基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)的乳癖散結(jié)膠囊治療漿細(xì)胞性乳腺炎的潛在分子機(jī)制研究

徐政杰 方 堃 姜蘇曉 段麗娟 毛春花 張 萍

銀川市婦幼保健院外科，寧夏銀川 750001

漿細(xì)胞性乳腺炎（plasma cell mastitis，PCM）以乳腺導(dǎo)管阻塞、導(dǎo)管繼發(fā)性擴(kuò)張、肉芽組織增生、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主要病理學(xué)特征[1-3]。近年來，PCM 發(fā)病率逐漸增加，早期多以藥物治療為主[3-4]。PCM 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，明確的藥效靶點(diǎn)不多，臨床缺乏療效肯定的西藥。隨著治療模式的轉(zhuǎn)變和用藥經(jīng)驗(yàn)的積累，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到中醫(yī)藥治療PCM 的臨床價(jià)值，并進(jìn)行了諸多探索[5-7]。

中藥復(fù)方乳癖散結(jié)膠囊活血化瘀、通絡(luò)止痛、清熱解毒，廣泛用于乳腺增生等的治療[8-10]，且可調(diào)節(jié)激素水平[11]，治療PCM 具有較高價(jià)值。但該復(fù)方所含有效成分復(fù)雜，治療PCM 的相關(guān)機(jī)制尚未明晰。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)運(yùn)用生物分子網(wǎng)絡(luò)方法分析藥物與疾病和靶點(diǎn)之間“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”協(xié)同作用關(guān)系的藥理學(xué)分支，與中醫(yī)藥治療復(fù)雜疾病的原則一致[12-13]。本文采用該法探討乳癖散結(jié)膠囊治療PCM 的潛在化學(xué)成分及可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 預(yù)測(cè)藥物有效成分篩選及靶點(diǎn)

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）和中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具（bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMANTCM）檢索夏枯草、川芎、鱉甲、僵蠶、玫瑰花、赤芍、柴胡、當(dāng)歸、莪術(shù)、牡蠣、延胡索的化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度≥30%、化合物類藥性≥0.18 篩選活性成分，收集相應(yīng)靶點(diǎn)；通過通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（universal protein database，Uniprot）對(duì)已篩選的靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，轉(zhuǎn)化為基因名稱。

1.2 預(yù)測(cè)漿細(xì)胞性乳腺炎治療靶點(diǎn)

通過在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（online mendelian inheritance in man，OMIM）和GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索PCM 相關(guān)的治療靶點(diǎn)，匯總、去重后獲得。

1.3 乳癖散結(jié)膠囊治療PCM 的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

運(yùn)用Draw Venny Diagram 在線軟件，取PCM 治療靶點(diǎn)與“1.1”收集到的靶點(diǎn)取交集后獲得。

1.4 構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

運(yùn)用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用STRING 數(shù)據(jù)庫，設(shè)置信度為0.4，篩選乳癖散結(jié)膠囊治療PCM 靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系；提取關(guān)鍵基因連接度蛋白統(tǒng)計(jì)條圖（選取排序前30 的），根據(jù)度值的排序確定核心靶點(diǎn)。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）分子功能和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

利用R 語言3.6.1 進(jìn)行GO 富集分析，獲得條圖（只展示前20 條）；進(jìn)行KEGG 富集分析，獲得條圖（只展示前20 條）。

1.7 分子對(duì)接

通過TCMSP 及PubChem 數(shù)據(jù)庫得到乳癖散結(jié)膠囊成分的3D 結(jié)構(gòu)信息，通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫下載靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，Autodock Tool 4.0 軟件對(duì)小分子和靶蛋白進(jìn)行加氫、去電荷等處理，借助PyMOL 2.3.4 軟件插件找到對(duì)接活性位點(diǎn)，Autodock Vina 1.1.2 軟件處理后的成分與靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，通過PyMOL 2.3.4 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化[14]。

2 結(jié)果

2.1 乳癖散結(jié)膠囊有效成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

TCMSP 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)乳癖散結(jié)膠囊11 種有效成分中的40 個(gè)藥效成分，共得到321 個(gè)靶點(diǎn)；OMIM 和GeneCards 數(shù)據(jù)庫得到PCM 的治療靶點(diǎn)498 個(gè)，取交集得到36 個(gè)乳癖散結(jié)膠囊治療PCM 的靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 乳癖散結(jié)膠囊治療PCM 靶點(diǎn)篩選

2.2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

運(yùn)用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)”。見圖2。

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

通過STRING 數(shù)據(jù)庫分析得到227 對(duì)蛋白互作關(guān)系，涉及36 個(gè)蛋白靶點(diǎn)，見圖3。提取排名前30 的關(guān)鍵基因連接度蛋白統(tǒng)計(jì)條圖，見圖4，其中白介素-6（interleukin-6，IL-6）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EFGR）、白蛋白（albumin，ALB）、IL-1B、B 淋巴細(xì)胞瘤-2L1（B-cell lymphoma 2L1、BCL2L1）、趨化因子（C-C 基元）配體2[chemokine（C-C motif）ligand 2，CCL2]、過氧化氫酶（catalase，CAT）的度值排名較靠前。

