抗蜱疫苗候選分子就顯得尤為重要。

組織蛋白酶L（Cathepsin L，CPL）是木瓜蛋白酶家族中的半胱氨酸蛋白水解酶，有研究顯示CPL 在長(zhǎng)角血蜱（Haemaphysalis longicornis）和蓖子硬蜱（Ixo-des ricinus）中參與多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)等過(guò)程[10]，沉默CPL基因會(huì)影響H. longicornis中天冬氨酸蛋白酶（Longep-sin）、天冬酰胺內(nèi)肽酶（HlLgm-1 和HlLgm-2）和絲氨酸羧肽酶（HlSCP-1）等的表達(dá)，從而使雌蜱的飽血重量下降[11]，所以CPL 是具有研究?jī)r(jià)值的抗蜱疫苗候選分子[12-13]?；诖耍狙芯繉?duì)H. anatolicum的CPL 截短基因（HanCPL）進(jìn)行克隆，并使用原核、真核系統(tǒng)分別表達(dá)出了原核重組HanCPL 蛋白（rHanC-PL）和真核重組CPL 蛋白（EGFP-HanCPL）。利用western blot 對(duì)rHanCPL 和EGFP-HanCPL 鑒定，并通過(guò)免疫組化試驗(yàn)和間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）對(duì)CPL 定位，為后續(xù)基于rHanCPL 為候選抗原的抗小亞璃眼蜱的亞單位疫苗研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料新西蘭兔購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。H. anatolicum、pET-28a、pEGFP-C3載體和HEK-293T 細(xì)胞均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室提供；FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒、PCR 相關(guān)試劑、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；TRIzol 試劑、EcoR I、XhoI、T4 DNA連接酶、pMD19-T載體和DH5a感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自TaKaRa 公司；兔抗His tag、HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG H&L 購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Cy3 標(biāo)記羊抗兔IgG（H+L）購(gòu)自艾克索生物科技股份有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成利用Antibody Epitope Predic-tion（http://tools.immuneepitope.org/bcell/）對(duì)本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的H. anatolicum轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的CPL 基因序列進(jìn)行B 細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)，從中選取B 細(xì)胞抗原表位較多的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)的堿基序列，利用Prim-erPremier5.0 和Oligo 6.24 軟 件 設(shè) 計(jì)HanCPL 截 短 基 因擴(kuò)增引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 HanCPL截短基因擴(kuò)增的引物信息Table 1 HanCPL truncated gene prokaryotic and eukaryotic expression primer information

1.3 HanCPL 截短基因的PCR 擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建取吸血后第5 d 半飽血雌性H. anatolicum成蜱，用預(yù)冷PBS 清洗后放入無(wú)菌袋，置于液氮中研磨，利用TRIzol提取蜱蟲(chóng)總RNA，利用FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，采用引物Han-CPL-F1-EcoR I/Han-CPL-R1-XhoI 和Han-GFP-CPL-F1-XhoI/Han-GFP-CPL-R1-EcoR I，經(jīng)PCR 擴(kuò)增CPL 截短基因（HanCPL），擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序鑒定。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃4 min，94 ℃30 s、68 ℃/68.3 ℃30 s、72 ℃45 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物純化回收測(cè)序正確后分別連接至pET-28a、pEGFP-C3中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-HanCPL 和pEGFP-C3-HanCPL，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切（EcoR I/XhoI）鑒定正確后備用。

1.4 rHanCPL 表達(dá)及純化的檢測(cè)將重組質(zhì)粒pET-28a-HanCPL 轉(zhuǎn) 化 至BL21（DE3）感 受 態(tài) 細(xì) 胞 中，37 ℃180 r/min 培養(yǎng)至OD600nm為0.4～0.6 時(shí)加入終濃度0.8 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)6 h，收集菌體超聲破碎后，分別收集上清和沉淀，利用SDS-PAGE 檢測(cè)rHanCPL 的表達(dá)情況。利用His Trap 親和層析柱純化，再利用尿素透析法復(fù)性后，通過(guò)SDS-PAGE 分析rHanCPL 的純化情況；進(jìn)一步以兔抗His tag（1∶5 000）為一抗，HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG H&L（1∶10 000）為二抗，進(jìn)行western blot 鑒定，并采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度后置于-80 ℃保存。

