基于LC-MS積雪草不同部位中化學(xué)成分分析*

李嬌珍，孫正海，蔡起航，丁慕溪，房佳茹，王坤

(1.西南林業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院,云南 昆明 650224;2.云南省面向南亞東南亞經(jīng)濟林全產(chǎn)業(yè)鏈聯(lián)合研發(fā)中心,云南 昆明 650224;3.云南省高效經(jīng)濟林培育示范型國際科技合作基地,云南 昆明 650224)

積雪草(Centellaasiatic(L.)Urban)為傘形科積雪草屬多年生草本植物，別名雷公根、馬蹄草、錢齒草、打的落、十八缺、半邊錢、崩大碗等，其廣泛分布于南北半球熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國主要分布在長江以南的華南、華東、中南及西南地區(qū)[1]。在古代積雪草就已經(jīng)被收載為常用中藥，最早出現(xiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味苦、辛，寒，歸肝、脾、腎經(jīng)，具有清熱利濕、解毒消腫的作用，用于濕熱黃疸、中暑腹瀉、石淋血淋、癰腫瘡毒、跌打損傷等[1-2]。在現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)中研究發(fā)現(xiàn)，積雪草還有抗抑郁、抗腫瘤、保護神經(jīng)系統(tǒng)以及免疫調(diào)節(jié)作用[3]。積雪草應(yīng)用形式多樣，除作藥用外也廣泛被食用，有國外學(xué)者利用積雪草的植物提取物開發(fā)功能性飲料[4]，在我國以干燥葉片入茶，多用于涼茶，在東南亞一些國家新鮮葉可作蔬菜或果汁[5]；此外，基于其抑制瘢痕增生及修復(fù)皮膚損傷的作用，已經(jīng)被大量用于美容，因此逐漸成為重要的商業(yè)產(chǎn)品。

積雪草作為藥食同源植物一直廣受關(guān)注，目前國內(nèi)外的研究者們對積雪草的主要化學(xué)成分及提取方法、藥理作用及其作用機制進行廣泛而深入的研究。對積雪草化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分主要包括三萜類、多炔烯烴類、黃酮類和揮發(fā)油類等[6-7]。近幾年來相關(guān)學(xué)者關(guān)于積雪草的化學(xué)物質(zhì)有新的發(fā)現(xiàn)，徐曉衛(wèi)等[8]通過氣相色譜-質(zhì)譜法研究積雪草全草揮發(fā)油的化學(xué)成分共鑒定出 57種化合物；張偉等[9]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HS-SPME-GC-MS)，從積雪草中鑒定出16種揮發(fā)性成分；馬燦等[10]以積雪草酸結(jié)構(gòu)為母核，經(jīng)乙?；?、水解等反應(yīng)合成一個新的未見報道的積雪草酸所對應(yīng)的苷酯；Bo Ren等[11]在2021年從積雪草全草中分離得到2種未被描述的烏拉烷型三萜皂苷，分別命名為積雪草苷H 和積雪草苷I；2022年有學(xué)者在探索積雪草全草的生物活性化合物時，發(fā)現(xiàn)兩種新的黃酮醇衍生物[12]。在化學(xué)物質(zhì)含量方面的研究中張小剛[13]測定了14種不同居群積雪草主要成分積雪草苷的含量，發(fā)現(xiàn)不同來源積雪草之間化學(xué)成分有較大的的差異；王青等[6]在2014年測定了不同產(chǎn)地積雪草中積雪草苷和羥基積雪草苷，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地含量差別較大；閆凱等[14]在2017年建立超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜( UPLC-MS/MS)同時測定積雪草中 7 種有效成分的含量；張培培等[15]比較研究中國和印尼積雪草藥材化學(xué)成分的差異，發(fā)現(xiàn)來源于中國的積雪草藥材中積雪草苷含量較高，而印尼積雪草藥材中積雪草苷含量較低；2020年有國外學(xué)者對積雪草葉粉化學(xué)及元素成分進行評價[16]，目前未見對積雪草不同部位中的化學(xué)物質(zhì)進行報道。本研究以積雪草的根、莖和葉3個不同組織部位作為研究對象，利用非靶向代謝組學(xué)液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)對積雪草不同部位中的化學(xué)成分進行檢測，以期為后續(xù)其藥理學(xué)研究及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

Vanquish液相色譜儀 (Thermo賽默飛世爾科技公司)，Q Exactive型質(zhì)譜儀(Thermo賽默飛世爾科技公司)，高速冷凍離心機(H1850-R，湖南湘儀實驗設(shè)備有限公司)，混勻儀( BE-96，海門麒麟貝爾實驗室儀器有限公司)，超聲波清洗機(KW- 100TDV，昆山舒美實驗設(shè)備有限公司)，組織研磨機(MB-96，浙江美碧實驗設(shè)備有限公司)，濾膜(0.22 μm PTFE，天津金騰實驗設(shè)備有限公司)，玻璃珠(G8772-500G，Sigma)。

