丹皮酚對5-FU誘導(dǎo)的小鼠腸道黏膜損傷的保護作用及對其抗腫瘤活性的影響*

韓成龍 李蘇陽 韓雅萌

(1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230000；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，安徽 蚌埠 233030)

5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)是治療胃腸道癌、乳腺癌、肺癌等多種癌癥最常用的抗腫瘤藥物[1]。臨床上5-FU的劑量通常為10～20 mg/kg，藥效可持續(xù)5～10 d[2]。然而，5-FU可引起一系列副作用，這其中就包括腸道功能損傷。據(jù)報道，大約80%接受化療的癌癥患者會發(fā)生腸黏膜炎[3]。丹皮酚是從毛茛科植物牡丹的根皮中提取出來的活性成分。丹皮酚具有鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱、抗氧化及保護心腦血管等廣泛的藥理活性[4]。研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可增強化療藥物對肝癌和結(jié)腸癌的抑制作用[5-6]，然而丹皮酚對化療過程中腸黏膜的保護作用并不清楚。本實驗通過腹腔注射5-FU建立小鼠腸黏膜炎模型，研究丹皮酚對小鼠腸道黏膜損傷的保護作用及對其抗腫瘤活性的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SD成年雄性C57BL/6J小鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，飼養(yǎng)在SPF級動物房內(nèi)，室溫(23.00±1.00)℃，晝夜循環(huán)12 h。丹皮酚購自安徽宣城百草植物工貿(mào)有限公司，純度>98%(批號:N0980)。5-FU購自天津金耀氨基酸有限公司(批號:1803091)。本研究通過動物倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 分組 小鼠隨機分為對照組(Con組，12只)、5-FU注射組(5-FU組，12只)、丹皮酚25 mg/kg組(5-FU +Pae 25 mg/kg組，13只)、丹皮酚100 mg/kg組(5-FU+Pae 100 mg/kg組，13只)。小鼠均在在飼養(yǎng)環(huán)境下適應(yīng)一周。5-FU以及5-FU+ Pae組小鼠每天腹腔注射 5-FU(50 mg/kg)一次，連續(xù)6 d，Con組注射等體積生理鹽水。Pae組小鼠每天灌胃給予對應(yīng)濃度丹皮酚，每天兩次，連續(xù)6 d，Con組和5-FU組小鼠每天灌胃等體積生理鹽水。7 d后小鼠經(jīng)過量麻醉處死進行相應(yīng)組織或生化檢測。

1.3 成瘤實驗 所有小鼠在接受藥物注射前接受皮下注射結(jié)腸癌細胞(人結(jié)腸癌細胞株 LS174T 購于中國科學(xué)院生物研究所)。取對數(shù)生長期結(jié)腸癌細胞，制成細胞懸液，隨后接種在小鼠腹股溝處。小鼠在第二天接受5-FU注射或丹皮酚治療。實驗接受后過量麻醉處死小鼠，取腫瘤組織稱重。

1.4 HE染色觀察小鼠腸道形態(tài) 小鼠過量乙醚麻醉后快速打開腹腔，暴露出腸道。去小鼠腸道組織后，生理鹽水沖洗并快速固定于4%福爾馬林緩沖液中，24 h后進行石蠟包埋處理。用切片機制作4 μm厚度小腸組織切片，HE染色觀察小腸絨毛形態(tài)學(xué)變化情況。

1.5 免疫組化染色觀察小鼠小腸腺細胞 小腸組織切片通過二甲苯中脫石蠟后浸泡乙醇水化，隨后100℃煮沸1 h。切片在H2O2處理45 min以分解內(nèi)源性過氧化物酶。PBS洗滌后，切片以10%山羊血清37℃下封閉1 h。隨后加入一抗(鼠抗anti-TUNEL 1∶500，鼠抗anti-Cleaved caspase-3 1∶500)(Sigma，美國，A0835)37℃孵育2 h后4℃過夜。第二天切片用二抗(1∶200)(Sigma，美國，A2268)37℃孵育1 h，DAB顯色。隨機選取3個視野，采用Image J軟件統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚對5-FU注射后小鼠體重的影響 實驗結(jié)果顯示，相比于Con組，在5-FU注射后第3天、第6天和第9天小鼠體重顯著降低(P<0.001)。而相比于僅接受5-FU注射的小鼠，丹皮酚可顯著增加小鼠5-FU注射后體重，在100 mg/kg(P<0.001)濃度下效果最為明顯。見圖1。

圖1 丹皮酚對5-FU注射后小鼠體重的影響

2.2 丹皮酚對5-FU注射后小鼠腸道形態(tài)學(xué)變化及小腸絨毛高度的影響 HE染色結(jié)果顯示，Con組小鼠腸道無水腫或充血，5-FU注射后小鼠腸道被嚴(yán)重破壞，并伴有明顯的水腫和充血。而丹皮酚分別處理25、100 mg/kg可明顯改善腸道情況，在100 mg/kg時未觀察到明顯的水腫或出血(圖2A)；5-FU注射后小鼠小腸絨毛高度明顯降低(圖2B)，小腸腺數(shù)量明顯下降(圖2C)，而丹皮酚可顯著逆轉(zhuǎn)5-FU注射小鼠小腸絨毛的形態(tài)變化，使小腸絨毛升高并增加小腸腺數(shù)量。