圖3 乳癖散結(jié)膠囊治療漿細(xì)胞性乳腺炎靶點(diǎn)間蛋白互作關(guān)系

圖4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度值排序

2.4 KEGG 與GO 富集分析

對(duì)上述36 個(gè)潛在靶點(diǎn)基因的KEGG 通路富集分析表明，P 值排名前20 的通路主要涉及核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、IL-17、Toll 樣受體、T 輔助細(xì)胞17（T helper cells 17，Th17）分化、絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等信號(hào)通路。GO 富集分析提示，乳癖散結(jié)膠囊治療PCM 所調(diào)控的分子功能主要涉及調(diào)控細(xì)胞因子、抗氧化、蛋白磷酸酶結(jié)合、跨膜受體蛋白激酶、細(xì)胞因子受體結(jié)合等方面。見圖5～6。

圖5 乳癖散結(jié)膠囊治療PCM 的潛在靶點(diǎn)KEGG 通路富集

2.5 分子對(duì)接

選取“2.3”中乳癖散結(jié)膠囊核心成分自由度>10的有效成分，分別進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，顯示與BAX、BCL2、PGR 具有最強(qiáng)結(jié)合能力的分別為luteolin（-8.2 kcal/mol）、Quercetin 和luteolin（-7.3 kcal/mol）、luteolin（9.5 kcal/mol）（圖7）。據(jù)此推測(cè)乳癖散結(jié)膠囊的活性成分通過影響乳腺導(dǎo)管上皮凋亡及孕激素受體調(diào)節(jié)等發(fā)揮對(duì)PCM的治療作用。

圖6 乳癖散結(jié)膠囊治療PCM 的潛在靶點(diǎn)的GO 通路富集

圖7 乳癖散結(jié)膠囊核心成分治療PCM 的分子對(duì)接圖

3 討論

中醫(yī)臨床上內(nèi)治PCM，以疏郁散結(jié)為本，清熱解毒為輔[15]。乳癖散結(jié)膠囊由柴胡、當(dāng)歸、川芎、鱉甲等藥物組成，功能軟堅(jiān)散結(jié)、行氣活血[10]。本研究篩選40 個(gè)藥效成分，共預(yù)測(cè)321 個(gè)藥效靶點(diǎn)和498 個(gè)PCM的潛在治療靶點(diǎn)。本研究提示，IL-6、EFGR、ALB、IL-1B、BCL2L1、CCL2、CAT 為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)。藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)表明，PCM治療靶點(diǎn)較多，且靶點(diǎn)間存在著復(fù)雜作用關(guān)系，推測(cè)復(fù)方有效成分間存在協(xié)同關(guān)系。

GO 富集分析顯示，上述靶點(diǎn)基因通過調(diào)控細(xì)胞因子活性、抗氧化活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、跨膜受體蛋白激酶活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等發(fā)揮治療PCM的潛在作用。目前，認(rèn)為PCM 發(fā)病與自身免疫有關(guān)，乳房外傷、炎癥、哺乳障礙、內(nèi)分泌失調(diào)等引起乳腺導(dǎo)管引流不暢，管腔纖維組織增生，周圍組織抗原反應(yīng)、漿細(xì)胞浸潤(rùn)[16-18]。付嘉等[19]證實(shí)PCM 患者外周血中調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞CD4+CD25+CD127-Treg 明顯下降。張少波等[20]發(fā)現(xiàn)PCM 的發(fā)生、發(fā)展與Th17 細(xì)胞功能紊亂及重新分布有關(guān)。孫厚啟[21]證實(shí)，PCM 患者機(jī)體細(xì)胞因子IL-2 處于優(yōu)勢(shì)狀態(tài)，而IL-4 處于劣勢(shì)狀態(tài)，這些研究都提示細(xì)胞因子活性在PCM 損傷中所發(fā)揮的重要作用。乳癖散結(jié)膠囊的36 個(gè)潛在靶點(diǎn)具有調(diào)控細(xì)胞因子活性的作用，其核心靶點(diǎn)中IL-6 已被證實(shí)為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（transcriptional activa tor，STAT3）的有效激活劑，PCM 患者IL-6 顯著高表達(dá)，且IL-6/STAT3 信號(hào)通路被激活[22-23]，提示乳癖散結(jié)膠囊可能通過調(diào)控IL-6 來發(fā)揮對(duì)PCM 的抗炎治療作用。

KEGG 通路富集分析顯示，乳癖散結(jié)膠囊發(fā)揮作用與多條信號(hào)通路有關(guān)，主要涉及NF-κB、IL-17、Toll 樣受體、MAPK 等信號(hào)通路。NF-κB 通路可能是促進(jìn)漿細(xì)胞性乳腺炎炎癥損傷的因素之一，反過來可能會(huì)觸發(fā)炎癥反應(yīng)并在乳房中形成肉芽腫[24-25]。分析潛在治療靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)NF-κB 為顯著富集通路，提示乳癖散結(jié)膠囊通過作用于NF-κB 通路進(jìn)行PCM 治療的潛在性。需指出的是，由于篩選條件的限制，本文僅分析了乳癖散結(jié)膠囊中說明書所公布的主要化合物，因此研究結(jié)果可能具有一定局限性。