甲醇(LC-MS級)、乙腈(LC-MS級)購自賽默飛世爾科技公司，2-氯-L-苯丙氨酸購自上海阿拉丁生化科技公司，甲酸購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司、甲酸銨購自默克公司、H2O使用Milli-Q系統(tǒng)產(chǎn)生超純水(密理博)。

1.1.2 試驗材料

試驗材料積雪草于2021年11月采于云南省楚雄州元謀縣(海拔1 035.1 m，102.41°E、25.54°N)的自然野生種，經(jīng)過專家鑒定為積雪草。取積雪草的根、莖和葉各3個生物學(xué)重復(fù)用于后續(xù)試驗。

1.2 方法

樣品提取 精確稱量適量樣本于2 mL離心管中，加入600 μL甲醇〔含2-氯-L-苯丙氨酸(4 μmol/L)(-20 ℃保存)〕，渦旋振蕩30 s；加入100 mg玻璃珠，放入組織研磨器中，60 Hz研磨90 s；室溫超聲15 min；12 000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清液過0.22 μm膜過濾，過濾液加入到檢測瓶中，用于LC-MS檢測。

色譜條件 ThermoVanquish(ThermoFisherScientific,USA)超高效液相系統(tǒng)，使用ACQUITYUPLCHSST3(2.1×150 mm,1.8 μm)(Waters,Milford,MA,USA)色譜柱，0.25 mL/min的流速，40 ℃的柱溫，進樣量2 μL。正離子模式，流動相為0.1%甲酸乙腈(C)和0.1%甲酸水(D)，梯度洗脫程序為：0～1 min，2%C；1～9 min，2%～50%C；9～12 min，50%～98%C；12～13.5 min，98%C；13.5～14 min，98%～2%C；14～20 min，2%C。負離子模式，流動相為乙腈(A)和5 mM甲酸銨水(B)，梯度洗脫程序為：0～1 min，2%A；1～9 min，2%～50%A；9～12 min，50%～98%A；12～13.5 min，98%A；13.5～14 min，98%～2%A；14～17 min，2%A。

質(zhì)譜條件 ThermoQExactive質(zhì)譜檢測器(ThermoFisherScientific,USA)，電噴霧離子源(ESI)，正負離子模式分別采集數(shù)據(jù)。正離子噴霧電壓為3.50 kV，負離子噴霧電壓為-2.50 kV，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb。毛細管溫度325 ℃，以分辨率70 000進行一級全掃描，一級離子掃描范圍81～1 000 m/z，并采用HCD進行二級裂解，碰撞電壓為30%，二級分辨率為17 500，采集信號前10離子進行碎裂，同時采用動態(tài)排除去除無必要的MS/MS信息[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 積雪草代謝產(chǎn)物分析

選取積雪草葉片、莖和根3組，設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)共9個樣品，進行代謝組分析，基于LC-MS非靶向檢測共檢測出440種代謝物質(zhì)。其中氨基酸及其衍生物、生物堿、類脂化合物、糖與苷類以及萜類等5類代謝產(chǎn)物在積雪草代謝物質(zhì)中所占比例最高，均達到10%以上，分別有60種、54種、52種、50種和49種，還檢測到有機酸21種，甾族化合物15種，黃酮類12種，此外還有極少數(shù)的簡單苯丙素類、維生素及木質(zhì)素、香豆素和揮發(fā)油類物質(zhì)，不同類型代謝物質(zhì)相對所占比例見圖1。

圖1 積雪草中不同類型的代謝產(chǎn)物及其相對占比

對相同種類代謝產(chǎn)物在積雪草不同部位中的相對含量分析發(fā)現(xiàn)，萜類和黃酮類物質(zhì)在葉片中含量明顯高于莖部和根部；氨基酸及其衍生物、生物堿類、類脂化合物、糖與苷類、酚類及酚酸類以及有機酸類物質(zhì)的相對含量都是根部高于莖部和葉部；揮發(fā)油類物質(zhì)在莖和根中的相對含量顯著高于葉部；其余代謝物質(zhì)(核苷酸及其衍生物、甾族化合物、簡單苯丙素類、維生素及木質(zhì)素、香豆素及揮發(fā)油)在葉片、莖部和根部的含量都差別不大(表1)。

表1 積雪草葉片、莖和根中代謝產(chǎn)物具體成分、數(shù)量及含量的平均值

2.2 有效成分分析

根據(jù)檢測結(jié)果，代謝產(chǎn)物中積雪草有效成分被檢測出的有α-香樹脂醇型三萜皂苷類積雪草苷和α-香樹脂醇型三萜酸類積雪草酸2種物質(zhì)。對積雪草葉片、莖和根中的相對含量分析表明，積雪草苷和積雪草酸均在其葉片中含量最高，根中含量最低；其中積雪草苷在葉片中的含量顯著高于莖部和根部，而積雪草酸在葉片和莖中顯著高于其根部；此外由表2可知在積雪草的不同部位中積雪草酸的相對含量均明顯高于積雪草苷。