圖2 丹皮酚對5-FU注射后小鼠腸道形態(tài)學(xué)變化影響

2.3 丹皮酚對5-FU注射后小鼠小腸腺細胞凋亡的影響 實驗結(jié)果顯示，5-FU注射后小鼠小腸腺中TUNEL和Cleaved caspase-3染色程度明顯加重，說明細胞凋亡程度上升。而丹皮酚在25 mg/kg(P<0.05)和100 mg/kg(P<0.01)處理后可顯著降低 TUNEL和Cleaved caspase-3在小腸腺的表達，見圖3。因此，丹皮酚可顯著降低5-FU引起的小腸腺細胞凋亡。

圖3 丹皮酚對5-FU注射后小鼠小腸腺細胞凋亡的影響

2.4 丹皮酚對5-FU抗腫瘤的影響 與Con、5-FU組相比，5-FU+100 mg/kg丹皮酚組腫瘤顯著縮小，見圖4。這提示5-FU可顯著抑制瘤體生長。

圖4 丹皮酚對5-FU抗腫瘤的影響

3 討論

5-FU是臨床常用的化療藥物，其口服吸收率較低，臨床主要采取靜脈注射。然而5-FU可導(dǎo)致腸道損傷，主要表現(xiàn)為腸屏障功能破壞，小腸腺細胞凋亡，腸細胞增殖減少[7]。因此尋找對抗5-FU對腸道功能破壞的藥物至關(guān)重要。丹皮酚是一種具有多種臨床療效的中藥成分，其在加強化療藥物抗腫瘤活性方面的作用受到越來越多的關(guān)注[5,8]。但關(guān)于丹皮酚對5-FU誘導(dǎo)的腸道黏膜損傷的保護作用尚未有報道，鑒于此，本實驗主要集中在丹皮酚對5-FU誘導(dǎo)腸黏膜損傷的保護作用。

小腸是哺乳動物消化吸收的主要器官，其功能受損后直接影響能量來源，導(dǎo)致體重下降[9]。因此我們首先研究了丹皮酚對5-FU注射后小鼠體重變化的影響。結(jié)果顯示，在注射5-FU 9天后，小鼠體重顯著降低，而丹皮酚處理后可恢復(fù)小鼠體重，說明丹皮酚對5-FU引起的小腸損傷可能具有一定的保護作用。既往研究報道顯示小腸管壁結(jié)構(gòu)特點是管壁有環(huán)形皺襞，黏膜有許多絨毛[10]，這些環(huán)狀皺襞和絨毛擴大了黏膜的表面積，黏膜下層中有由表層上皮下陷形成的腸腺，開口于黏膜表面，分泌腸液，絨毛和小腸腺與小腸的消化和吸收功能關(guān)系密切[11-12]。由于5-FU對DNA損傷及細胞毒性作用，在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的同時，也誘導(dǎo)正常細胞凋亡，改變其生物學(xué)特性，并誘導(dǎo)正常細胞或腫瘤細胞產(chǎn)生大量炎癥因子或氧化因子，進而損傷包括腸上皮細胞在內(nèi)的細胞損傷[13-14]。因此我們觀察了丹皮酚對小鼠腸道形態(tài)以及組織學(xué)變化的影響。結(jié)果顯示，丹皮酚可明顯降低小腸水腫程度或出血，并使小腸絨毛升高，增加小腸腺數(shù)量。小腸腺主要由柱狀細胞、杯狀細胞和潘氏細胞構(gòu)成，起著合成和釋放消化酶的作用[15]。研究表明5-FU引起的腸損傷通常伴有小腸腺細胞的凋亡[16]。因此隨后我們通過免疫組化實驗研究了丹皮酚對小腸腺細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，丹皮酚可顯著降低小腸腺細胞凋亡程度。說明丹皮酚對5-FU引起的小腸損傷具有保護作用。

丹皮酚具有廣泛的藥理特性[17]，其中包括抗腫瘤特性[18]，如抗卵巢癌[19]、乳腺癌[20]、肝癌[21]、膀胱癌[22]等，抗腫瘤機制主要包括抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、促進抑癌基因表達、增強機體免疫力、阻滯細胞周期等[23]。本研究通過成瘤實驗研究了丹皮酚對5-FU抗腫瘤活性的影響，發(fā)現(xiàn)丹皮酚對結(jié)腸癌細胞具有抑制作用，并且可增強5-FU抗腫瘤特性。

4 結(jié)論與啟示

本研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚可通過抑制小腸腺細胞凋亡降低5-FU對小鼠黏膜損傷的影響，并可增強其抗腫瘤活性，為對抗5-FU損傷腸道的副作用提供了新的干預(yù)手段，但具體作用機制仍需進一步研究加以驗證。