1.5 rHanCPL多克隆抗體的制備及效價(jià)檢測(cè)將6只新西蘭兔隨機(jī)均分為2 組，取200 μg rHanCPL 與等體積氫氧化鋁佐劑乳化后，采用背部皮下多點(diǎn)注射免疫實(shí)驗(yàn)組兔，對(duì)照組兔注射等體積的PBS 混合氫氧化鋁佐劑，免疫后間隔14 d二次免疫。二免后14 d經(jīng)耳緣靜脈采血，分離血清制備rHanCPL 多克隆抗體。以制備的rHanCPL 多克隆抗體（1∶100）為一抗，HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG H&L（1∶10 000）為二抗，進(jìn)行western blot檢測(cè)。進(jìn)一步以純化的rHanCPL（2 μg/mL）為包被抗原，以2 倍倍比稀釋?zhuān)?∶200～1∶409 600）的rHanCPL多克隆抗體為一抗，同時(shí)以對(duì)照組兔血清作為陰性對(duì)照，以HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG H&L（1∶10 000）為二抗，采用間接ELISA 檢測(cè)rHanCPL 多克隆抗體效價(jià)。

1.6 天然CPL 蛋白在半飽血H. anatolicum組織中的定位檢測(cè) 將半飽血H. anatolicum雌蜱按常規(guī)方法制成石蠟切片，脫蠟后利用檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液修復(fù)抗原，然后置于3%過(guò)氧化氫溶液中阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，3% BSA 中封閉后，以制備的rHanC-PL 多克隆抗體（1∶500）為一抗， HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶1 000）為二抗，經(jīng)免疫組化（IHC）檢測(cè)半飽血H.anatolicum中天然CPL 蛋白的定位情況。

1.7 HEK-293T 細(xì)胞中EGFP-HanCPL 表達(dá)檢測(cè)將HEK-293T 鋪于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度達(dá)60%左右，使用lipofectamine2000 試劑分別將pEGFPC3 和pEGFP-C3-HanCPL 轉(zhuǎn)染至HEK-293T 細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h 后隨機(jī)收集各孔中的細(xì)胞，超聲破碎后，于4℃離心收集上清液，采用1.4 中的westen blot 方法檢測(cè)EGFP-HanCPL 蛋白與rHanCPL多克隆抗體的反應(yīng)原性，試驗(yàn)設(shè)轉(zhuǎn)入pEGFP-C3 的細(xì)胞裂解液作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)24 h 后使用4%多聚甲醛固定各組細(xì)胞，以制備的rHanCPL 多克隆抗體（1∶100）為一抗，以Cy3 標(biāo)記的羊抗兔IgG（H+L）（1∶400）為二抗，置于倒置熒光顯微鏡觀(guān)察，采用Adobe Photoshop 2020 進(jìn)行Merge 處理，經(jīng)IFA 檢測(cè)rHanCPL 多克隆抗體與真核表達(dá)EGFP-HanCPL 蛋白的反應(yīng)性及其在細(xì)胞中的定位。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達(dá)載體的鑒定結(jié)果PCR 擴(kuò)增HanCPL結(jié)果顯示，擴(kuò)增到約530 bp 的目的片段，與預(yù)期相符（圖略），經(jīng)測(cè)序比對(duì)，結(jié)果顯示其與小亞璃眼蜱源靶基因（KC707940）HanCPL 同源性99.60%，表明擴(kuò)增獲得HanCPL。構(gòu)建pET-28a-HanCPL 和pEGFPC3-HanCPL重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定插入基因片段大小均與預(yù)期一致（圖1），表明重組質(zhì)粒pET-28a-HanCPL和pEGFP-C3-HanCPL正確構(gòu)建。