表2 積雪草中積雪草苷和積雪草酸不同部位相對含量

2.3 黃酮類成分分析

在此次LC-MS非靶向檢測中，從積雪草根、莖和葉中共檢測出12種黃酮類物質(zhì)(表3)，其中有6種屬于黃酮，3種屬于黃酮醇，還有異黃酮、二氫黃酮以及二氫查爾酮各1種。進一步對12種黃酮類代謝產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)，山奈酚、牡荊素和木犀草素在積雪草葉片中的相對含量極顯著高于根部和莖部，其中以山奈酚的相對含量最高，牡荊素次之；橙皮素、黃芩素、根皮苷、黃芪苷在積雪草三個部位的總體相對含量較低，其中以黃芩素和根皮苷最低；桔皮素在其莖中相對含量較高，而根和葉中相對含量接近，但總體含量也相對較低；漆樹黃酮、川陳皮素、槲皮素、染料木素在積雪草根、莖和葉中的相對含量接近(圖2)。

表3 積雪草中黃酮類成分不同部位相對含量

圖2 積雪草中黃酮類物質(zhì)在不同部位的相對含量

3 討論與結(jié)論

積雪草在我國多個地區(qū)廣泛分布，其在中草藥應(yīng)用方面全株入藥，因此在采藥時會將整株植株挖掉，這是對植物資源和生態(tài)環(huán)境的極大破壞。本研究采集云南省野生積雪草植株的葉片、莖和根，利用LC-MS對其進行非靶向代謝組檢測，分析其不同部位代謝物質(zhì)的種類及其相對含量，并對積雪草中2種重要的有效成分(積雪草苷及積雪草酸)和黃酮類成分在根、莖和葉中的相對含量進行分析。

積雪草苷和積雪草酸是積雪草中其非常重要的兩種主要成分，它們的主要功效也非常相似，其中積雪草苷能夠有效抑制腫瘤細胞擴散，在治療惡性腫瘤方面具有積極治療作用，同時也因為其對于創(chuàng)面愈合有一定作用，可預(yù)防緩解人類的皮膚創(chuàng)傷和潰瘍，更能減少皮膚結(jié)核和麻風病發(fā)生[18]；積雪草酸對皮膚潰瘍、疤痕疙瘩、局限性硬皮病、萎縮性硬化性苔蘚等一些皮膚病具有較好的治療效果[19]，此外還具有降血脂及保護肝臟的作用[20]。在本研究中積雪草的兩種主要有效成分在3個不同部位中，積雪草酸的相對含量都顯著高于積雪草苷，且兩種物質(zhì)都是在其葉片中最高，莖部次之，根部最低。綜上所述，在后續(xù)對積雪草的應(yīng)用中，若僅需要積雪草苷或積雪草酸時只需采摘其葉片而將根部保留讓其繼續(xù)生長，這樣既可以保證積雪草的藥用價值也可以保護植物資源和生態(tài)環(huán)境。

積雪草所含化學(xué)成分多樣，其中黃酮類化合物作為植物次級代謝產(chǎn)物之一，不僅在植物生長發(fā)育過程中具有重要作用，而且具有顯著的藥理活性，如二氫黃酮類化合物柚皮素(naringenin)具有抗炎、抗癌活性[5]；黃酮醇類化合物山奈酚(kaempferol)具有抗焦慮、抗過敏活性[21]；異黃酮類化合物染料木素(genistein)對前列腺癌、乳腺癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用等[22]。在前人的研究中發(fā)現(xiàn)積雪草中含有多種黃酮類物質(zhì)，但是未見有研究者對其不同部位中的黃酮類化合物進行研究，本研究通過LC-MS在積雪草中檢測出5類共12種黃酮類化合物，這些黃酮類物質(zhì)的總含量及其在積雪草不同部位中的相對含量均有所差異，相較于已經(jīng)報道關(guān)于積雪草化學(xué)物質(zhì)的相關(guān)文獻，本研究弄清黃酮類物質(zhì)在積雪草不同部位的相對含量，豐富了積雪草中黃酮類化合物的研究，為后續(xù)研究積雪草中黃酮類化合物的藥用價值和產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

本試驗研究結(jié)果表明：在積雪草中各類代謝物質(zhì)的數(shù)量有所差異，并且在不同部位中各類化學(xué)成分的相對含量也具有一定差異。該結(jié)果與李文芳等[23]對獨根草不同部位幾種化學(xué)成分的分析及張少平等[24]在對馬齒莧根莖葉中類黃酮代謝的研究結(jié)果相似，證明此研究結(jié)果具有一定的科學(xué)性。在不同部位代謝物質(zhì)含量有所差異可能與植物各器官自身的代謝活動以及相關(guān)次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運、儲藏存在差異有關(guān)，也可能是因為各部位的初生代謝產(chǎn)物含量差異較大，導(dǎo)致各類次生代謝產(chǎn)物的相對含量不同。