圖1 pET-28a-HanCPL和pEGFP-C3-HanCPL的雙酶切鑒定Fig.1 Double enzymes digestion identification of pET-28a-HanCPL and pEGFP-C3-HanCPL

2.2 rHanCPL 表達(dá)、純化的檢測(cè)結(jié)果重組質(zhì)粒pET-28a-HanCPL 轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，采用IPTG 誘導(dǎo)rHanCPL 的表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE 后結(jié)果顯示，在27 ku 處出現(xiàn)與理論值相符的目的條帶，且rHanCPL 以包涵體形式表達(dá)，經(jīng)His Trap 親和層析柱純化后利用尿素透析法復(fù)性，得到了高純度的rHanCPL，濃度為3 mg/mL。經(jīng)western blot 分析結(jié)果顯示，rHanCPL 可以被兔抗His tag 抗體特異性識(shí)別，且表達(dá)蛋白大小與預(yù)期相符（圖2）。結(jié)果表明正確表達(dá)且得到了高純度rHanCPL。

圖2 rHanCPL表達(dá)及純化的鑒定結(jié)果Fig.2 The identification results of rHanCPL expression and purification

2.3 rHanCPL 多克隆抗體的制備及效價(jià)檢測(cè)結(jié)果經(jīng)western blot 分析制備的rHanCPL，結(jié)果顯示，rHanCPL 可以被制備的rHanCPL 多克隆抗體特異性識(shí)別，而對(duì)照組的兔血清不與rHanCPL 反應(yīng)，表明rHanCPL 具有較好的反應(yīng)原性（圖3A）。進(jìn)一步以純化的rHanCPL 為包被抗原，利用間接ELISA方法測(cè)定rHanCPL 多克隆抗體效價(jià)，結(jié)果顯示，rHanCPL 多克隆抗體OD450nm值/免疫PBS 血清OD450nm>2.1的最大稀釋倍數(shù)達(dá)1∶204 800（圖3B），可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 rHanCPL的western blot鑒定及多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定Fig.3 Western blot identificantion and determination of rHanCPL polyclonal antibody titer

2.4 天然CPL 蛋白在半飽血H. anatolicum組織中的定位檢測(cè)結(jié)果 半飽血H.anatolicum雌蜱組織經(jīng)IHC檢測(cè)結(jié)果顯示，染色反應(yīng)分布于中腸腸腔的中腸上皮細(xì)胞內(nèi)，并呈棕黃色或褐色（圖4，白色箭頭），細(xì)胞核呈藍(lán)色（圖4，黑色箭頭）。表明rHanCPL 多克隆抗體可以與H. anatolicum的CPL 天然蛋白發(fā)生反應(yīng)，且其定位于H.anatolicum的中腸上皮細(xì)胞。

圖4 H.anatolicum中腸組織中CPL蛋白定位的IHC結(jié)果（40×）Fig.4 Immunohistochemical results of H.anatolicum midgut tissue(40×)

2.5 EGFP-HanCPL 在細(xì)胞中表達(dá)及定位的檢測(cè)結(jié)果為了解真核表達(dá)的重組蛋白EGFP-HanCPL 在真核細(xì)胞中的表達(dá)和定位情況，收集分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-C3-HanCPL和空載體pEGFP-C3的HEK-293T細(xì)胞，western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，rHanCPL多克隆抗體可以識(shí)別EGFP-HanCPL蛋白，出現(xiàn)特異性條帶，并且空載體表達(dá)的EGFP蛋白無(wú)特異性條帶（圖5A）。IFA檢測(cè)結(jié)果顯示，EGFP蛋白呈綠色熒光，與rHanCPL多克隆抗體不發(fā)生反應(yīng)，DAPI染核后呈藍(lán)色熒光，兩者不完全重合；而表達(dá)的EGFP-HanCPL呈現(xiàn)的綠色熒光與標(biāo)記IgG 的Cy3 紅色熒光完全重合，與DAPI 染核后的藍(lán)色熒光不完全重合（圖5B）。上述結(jié)果表明EGFPHanCPL可以與rHanCPL 多克隆抗體特異性結(jié)合，并主要定位于細(xì)胞質(zhì)。

圖5 EGFP-HanCPL蛋白的western blot（A）和IFA（B）檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Western blot(A)and IFA(B)detection results of EGFP-HanCPL protein

3 討 論

硬蜱在飽血后很長(zhǎng)一段時(shí)間不進(jìn)食，在此期間，蜱蟲(chóng)通過(guò)消化所攝取的宿主血液為其提供生存、繁殖所必需的能量[14]，因此蜱類(lèi)的血餐消化系統(tǒng)是否正常運(yùn)行顯得非常重要。而蜱中腸中血紅蛋白的水解是由多種蛋白酶協(xié)同作用的結(jié)果[15]。已有研究發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等參與了硬蜱消化血液的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[16-18]。其中CPL 作為一種半胱氨酸蛋白酶則是參與宿主血液消化級(jí)聯(lián)反應(yīng)中一個(gè)重要的蛋白酶，抑制CPL 可能會(huì)影響蜱的吸血、消化血液能力，從而可以減少蜱蟲(chóng)種群規(guī)模，甚至降低蜱傳病的感染和傳播[11]。因此，本研究對(duì)新疆優(yōu)勢(shì)蜱種H.anatolicumCPL 的截短基因進(jìn)行了克隆，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-HanCPL 和pEGFP-C3-HanCPL。利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得高表達(dá)量的rHanCPL，使用純化后的rHanCPL 免疫新西蘭兔制備rHanCPL 多克隆抗體，在二免后14 d的兔血清效價(jià)高達(dá)1∶204 800，說(shuō)明rHanCPL進(jìn)入兔體后能夠有效刺激其免疫系統(tǒng)快速產(chǎn)生免疫應(yīng)答，證明rHanCPL 具有良好的免疫原性，并且經(jīng)western blot 鑒定，rHanC-PL 多克隆抗體可與rHanCPL 和EGFP-HanCPL 發(fā)生特異性反應(yīng)，證明rHanCPL 和EGFP-HanCPL 均具有良好的反應(yīng)原性。

研究發(fā)現(xiàn)，在I. ricinus中IrCL1 主要參考半飽血雌蜱的腸道血紅蛋白分解[19]，本研究利用rHanCPL 多克隆抗體通過(guò)IHC 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CPL 同樣存在于H.anato-licum半飽血雌蜱的中腸上皮細(xì)胞中，提示HanCPL可能在H. anatolicum雌蜱的血餐消化中起到重要作用。本研究進(jìn)一步將pEGFP-C3-HanCPL 轉(zhuǎn)染至HEK-293T 細(xì)胞，通過(guò)IFA 試驗(yàn)對(duì)EGFP-HanCPL 產(chǎn)生的熒光信號(hào)進(jìn)行分析，結(jié)果表明EGFP-HanCPL 主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，與前人在微小牛蜱（Rhipicephalus microplus）中對(duì)CPL 的定位結(jié)果一致[20]。

本研究克隆了CPL 截短基因，并利用原核、真核系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)，純化后制備rHanCPL多克隆抗體，應(yīng)用于IHC、IFA 和Western blot 檢測(cè)，證明了rHanCPL具有良好的抗原性，為進(jìn)一步分析rHanCPL作為H.anatolicum抗蜱疫苗提供參考依據(jù)，但rHanCPL在作為疫苗候選抗原的安全性以及rHanCPL 多克隆抗體的抗蜱保護(hù)效果方面還有待進(jìn)一步研究。